sanctum L.)
Phương pháp chiết tách acid ursolic từ lá Hồng của Nguyễn Thị Ngọc Lan (hình 1.4) sử dụng đến sắc ký cột pha đảo nhiều lần, tốn nhiều thời gian, hệ dung môi rửa giải là MeOH - H2O độc hại và đắt tiền, hơn nữa lượng acid ursolic thu được thấp (2 kg lá hồng sau quá trình chiết tách chỉ thu được 125 mg acid ursolic).
Phương pháp của Rosa T.S. Frighetto phân lập acid ursolic từ vỏ táo (hình 1.5) sử dụng sắc ký cột pha thuận và sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ nhanh để tách acid ursolic, phương pháp này tốn thời gian và khó áp dụng cho sản xuất lớn.
Hai phương pháp chiết tách acid ursolic trên sử dụng phương pháp sắc ký cột nên mất nhiều thời gian, chỉ hợp với quy mô phòng thí nghiệm, không thể áp dụng vào quy mô sản xuất lớn hơn. Hơn nữa cách chọn đối tượng để chiết xuất acid ursolic chưa hợp lý cũng như lượng acid ursolic thu được chưa cao.
Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu quy trình chiết xuất acid ursolic từ Hương nhu tía với mục đích đưa ra quy trình chiết tách có hiệu suất cao hơn, đơn giản hơn và có thể áp dụng vào quy mô lớn hơn.
3.4.1 Phương pháp chiết tách acid ursolic từ cành, lá Hương nhu tía (Ocimum
sanctum L.)
Cành lá Hương nhu tía phơi sấy khô được xay nhỏ, xác định độ ẩm. Độ ẩm của dược liệu là 14,67%.
Cho 100 g dược liệu đã xay nhỏ vào bình cầu dung tích 2 L, chiết hồi lưu dược liệu bằng 1 L hệ dung môi EtOH và EtOAc tỷ lệ 1 : 1 (tt/tt) trên bếp cách thủy ở nhiệt độ 65 0C có lắp sinh hàn để hồi lưu dung môi bay hơi, trong thời gian 2h, thỉnh thoảng có khuấy trộn. Lọc hút chân không, thu dịch lọc, phần bã tiếp tục được
chiết tương tự với 0,8 L hỗn hợp dung môi trên thêm hai lần nữa. Gộp tất cả các phần dịch lọc, thu được dịch chiết.
Dịch chiết được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm tới cắn, thu được 4,40g cắn. Phân tán đều cắn vào nước nóng, chiết với DCM 3 lần, gộp các dịch chiết DCM, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm tới cắn, thu được 2,46 g cắn DCM. Hòa tan cắn vào 50 mL DCM, thêm 1,2 g than hoạt (lượng than hoạt bằng khoảng 50% về khối lượng so với cắn) đun hồi lưu trong 15 phút cho than hoạt hấp phụ acid ursolic. Sau đó lọc nóng, rửa tạp màu trên than hoạt bằng DCM, cuối cùng dùng 100 mL aceton rửa giải acid ursolic. Lớp DCM sau khi lọc được đun hồi lưu với than hoạt, xử lý tương tự như trên. Gom các dịch aceton, cất thu hồi dung môi thu được 0,2358 g acid ursolic thô. Hiệu suất chiết acid ursolic thô của phương pháp là 0,28% trên khối lượng dược liệu khô.
Kết tinh acid ursolic được thực hiện như sau : lượng acid ursolic thô ở trên được đưa vào bình cầu. Thêm 3,3 mL EtOH tuyệt đối, đun hồi lưu cho tan hoàn toàn. Sau đó để nguội, tiếp tục khuấy ở nhiệt độ phòng, để qua đêm ở nhiệt độ 5 0
C. Tinh thể được lọc hút chân không, rồi rửa tạp màu bằng DCM, sấy chân không, thu được 0,1558 g tinh thể màu trắng. Hiệu suất quá trình kết tinh là 66,07%.
