bằng sắc ký cột
Chiết hồi lưu 1 kg dược liệu đã xay nhỏ (độ ẩm 15,63%) với dung môi MeOH ở nhiệt độ 600C trên bếp cách thủy, chiết 3 lần, mỗi lần với 5 L dung môi trong 2 giờ. Gộp các dịch chiết, lọc qua giấy lọc thu lấy phần dịch, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm tới khi hết dung môi, thu được 42,45 g cắn MeOH toàn phần.
Phân tán cắn MeOH toàn phần trong một lượng tối thiểu nước nóng, sau đó chiết lần lượt với các dung môi : n-hexan, DCM, EtOAc (chiết mỗi phân đoạn 3 lần), thu được dịch chiết các phân đoạn, rồi cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm các dịch chiết đó tới cắn. Cân khối lượng các cắn.
Hình 3.2 : Tóm tắt quy trình chiết xuất các phân đoạn từ cành, lá Hương nhu
tía (Ocimum sanctum L.)
(*) : cất thu hồi dung môi
Cành, lá Hương nhu tía xay nhỏ (1kg)
Chiết hồi lưu với MeOH 5L x 3 lần, mỗi lần 2h Dịch chiết MeOH Cắn MeOH (42,45 g) Nước nóng (*) Dịch chiết nước Dịch chiết n-hexan n-hexan (*) Cắn n-hexan (10,12 g) Dịch chiết nước Dịch chiết DCM DCM (*) Cắn DCM (11,34 g) Dịch chiết nước Dịch chiết EtOAc EtOAc (*) Cắn EtOAc (3,75 g) Dịch chiết nước
Tiến hành chấm các cắn phân đoạn trên SKLM với acid ursolic đối chứng để xác định phân đoạn tách chất.
- Chuẩn bị mẫu thử và mẫu đối chứng :
+ Mẫu đối chứng : 1 mg acid ursolic hòa tan trong 1 mL MeOH.
+ Các mẫu thử được chuẩn bị như sau : 5 mg cắn hòa tan vào 1 mL dung môi tương ứng.
- Hệ dung môi khai triển : CHCl3 : MeOH = 95 : 5 (tt/tt).
- Phương pháp hiện màu : phun dung dịch H2SO4 10% trong EtOH, hơ nóng trên bếp điện.
Hình 3.3 : Sắc ký đồ các cắn phân đoạn với acid ursolic đối chứng.
(C) acid ursolic đối chứng ; (H) cắn n-hexan ; (D) cắn DCM ; (E) cắn EtOAc.
Thuốc thử hiện màu là H2SO4 10% trong EtOH.
Nhận xét : Dựa trên hình ảnh sắc ký đồ ở hình 3.3, ta thấy chất có Rf tương đương với acid ursolic nằm chủ yếu ở phân đoạn DCM (vết đậm màu nhất), do đó chúng tôi sẽ tiến hành tách chất đó từ phân đoạn DCM.
Tiến hành phân lập chất từ phân đoạn DCM bằng sắc ký cột :
- Chuẩn bị chất hấp phụ
Đong 300 mL Silicagel 60 (cỡ hạt 0,04 - 0,063 mm) được hoạt hóa ở 110 0 C trong 1h. Để nguội ở bình hút ẩm.
- Chuẩn bị cột
Chọn cột sắc ký kích thước 5x25 cm, lắp thẳng đứng trên giá. Vặn khóa cột. Lót 1 lớp bông sạch ở đáy cột. Thêm DCM vào silicagel đã hoạt hóa, khuấy đều tạo hỗn dịch, chú ý loại bỏ hết bọt khí. Rót từ từ hỗn dịch lên cột theo thành cột. Dùng pipet rửa thành cột bằng DCM. Cho dung môi chạy qua cột vài lần để ổn định cột.
- Chuẩn bị mẫu đưa lên cột
Hòa tan hoàn toàn cắn (11,34 g) vào lượng tối thiểu dung môi DCM, rồi cho 20 mL silicagel vào khuấy đều cho chất hấp phụ hết lên silicagel. Tiếp tục khuấy cho dung môi bay hơi tự nhiên đến khi khô tơi.
- Đưa chất lên cột
+ Mở khóa cột cho dung môi chảy từ từ đến khi lớp dung môi trong cột gần bề mặt silicagel.
+ Đưa từ từ silicagel đã hấp phụ chất lên cột, tránh xáo trộn cột. Chú ý phải đưa từ từ để tránh silicagel vón cục và phân tán không đều.
+ Bổ sung nhẹ nhàng dung môi DCM, tránh gây xáo trộn.
- Rửa giải
+ Sử dụng hệ dung môi DCM và MeOH tăng dần độ phân cực (gradient lượng MeOH từ 0% đến 10%). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Điều chỉnh khóa cột sao cho tốc độ rửa giải khoảng 20 giọt/phút.
