Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lý hóa lên hoạt tính

5. Ý nghĩa khoa học thực tiễn của luận án

2.3.2.8. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lý hóa lên hoạt tính

của endoglucanase tự nhiên và tái tổ hợp

Động học của phản ứng enzyme

Để xác định ảnh hưởng của nồng độ cơ chất, enzyme tinh sạch được phản ứng với cơ chất CMC và cơ chất barley β-glucan. Động học cơ chất của enzyme đối với cơ chất CMC và -glucan được xác định qua hằng số Michaelis-Menten, Km, và vận tốc phẩn ứng tối đa Vmax [4].

Nguyên tắc: Để xác định hằng số Km dựa vào phương trình Lineweaver Burk:

  max max 0 1 1 1 V S V K v m         Trong đó:

Đường biểu diễn cắt trục tung ở điểm 1/Vmax và cắt trục hoành ở điểm - 1/Km. Từ đó có thể tính được các giá trị Vmax, Km.

Nhiệt độ và pH tối ưu

Nhiệt độ và pH tối ưu của cellulase tự nhiên và rmEglA được xác định bằng cách đo hoạt tính enzyme theo phương pháp đã mô tả ở trên sử dụng đệm acetate 100 mM (pH 3,0-5,5) và đệm phosphate 100 mM (pH 5,5-8,0), nhiệt độ thay đổi trong khoảng 30-85C tại pH 5 và pH thay đổi từ 3,0-8,0 ở 37C.

Độ bền nhiệt và độ bền pH

Để đánh giá độ bền nhiệt và độ bền pH của cellulase tự nhiên và cellulase tái tổ hợp, dịch enzyme đã tinh sạch (0,53 g cho mỗi phản ứng) được ủ ở các nhiệt độ khác nhau từ 30C đến 55C ở pH 5,0 và pH khác nhau từ 3,0-8,0 (pH 3,0-6,0 với đệm acetate; pH 6,0-8,0 với đệm phosphate) ở 37C, sau các khoảng thời gian 2-24h (cellulase tự nhiên) và từ 1- 8h (cellulase tái tổ hợp). Hoạt tính còn lại của enzyme được xác định.

Ảnh hưởng của ion kim loại, chất tẩy rửa và dung môi hữu cơ

Dịch endoglucanase tự nhiên tinh sạch (0,53 g cho mỗi phản ứng) được ủ với ion kim loại 2-10 mM (K+, Na+, Ag+, Fe2+, Ni2+, Mn2+, Ca2+, Zn2+, Ba2+, Cu2+,

V0 là vận tốc ban đầu Vmax là vận tốc cực đại

Mg2+), EDTA và mercaptoethanol; với dung môi hữu cơ 1-20% (v/v) (acetone, ethanol, isopropanol, methanol và n-butanol) và với chất tẩy rửa 1-20% (v/v) (Tween 20, Tween 80, SDS, Triton X-100 và Triton X-114) ở 37C. Sau 1 giờ ủ, hoạt tính còn lại của enzyme được xác định.

Dịch rmEglA tinh sạch (1,5 g cho mỗi phản ứng) được ủ với ion kim loại 2-10 mM (K+, Na+, Ag+, Fe2+, Ni2+, Mn2+, Ca2+, Zn2+, Ba2+, Cu2+, Mg2+), EDTA và mercaptoethanol; với dung môi hữu cơ 1-20% (v/v) (acetone, ethanol, isopropanol, methanol và n-butanol) và với chất tẩy rửa 1-20% (v/v) (Tween 20, Tween 80, SDS, Triton X-100 và Triton X-114) ở 37C. Sau 1 giờ ủ, hoạt tính còn lại của enzyme được xác định.