Thử tác dụng chống oxy hóa của sản phẩm theo 2 phương pháp: - Đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH (phương pháp DPPH). - Đánh giá tác dụng dọn gốc tự do superoxid (phương pháp SOD).
Mẫu thử được hòa tan trong dung môi DMSO để được dung dịch gốc có nồng độ 10 mg/ml. Sau đó pha loãng dung dịch gốc bằng dung môi/ đệm thích hợp để thu được 6 dung dịch có nồng độ trong khoảng từ 1 – 300 µg/ml.
Đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH:
Thí nghiệm đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH được tiến hành trên đĩa 96 giếng Costar 3596 (Corning, Mỹ). Trên mỗi đĩa gồm các giếng chứng và các giếng thử. Song song với mỗi mẫu chứng và mẫu thử, có một mẫu trắng của chứng, trắng của thử được tiến hành trong cùng điều kiện. Các giếng được bố trí như sau:
Bảng 3.9. Bố trí thí nghiệm đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH DMSO dd thử dd DPPH MeOH Giếng thử 20 µl 180 µl Giếng trắng thử 20 µl 180 µl Giếng chứng 20 µl 180 µl Giếng trắng chứng 20 µl 180 µl
Đĩa được giữ trong bóng tối 15 phút. Sau đó, đo mật độ quang của dung dịch ở bước sóng 517 nm, sử dụng hệ thống máy ELISA (Biotek).
Tác dụng dọn gốc tự do DPPH được đánh giá thông qua tỷ lệ giảm mật độ quang (OD) của mẫu thử so với mẫu chứng:
Trong đó, ΔODchứng = ODchứng – ODtrắng chứng; ΔODthử = ODthử – ODtrắng thử.
Xác định giá trị IC50 của mỗi mẫu thử, là giá trị nồng độ tại đó mẫu dọn được 50% số gốc tự do DPPH có trong giếng thử.
Đánh giá tác dụng dọn gốc tự do superoxid (SOD)
Thí nghiệm đánh giá tác dụng dọn gốc tự do SOD được tiến hành trên đĩa 96 giếng Costar 3596 (Corning, Mỹ). Trên mỗi đĩa 96 giếng gồm các giếng chứng và các giếng thử. Song song với mỗi mẫu chứng và mẫu thử, có một mẫu trắng của chứng, trắng của thử được tiến hành trong cùng điều kiện. Các giếng được bố trí như sau:
Bảng 3.10. Bố trí thí nghiệm đánh giá tác dụng dọn gốc tự do SOD Nước cất dd thử dd làm việc WST dd enzym làm việc dd đệm pha loãng Giếng thử 20 µl 200 µl 20 µl Giếng trắng thử 20 µl 200 µl 20 µl Giếng chứng 20 µl 200 µl 20 µl Giếng trắng chứng 20 µl 200 µl 20 µl
Đĩa được ủ ở 37oC trong 20 phút. Sau đó, đo mật độ quang của dung dịch ở bước sóng 450 nm, sử dụng hệ thống máy ELISA (Biotek).
Tác dụng dọn gốc tự do SOD được đánh giá thông qua tỷ lệ giảm mật độ quang (OD) của mẫu thử so với mẫu chứng:
Trong đó, ΔODchứng = ODchứng – ODtrắng chứng; ΔODthử = ODthử – ODtrắng thử.
Xác định giá trị IC50 của mỗi mẫu thử, là giá trị nồng độ tại đó mẫu dọn được 50% số gốc tự do SOD có trong giếng thử.
Phương pháp xử lý số liệu:
- Giá trị ΔOD được biểu diễn dưới dạng M ± SD (M lá giá trị ΔOD trung bình của từng mẫu, SD là độ lệch chuẩn), so sánh giá trị trung bình của các mẫu thử so với chứng bằng t-test. Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.
- Tính IC50 và khoảng tin cậy 95% của IC50 bằng phương pháp phân tích hồi quy không tuyến tính (nonlinear regression) sử dụng phần mềm Graph Prism 5.