Sắc ký đồ acid ursolic sau kết tinh với chất đối chứng cho thấy quá trình kết tinh đã loại được nhiều tạp (hình 3.4)
Hình 3.4 : Sắc ký đồ acid ursolic thô và sau khi kết tinh với chất đối chứng.
(C) : acid ursolic đối chiếu.
(T) : acid ursolic thô (chưa kết tinh). (KT) : acid ursolic sau khi kết tinh.
Hệ dung môi khai triển : CHCl3 : MeOH = 95 : 5 (tt/tt).
Thuốc thử hiện màu : dd H2SO4 10% trong EtOH, hơ nóng trên bếp điện.
Chúng tôi tiếp tục khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất, để từ đó từng bước hoàn thiện để quy trình đạt hiệu suất cao hơn.
3.4.2 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất
Các yếu tố chúng tôi khảo sát bao gồm : dung môi, nhiệt độ, tỷ lệ dung môi/dược liệu và số lần chiết.
3.4.1 Khảo sát hệ dung môi chiết xuất
Chúng tôi đã tiến hành khảo sát dung môi chiết xuất bằng cách so sánh lượng acid ursolic thô thu được khi chiết với các dung môi khác nhau. Tiến hành khảo sát với khối lượng dược liệu 50 g, tỷ lệ dung môi/dược liệu giữa các lần lần lượt là 8/6/6 (tt/kl), nhiệt độ 65 0
Các dung môi khảo sát là : • EtOH. • MeOH. • EtOH và EtOAc tỷ lệ 1 : 1 (tt/tt). • MeOH và EtOAc tỷ lệ 1 : 1 (tt/tt). Kết quả khảo sát ở bảng 3.3
Bảng 3.3 : Hàm lượng acid ursolic thô (%) khi chiết bằng các dung môi khác nhau. STT Hệ dung môi
chiết xuất
Khối lượng acid ursolic thô (g) Hàm lượng acid ursolic thô (%) 1 EtOH 0,0945 0,22 2 MeOH 0,0863 0,20 3 EtOH : EtOAc = 1 : 1 0,1226 0,29 4 MeOH : EtOAc = 1 : 1 0,1345 0,32
Từ bảng trên ta thấy được sự chênh lệch giữa hàm lượng acid ursolic thô khi dùng các dung môi khác nhau. Khi dùng một dung môi riêng lẻ (EtOH hoặc MeOH) để chiết xuất, ta thu được lượng acid ursolic thô ít hơn khi chiết bằng hệ dung môi (EtOH/EtOAc và MeOH/EtOAc). Trong đó khi chiết bằng hệ MeOH/EtOAc tỷ lệ 1:1, ta thu được lượng acid ursolic thô cao nhất.
Do đó trong các quá trình tiếp theo, chúng tôi sẽ khảo sát với hệ dung môi MeOH/EtOAc tỷ lệ 1:1.
Hình 3.5 : Sắc ký đồ acid ursolic thô của các mẻ chiết bằng các dung môi khác nhau.
(C) : acid ursolic đối chiếu.
(M) : acid ursolic thô của mẻ chiết bằng MeOH.
(ME) : acid ursolic thô của mẻ chiết bằng MeOH/EtOAc. (E) : acid ursolic thô của mẻ chiết bằng EtOH.
(EE) : acid ursolic thô của mẻ chiết bằng EtOH/EtOAc. Hệ dung môi khai triển : CHCl3 : MeOH = 95 : 5 (tt/tt).
Thuốc thử hiện màu : dd H2SO4 10% trong EtOH, hơ nóng trên bếp điện.
3.4.2 Khảo sát nhiệt độ chiết xuất
Để khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng acid ursolic thô chiết từ dược liệu, chúng tôi tiếp tục tiến hành chiết với khối lượng dược liệu 50 g, dung môi là MeOH/EtOAc tỷ lệ 1 : 1, tỷ lệ dung môi/dược liệu giữa các lần lần lượt là 8/6/6 (tt/kl), khảo sát ở 3 nhiệt độ trên bếp cách thủy : 45 0
C, 55 0C và 65 0C (chú ý là ở 65 0
C hỗn hợp dung môi hồi lưu), thời gian mỗi lần chiết là 2 h. Kết quả khảo sát ở bảng 3.4.