+ Dịch rửa giải được hứng vào các ống nghiệm đã đánh số thứ tự, mỗi ống hứng khoảng 20 mL.
+ Kiểm tra dịch rửa giải ở các ống nghiệm bằng SKLM, chấm đối chứng với acid ursolic chuẩn, hệ dung môi khai triển là CHCl3 : MeOH = 95 : 5 (tt/tt), thuốc thử hiện màu là H2SO410% trong EtOH, hơ nóng trên bếp điện.
+ Thu lấy các ống chứa chất có Rftương đương với acid ursolic đối chứng, ký hiệu là D1. Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 1,56 g chất rắn.
- Kết tinh D1
Tiến hành kết tinh D1 như sau : đun hồi lưu D1 trong EtOH cho tan hoàn toàn, sau đó tiếp tục khuấy ở nhiệt độ thường, để qua đêm ở tủ lạnh, lọc hút chân không, rửa màu bằng DCM lạnh, sấy chân không thu được 0,94 g tinh thể màu trắng.
3.3.3 Nhận dạng chất phân lập
Tính chất của D1 : D1 có dạng tinh thể màu trắng, có nhiệt độ nóng chảy là 288-2900C, không hiện UV trên SKLM, hiện màu tím đậm sau khi phun dung dịch H2SO4 10% trong EtOH và hơ nóng trên bếp điện.
D1 sau khi tinh chế, được đem đo các phổ hồng ngoại (IR), khối phổ (ESI- MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1
H-NMR và 13C-NMR) để xác định cấu trúc.
Phổ hồng ngoại IR (KBr, cm-1
) : 3475 (nhóm hydroxyl), 1693 (nhóm carbonyl) (phụ lục 2).
Phổ khối ESI-MS : cho thấy khối lượng phân tử của D1 là 456,31 ứng với công thức phân tử C30H48O3 của acid ursolic (phụ lục 3).
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR : dữ liệu phổ NMR của chất được thể hiện ở bảng 3.3 (phụ lục 4,5).
Bảng 3.2 : Phổ 1
H, 13C-NMR của D1 và acid ursolic.
Vị trí carbon
Phổ NMR của D1
(CDCl3/MeOD)
Phổ NMR của acid ursolic
(DMSO-d6)[19] δc (ppm) δH (ppm) δc (ppm) δH (ppm) 1 36,87 1,54 (2H,m) 38,22 1,56 (2H,m) 2 26,79 1,37 (2H,m) 26,79 1,43 (2H,m) 3 78,82 3,21(1H,t,J =8,5;7,5Hz) 76,82 3,01 (1H,dd,J=5,2;9,5Hz) 4 38,62 38,35 5 55,19 0,71 (1H,t) 54,77 0,66 (1H,s)
6 18,24 1,37 (2H,m) 17,97 1,47 (1H,m) 1,29 (1H,m) 7 30,60 1,26 (2H,m) 30,77 1,27 (2H,m) 8 39,41 39,09 9 48,66 1,59 (1H,t) 47,00 1,58 (1H,s) 10 36,75 36,51 11 24,14 1,92 (2H,dd) 23,80 1,92 (2H,dd,J=13,7;3,5Hz) 12 125,44 5,24(1H,t,J =3,5;3,5Hz) 125,54 5,14 (1H,dd,J=13,7;3,5Hz) 13 138,12 138,18 14 42,01 41,62 15 32,98 1,48 (2H,m) 32,69 1,01 (2H,m) 16 23,20 1,52 (2H,m) 22,82 1,53 (2H,m) 17 49,51 46,81 18 52,76 2,18(1H,d,J =11Hz) 52,37 2,12 (1H,d,J=11,1Hz) 19 38,83 1,31 (1H,m) 38,42 1,31 (1H,m) 20 39,02 1,57 (2H,m) 38,48 1,52 (1H,m) 21 27,95 1,29 (2H,m) 27,52 1,29 (2H,m) 22 36,75 1,47 (2H,m) 36,29 1,54 (2H,m) 23 27,95 0,92 (3H,s) 28,23 0,90 (3H,s) 24 16,89 0,77 (3H,s) 16,90 0,68 (3H,s) 25 16,79 0,98 (3H,s) 16,03 0,87 (3H,s) 26 15,49 0,81 (3H,s) 15,18 0,69 (3H,s) 27 23,42 1,09 (3H,s) 23,24 1,05 (2H,s) 28 180,54 178.23 29 15,31 0,85 (3H,d,J =6Hz) 16,97 0,82 (3H,d,J=5,9Hz) 30 21,03 0,94(3H,d,J =6,5Hz) 21,10 0,92 (3H,d,J=6,8Hz)
Dựa vào căn cứ dữ liệu phổ hồng ngoại IR, phổ khối ESI-MS và phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1
H, 13C-NMR, so sánh với các dữ liệu phổ đã công bố cho phép kết luận chất thu được là acid ursolic [19].