Kết quả:
Kết quả đánh giá tác dụng của mẫu THC được trình bày trong các bảng 3.11 và
3.12:
Bảng 3.11. Tác dụng dọn gốc tự do DPPH ở nồng độ 300, 100, và 10 µg/ml và IC50 của mẫu thử Mẫu Nồng độ 300µg/ml Nồng độ 100µg/ml Nồng độ 10 µg/ml IC50 (µg/ml) I (%) I (%) I (%) Chứng 0,667±0,011 THC 0,028±0,004 94,8 0,095±0,004 85,6 0,522±0,006 21,3 23,66 (19,53 - 28,66) Bảng 3.12. Tác dụng dọn gốc tự do SOD ở nồng độ 300, 100, và 10 µg/ml và IC50 của mẫu thử Mẫu Nồng độ 300µg/ml Nồng độ 100µg/ml Nồng độ 10 µg/ml IC50 (µg/ml) I (%) I (%) I (%) Chứng 0,798±0,007 THC 0,534±0,013 32,2 0,552±0,064 30,8 0,774±0,016 2,7 30,01 (12,98 – 69,41) Nhận xét: THC có khả năng dọn gốc tự do DPPH và SOD tốt. 3.5. BÀN LUẬN 3.5.1. Về bán tổng hợp hóa học
Các phản ứng khử hóa curcumin đều không chọn lọc. Điều này có thể quan sát thấy trên SKLM. Các sản phẩm phụ của phản ứng có thể là sản phẩm hydro hóa một nối đôi hoặc sản phẩm khử hóa cả nhóm chức ceton không mong muốn. Điều này dẫn đến khó khăn trong việc khử hóa chọn lọc nhóm alken tạo THC cũng như tinh chế sản phẩm. Tinh chế sản phẩm bằng phương pháp sắc ký cột rất tốn kém, chỉ có thể ứng dụng trong nghiên cứu ở quy mô nhỏ, khó áp dụng được ở quy mô sản xuất lớn.
Phản ứng khử hóa với H2/Pd/C:
Phản ứng khử hóa curcumin với tác nhân là khí hydro có xúc tác đã được nhiều tác giả nghiên cứu. Trong phản ứng này, để khử hóa chọn lọc nhóm alken, tránh tạo các sản phẩm phụ không mong muốn, cần chú ý kiểm soát tỷ lệ xúc tác và thời gian phản ứng. Khi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng xúc tác so với khối lượng curcumin, chúng tôi nhận thấy khi tăng tỷ lệ xúc tác lên cao hơn 5% thì hiệu suất phản ứng giảm. Điều này có thể là do lượng xúc tác nhiều dẫn đến khử hóa thêm một hoặc cả hai nhóm ceton, tạo ra các sản phẩm phụ là monoalcol và dialcol. Hiện tượng này cũng có thể gặp phải nếu thời gian phản ứng quá dài.
Phương pháp này có ưu điểm là sản phẩm tương đối sạch, điều kiện khử hóa khá ổn định; tuy nhiên có nhược điểm là khí hydro tạo hỗn hợp nổ với không khí ở khoảng nồng độ rất rộng (4,1-74,2%), cần chú ý vấn đề an toàn khi thực hiện phản ứng [8]. Phương pháp này khó ứng dụng ở quy mô lớn trong điều kiện của Việt Nam.
Phản ứng khử hóa với Zn/acid:
Khi sử dụng acid acetic thì thấy phản ứng không xảy ra. Điều này có thể là do: - Thứ nhất, lực acid của acid acetic yếu, không đủ mạnh để hoạt hóa kẽm. - Thứ hai, kẽm phản ứng với acid acetic tạo ra muối kẽm acetat, dạng muối kẽm này rất dễ tạo phức với curcumin, làm ảnh hưởng đến khả năng phản ứng của curcumin. Còn dạng muối kẽm clorid hay kẽm sulfat khó tạo phức với curcumin hơn.
Trong khi đó, phản ứng khử hóa xảy ra dễ dàng hơn trong môi trường acid hydrocloric và acid sulfuric.
Để thực hiện tốt phản ứng khử hóa với kẽm trong môi trường acid hydrocloric, thu được hiệu suất cao, ít sản phẩm phụ, cần lưu ý một số vấn đề sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Để kiểm soát tốc độ phản ứng và khử hóa chọn lọc trên nhóm alken, lượng kẽm nên được cho vào từ từ thành nhiều đợt trong quá trình phản ứng. Nếu cho kẽm quá nhanh có thể khử luôn nhóm chức ceton, tạo nhiều sản phẩm phụ, làm giảm hiệu suất phản ứng và khó tinh chế sản phẩm.
- Tỷ lệ kẽm so với curcumin cũng ảnh hưởng nhiều đến phản ứng. Nếu lượng kẽm không đủ, phản ứng xảy ra không hoàn toàn, curcumin còn dư khó loại bỏ sau phản ứng. Nhưng nếu lượng kẽm dư quá nhiều có thể khử luôn nhóm chức ceton, tạo nhiều sản phẩm phụ. Điều này cũng xảy ra nếu thời gian phản ứng kéo dài.