Bảng 3.4 : Hàm lượng acid ursolic thô (%) khi chiết ở các nhiệt độ khác nhau. STT Nhiệt độ chiết xuất
(0C)
Khối lượng acid ursolic thô (g) Hàm lượng acid ursolic thô (%) 1 45 0,1164 0,27 2 55 0,1255 0,29 3 65 0,1345 0,32
Chúng tôi chỉ khảo sát đến nhiệt độ 65 0C vì nhiệt độ này là nhiệt độ hồi lưu của hỗn hợp dung môi. Từ bảng trên ta thấy được nhiệt độ có ảnh hưởng đến lượng acid ursolic thô chiết được. Khi tăng nhiệt độ chiết thì lượng acid ursolic thô thu được cũng tăng lên.
Vì lý do trên, trong các quá trình tiếp theo, chúng tôi sẽ khảo sát với hệ dung môi MeOH/EtOAc tỷ lệ 1:1 ở nhiệt độ 65 0C trên bếp cách thủy.
3.4.3 Khảo sát tỷ lệ dung môi/dược liệu
Để khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/dược liệu đến hàm lượng acid ursolic thô chiết từ Hương nhu tía, chúng tôi tiếp tục tiến hành chiết với khối lượng dược liệu 50 g, hệ dung môi chiết xuất là MeOH/EtOAc tỷ lệ 1 : 1, nhiệt độ 65 0
C trên bếp cách thủy, thời gian mỗi lần chiết là 2h, khảo sát ở 2 tỷ lệ dung môi/dược liệu ở 3 lần chiết lần lượt là 8/6/6 và 10/8/8 (tt/kl). Kết quả khảo sát ở bảng 3.5.
Bảng 3.5 : Hàm lượng acid ursolic thô (%) khi chiết với tỷ lệ dung môi/dược liệu khác nhau.
STT Tỷ lệ dung môi/ dược liệu
Khối lượng acid ursolic thô (g)
Hàm lượng acid ursolic thô (%)
1 8/6/6 0,1345 0,32
Lý do sử dụng lượng dung môi nhỏ hơn ở các lần chiết tiếp theo là do sau lần chiết đầu, dược liệu đã thấm dung môi nên chỉ cần lượng dung môi nhỏ hơn. Tiến hành khảo sát bắt đầu từ tỷ lệ 8/6/6 (tt/kl) vì đây là tỷ lệ dung môi/dược liệu nhỏ nhất để ngập dược liệu, đảm bảo toàn bộ dược liệu được tiếp xúc với dung môi.
Từ bảng trên cho thấy khi tăng lượng dung môi lên, lượng acid ursolic thu được tăng không đáng kể, do đó chúng tôi sẽ khảo sát yếu tố tiếp theo với tỷ lệ dung môi/dược liệu là 8/6/6 (tt/kl).
3.4.4 Khảo sát số lần chiết xuất
Để khảo sát sự phụ thuộc của hàm lượng acid ursolic thô vào số lần chiết, chúng tôi đã so sánh lượng acid ursolic thu được khi chiết 2 lần và 3 lần với khối lượng dược liệu 50 g, dung môi chiết là MeOH : EtOAc = 1:1, nhiệt độ 65 0
C trên bếp cách thủy, thời gian mỗi lần chiết là 2h, tỷ lệ dung môi/dược liệu các lần chiết lần lượt là 8/6 (tt/kl) đối với chiết 2 lần và 8/6/6 (tt/kl) đối với chiết 3 lần. Kết quả khảo sát ở bảng 3.6.
