- Bón phđ n:
d) Thang đânh giâ: để cho điểm mức độ nghiím trọng cho PFSR Mức đânh giâ từ 1–9 như sau:
như sau:
(1) cđy khỏe mạnh hoặc mău sắc thay đổi nhẹ ở vị trí lđy nhiễm (2) trín 50% của lóng được cấy bị thay đổi mău sắc
(3) 51 – 75% của lóng được cấy bị thay đổi mău sắc (4) 76 – 100% của lóng được cấy bị thay đổi mău sắc (5) dưới 50% câc lóng lđn cận bị thay đổi mău sắc (6) trín 50% câc lóng lđn cận bị thay đổi mău sắc
(7) thay đổi mău sắc của 3 lóng (8) thay đổi mău sắc của 4 lóng
(9) thay đổi mău sắc của 5 lóng hoặc nhiều hơn vă cđy chết sớm
Thí nghiệm 3: Đânh giâ chống chịu bệnh thối thđn, thối bắp dựa trín chỉ thị phđn tử
a) Chỉ thị phđn tử SSR
QTL khâng chính có ảnh hưởng lớn nhất được cặp bằng 2 marker
umc1025 vă umc1742 trín vai ngắn nhiễm sắc thể số 3 (3.04bin) giải thích 13 đến 22% phương sai kiểu hình. Marker SSR liín kết chặt với QTL chính hỗ trợ cho chọn lọc nhờ chỉ thị phđn tử MAS trong câc chương trình chọn tạo giống ngô chống chịu bệnh thối bắp Fusarium.Mồi sử dụng dò tìm QTL khâng bệnh thối thđn, thối bắp do nấm Fusarium quan trọng nhất trín NST số 3 (Bin 3.04) (Ding vă cs, 2008)
Left End: GCTTCCATCCTACTGATGATGGTT (umc1742 forward)
Right End: AAGCTGATGCTTTGCCCTTG (umc1742 reverse)
Left End: GCTCCACTTCCACCCTGATATG (umc1025 forward)
Right End: CGCTAATGTCCCCATTGATGAT (umc1025 f reverse)
Ghi chú: Trình tự mồi lấy từ MaizeGDB ( maize Genetics and Genome Database
b) Phương phâp tâch chiết vă tính sạch DNA
Theo Nobou Kobabayshi (1998) cải tiến :Hóa chất :
Tín hóa chất Nồng độ gốc Nồng độ sử dụng Buffer 1 TrisHCl (pH 8.0) 50 mM EDTA 5 mM Sorbitol 350 mM Mercaptoethanol 0.1 % Polyethylenglycol 6000 10%
Buffer 2 TrisHCl (pH 8.0) 50 mM EDTA 5 mM Sorbitol 350 mM Mercaptoethanol 0.1 % Sodium Sarkosyl 1% Buffer 3 NaCl 710 mM CTAB 0.1 % Quy trình :
Bước 1 : Nghiền mô lâ non bằng 1000µl Buffer 1 đến khi thănh dung dịch đồng thể.
Bước 2 : Ly tđm 12000 rpm trong 5 phút ở 40C . Loại bỏ lớp dịch phía trín.
Bước 3 : Bổ sung 300µl Buffer 2 vă 200µl Buffer 3, voltex nhẹ vă ủ 650C trong vòng 15 phút.
Bước 4 : Bổ sung 700µl dung dịch 24.1, đảo trộn thănh dung dịch đồng nhất, để ở nhiệt độ phòng 15 phút.
Bước 5 : Ly tđm 12000 rpm trong 15 phút. Chuyển dịch sang ống mới (có thể lặp lại văi lần B4-B5).
Bước 6 : Bổ sung 350µl Isopropanol lạnh, đảo trộn nhẹ. Để trong tủ lạnh sđu 30 phút hoặc lđu hơn.
Bước 7 : Ly tđm 12000 rpm trong vòng 15 phút ở 40C để thu tủa. Bước 8 : Rửa tủa bằng 700 Ethanol vă để khô trong không khí. Bước 9 : Hòa tan tủa bằng 50µl TE, bảo quản ở -200C.
Chú ý : + Nếu mẫu trộn với Buffer 1 bị nhầy thì nín lặp lại B2 vă B3 để thu được ADN có chất lượng tốt.
+ Nếu dịch lỏng ở phía trín không trong ở B9 thì nín chuyển dịch sang ống mới vă lặp lại B7.