- Nồng độ acid sử dụng cũng có ảnh hưởng đến phản ứng. Kết quả khảo sát cho thấy, khi sử sụng acid loãng (5%, 10%), hiệu suất phản ứng thấp. Điều này có thể do nồng độ acid loãng, kẽm được hoạt hóa kém, khả năng khử hóa giảm. Nhưng nếu sử dụng acid HCl đặc, kẽm được hoạt hóa mạnh, có thể khử cả nhóm ceton, làm giảm hiệu suất phản ứng tạo THC. Để đảm bảo phản ứng xảy ra tốt, cần duy trì môi trường acid trong suốt quá trình phản ứng.
- Nhóm –OH phenol rất dễ bị oxy hóa bởi oxy trong không khí, do đó cần phải sục nitơ để đuổi hết không khí trong bình trước khi tiến hành phản ứng.
Phương pháp khử hóa curcumin với tác nhân là kẽm trong môi trường acid hiện nay chưa có tài liệu nào công bố. Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản, rẻ tiền, hiệu suất tốt, có thể ứng dụng trong sản xuất ở quy mô công nghiệp.
3.5.2. Về xác định cấu trúc
Phổ hồng ngoại (IR)
Trên phổ hồng ngoại của sản phẩm xuất hiện các dải hấp thụ đặc trưng cho từng nhóm chức, cụ thể như sau:
- Dải hấp thụ đặc trưng cho nhóm chức β-diceton (O=C-CH2-C=O) xuất hiện với số sóng là 1608 cm-1. Số sóng của các nhóm chức –C=O này giảm mạnh so với nhóm ceton thông thường (có ѵ = 1715 cm-1), điều này là do phân tử THC tồn tại ở dạng hỗ biến ceto-enol, tạo ra liên kết hydro nội phân tử như hình sau:
R O
R' O H
- Các liên kết no -C-H của sản phẩm khử hóa 2 nối đôi cho dải hấp thụ đặc trưng tại số sóng 2931 và 2854 cm-1.
- Hai nhân thơm cho các dải hấp thụ đặc trưng tại số sóng 3072 cm-1 (=C-H thơm) và 1513, 1455 cm-1 (-C=C- thơm).
- Dải hấp thụ đặc trưng cho nhóm -OH phenol xuất hiện với cường độ tương đối mạnh, với số sóng là 3486 cm-1.
Phổ khối lượng (MS)
Trên các phổ đồ đều xuất hiện pic phân tử [M+H]+ (m/z = 373,9) hoặc [M+Na]+
(m/z = 395,07), phù hợp với khối lượng phân tử tetrahydrocurcumin (M=372,2), ứng với CTPT C21H24O6. Kết quả này cùng với sự đồng nhất của 2 vết sản phẩm khử hóa với 2 tác nhân khác nhau là H2/Pd(C) và Zn/HCl trên SKLM cho phép chúng tôi khẳng định sự đồng nhất cấu trúc của chúng.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR)
Phổ đồ của sản phẩm có các tín hiệu cho phép nhận biết dạng proton và số lượng proton, cụ thể như sau:
- Các tín hiệu tại δ = 2,54 – 2,68 ppm đặc trưng cho 8 proton ở các vị trí C1, C2, C6, C7 của mạch heptan. Kết quả này chứng tỏ rằng cả hai liên kết đôi alken trong phân tử curcumin đều đã được khử hóa hoàn toàn thành alkan.
- Tín hiệu tại δ = 3,73 ppm đặc trưng cho 6 proton của 2 nhóm methoxy tương đương về từ tính.
- Các tín hiệu tại δ = 6,55 – 6,78 ppm đặc trưng cho 6 proton của nhân thơm. - Tín hiệu tại δ = 8,70 ppm đặc trưng cho 2 proton của 2 nhóm –OH phenol. - Đáng chú ý là, trên phổ quan sát thấy tín hiệu tại δ = 5,72 ppm. Tín hiệu này gây ra bởi hiện tượng hỗ biến ceto-enol, ứng với proton dạng enol (=CH-O) của C4. Tuy nhiên, tín hiệu này không cho giá trị số lượng proton tròn 1, do chỉ có một tỷ lệ phần trăm sản phẩm nhất định ở dạng hỗ biến ceton-enol, phần còn lại tồn tại ở dạng diceton. Proton dạng ceto (-CH2) của carbon này cho tín hiệu tại δ = 3,68 ppm. Điều này cũng phù hợp với kết quả phổ IR đã phân tích ở trên.