Bảng 3.6 : Hàm lượng acid ursolic thô (%) với số lần chiết khác nhau. STT Số lần chiết xuất Khối lượng acid
ursolic thô (g)
Hàm lượng acid ursolic thô (%)
1 2 lần (8/6) 0,1058 0,25
2 3 lần (8/6/6) 0,1345 0,32
Theo bảng trên ta thấy lượng acid ursolic thu được sau 2 lần chiết bằng 78,66% so với khi chiết 3 lần. Do đó chúng tôi sẽ tiến hành chiết 3 lần để thu được lượng acid ursolic cao nhất.
Các kết quả trên đã cho thấy điều kiện chiết xuất cho hàm lượng acid ursolic thô cao nhất với 50 g dược liệu là sử dụng hỗn hợp dung môi MeOH/EtOAc tỷ lệ 1:1; lần chiết đầu với 400 mL hỗn hợp dung môi trên; hai lần sau, mỗi lần với 300 mL hỗn hợp dung môi trên. Các lần chiết được tiến hành ở nhiệt độ 65 0C trên bếp cách thủy trong thời gian 2 giờ.
Với điều kiện chiết này, từ 50 g nguyên liệu ban đầu thu được 0,1345 g acid ursolic thô, tương đương với hàm lượng acid ursolic thô là 0,32% trên khối lượng dược liệu khô. Sơ đồ quy trình chiết xuất acid ursolic ở hình 3.6.
Cành và lá Hương nhu tía (50 g) MeOH/EtOAc (1:1) Chiết 3 lần/mỗi lần 2h 65 0C/lượng DM = 400/300/300 mL Lọc Dịch chiết Cắn
Cất thu hồi dung môi
Dịch DCM
Phân tán trong nước chiết với DCM
Thêm than hoạt, đun hồi lưu 15 phút, lọc lấy than hoạt
Than hoạt đã hấp phụ acid ursolic
Dịch aceton chứa acid ursolic thô
Rửa giải bằng aceton
Acid ursolic thô (0,1345 g)
Cất thu hồi dung môi
Dịch DCM sau khi lọc
BÀN LUẬN
Về định tính các nhóm chất hữu cơ trong Hương nhu tía
- Kết quả định tính cho thấy Hương nhu tía có nhóm saponin triterpenoid. Điều này phù hợp với sự có mặt của acid ursolic trong Hương nhu tía.
Về phân lập acid ursolic bằng sắc ký cột
- Chúng tôi đã khảo sát sự có mặt của acid ursolic bằng SKLM các cắn phân đoạn n-hexan, DCM, EtOAC (hình 3.3) và kết quả cho thấy acid ursolic tập trung chủ yếu ở phân đoạn DCM; phân đoạn n-hexan và EtOAc chỉ chứa lượng nhỏ, không đáng kể. Điều này là do acid ursolic có độ phân cực trung bình nên sẽ tập trung ở phân đoạn DCM.
- Tuy cắn n-hexan chiếm tỷ lệ khối lượng lớn trong cắn MeOH (23,84%) (tỷ lệ của cắn DCM và EtOAc lần lượt là 26,71% và 8,83%) nhưng theo sắc ký đồ ở hình 3.3, phân đoạn n-hexan chỉ chứa lượng nhỏ acid ursolic. Do đó, trước khi tiến hành phân lập chất, cần loại bỏ phân đoạn n-hexan để tiết kiệm hóa chất, dung môi cũng như thời gian tiến hành sắc ký cột.
- Qua việc phân lập thành công và thu được lượng lớn chất đã cho thấy acid ursolic là một thành phần hóa học chính trong Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.), điều này phù hợp với các nghiên cứu trước đó ở nước ngoài [19, 22].
Về phương pháp chiết xuất acid ursolic từ Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.)
- Khảo sát về dung môi : chúng tôi đã khảo sát 4 dung môi chiết xuất là EtOH, MeOH và hỗn hợp của chúng với EtOAc. Kết quả cho thấy khi sử dụng hệ dung môi có EtOAc thì thu được lượng acid ursolic thô cao hơn dùng riêng lẻ EtOH hoặc MeOH. Lý do là acid ursolic là một chất có độ phân cực trung bình nên khi sử dụng EtOAc sẽ làm giảm độ phân cực của hệ dung môi, do đó sẽ hòa tan acid ursolic
trong dược liệu tốt hơn. Hơn nữa, đây đều những dung môi thông dụng, rẻ tiền, có thể áp dụng sản xuất lớn. Không sử dụng DCM để chiết vì DCM là một dung môi độc hại, bay hơi nhanh và dịch chiết thu được sẽ có cả phần không phân cực (chứa ít acid ursolic) tạo ra nhiều tạp, gây khó khăn trong quá trình chiết tách.
- Khảo sát về nhiệt độ chiết : chúng tôi so sánh lượng acid ursolic thô thu được khi tiến hành chiết ở 3 nhiệt độ khác nhau 45, 55 và 65 0C để tìm ra nhiệt độ tối ưu cho quá trình chiết xuất, vừa thu được nhiều acid ursolic, vừa tiết kiệm năng lượng. Kết quả cho thấy nhiệt độ hồi lưu của hệ dung môi (65 0C) cho lượng chất lớn nhất.
- Khảo sát về tỷ lệ dung môi/dược liệu và số lần chiết xuất với mục đích giảm lượng dung môi sử dụng, rút ngắn thời gian chiết xuất nhưng vẫn đảm bảo thu được hàm lượng acid ursolic cao. Kết quả cho thấy cần chiết 3 lần và tỷ lệ dung môi/dược liệu tốt nhất là 8/6/6.
- Phương pháp chiết xuất của chúng tôi sử dụng than hoạt để hấp phụ acid ursolic, đây là một nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm. Sắc ký đồ ở hình 3.4 cho thấy acid ursolic thô có ít tạp, do đó dễ tinh chế. Thực tế là chúng tôi đã kết tinh được acid ursolic với hiệu suất cao (66,07%). Dựa trên sắc ký đồ với thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH (hình 3.5), acid ursolic sau kết tinh có độ sạch cao. Về cảm quan, acid ursolic thô có màu vàng chanh, sau quá trình kết tinh và rửa màu thu được tinh thể có màu trắng.
- Chúng tôi không sử dụng sắc ký cột như hai phương pháp đã mô tả ở trên
(hình 1.4 và 1.5)để phân lập chất, mà dùng các phương pháp tách chiết đơn giản và các dung môi, hóa chất thông dụng, rẻ tiền nên có thể áp dụng ở quy mô lớn. Nghiên cứu còn cho thấy Hương nhu tía là một nguồn nguyên liệu để chiết xuất acid ursolic tiềm năng và cần được nghiên cứu nhiều hơn.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận
Sau quá trình thực hiện khóa luận, chúng tôi đã thu được một số kết quả : - Xác định được cành lá Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) có các nhóm chất : saponin triterpenoid, flavonoid, coumarin, acid hữu cơ, phytosterol, tinh dầu và bằng phương pháp này không thấy sự có mặt của alcaloid, tanin, anthranoid, acid amin, đường khử, chất béo và carotenoid.
- Xác định được sự có mặt của acid ursolic trong Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) bằng SKLM khi khai triển với hệ dung môi :
• CHCl3 : MeOH = 9:1 (tt/tt).
• ether dầu hỏa : EtOAc = 4 : 6 (tt/tt).
và hiện màu bằng thuốc thử hiện màu : H2SO4 10%/EtOH, hơ nóng trên bếp điện. - Đã phân lập được acid ursolic bằng sắc ký cột từ phân đoạn DCM.
- Đã nhận dạng được chất phân lập là acid ursolic bằng các phương pháp phổ, kết hợp với dữ liệu phổ của acid ursolic đã công bố.
- Đã khảo sát một số yếu tố và rút ra điều kiện chiết xuất cho hiệu suất chiết acid ursolic thô cao nhất với 50 g dược liệu là sử dụng hỗn hợp dung môi MeOH/EtOAc tỷ lệ 1:1; tỷ lệ dung môi/dược liệu trong 3 lần chiết lần lượt là 8/6/6. Các lần chiết được tiến hành ở nhiệt độ 65 0