Kết quả phân tích các phổ IR, MS, 1H-NMR cho phép chúng tôi khẳng định sản phẩm thu được là tetrahydrocurcumin (1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)heptan- 3,5-dion).
3.5.2. Về tác dụng sinh học
THC thu được sau khi khử hóa vẫn giữ được hoạt tính chống oxy hóa của curcumin, thậm chí tác dụng còn tốt hơn.
So sánh tác dụng dọn các gốc tự do của THC bán tổng hợp được so với curcmin và vitamin C, kết quả như sau:
- THC có tác dụng dọn gốc tự do DPPH tốt hơn curcumin và vitamin C. IC50
của THC là 23,66 µg/ml, thấp hơn so với curcumin và vitamin C (IC50 của curcumin là 34,86 µg/ml [30], IC50 của vitamin C là 48,38 µg/ml [16]).
- THC có tác dụng dọn gốc tự do SOD kém hơn curcumin và vitamin C. IC50
của THC là 30,01 µg/ml, cao hơn so với curcumin và vitamin C (IC50 của curcumin là 6,25 µg/ml [27], IC50 của vitamin C là 4,25 µg/ml [16]). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Vì điều kiện chưa cho phép nên chúng tôi không tiến hành thử đồng thời tác dụng của curcumin và vitamin C, mà chỉ so sánh với các tài liệu đã công bố.
Kết quả so sánh trên chỉ là tương đối, vì các thí nghiệm đánh giá tác dụng dọn gốc tự do trên không tiến hành trong cùng điều kiện.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
- Đã bán tổng hợp được tetrahydrocurcumin từ curcumin ở quy mô phòng thí nghiệm với hai tác nhân khử hóa là khí hydro có xúc tác Pd/C 5% và kẽm trong môi trường acid, lựa chọn được một số điều kiện phản ứng thích hợp. Phản ứng khử hóa curcumin với tác nhân H2/Pd(C) cho hiệu suất tốt nhất khi thực hiện phản ứng trong dung môi ethanol tuyệt đối, tỷ lệ xúc tác là 5%, trong thời gian 18h (Hpư = 65,32%). Phản ứng khử hóa curcumin với tác nhân là kẽm trong môi trường acid cho hiệu suất tốt nhất khi thực hiện phản ứng với acid hydrocloric 20% ở nhiệt độ phòng, tỷ lệ số mol Zn/HCl là 18/1 (Hpư = 60,37%).
- Đã thử tác dụng chống oxy hóa của THC bán tổng hợp được, kết quả cho thấy THC có tác dụng dọn gốc tự do DPPH tốt (IC50 = 23,66 µg/ml), và tác dụng dọn gốc tự do SOD tốt (IC50 = 30,01 µg/ml).
2. Kiến nghị
Trên đây chỉ là những nghiên cứu khảo sát bước đầu chúng tôi thực hiện để lựa chọn phương pháp thích hợp nhất có thể ứng dụng cho sản xuất ở quy mô công nghiệp. Để tiếp tục phát triển các nghiên cứu đã đạt được, chúng tôi có một số kiến nghị sau:
- Tiếp tục nghiên cứu khảo các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng như: khảo sát với các tác nhân khử khác như nhôm, sắt, thiếc trong môi trường acid. Khảo sát ảnh hưởng cúa các yếu tố như dung môi, nhiệt độ, thời gian phản ứng để nâng cao hiệu suất phản ứng.
- Nghiên cứu tinh chế sản phẩm bằng phương pháp kết tinh, đơn giản, ít tốn kém hơn.
- Tiếp tục nghiên cứu phương pháp thích hợp để bán tổng hợp tetrahydrocurcuminoids từ hỗn hợp curcuminoids được chiết xuất từ cây nghệ trong nước, tiến tới chủ động nguồn nguyên liệu tetrahydrocurcumin cho sản xuất trong nước.
Tiếng Việt
1. Trần Mạnh Bình, Nguyễn Quang Đạt (2007), Hóa học hữu cơ, Tập I, Nhà
xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 319 - 323.
2. Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt Nam III, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, PL- 45.
3. Nguyễn Gia Chấn (2006), "Những công trình nghiên cứu 2003 - 2004 về tác dụng của curcumin", Tạp chí Dược liệu, 11(2), tr. 88 - 95.
4. Đào Hùng Cường, Lê Hải Lợi (2006), "Nghiên cứu phản ứng amin hóa β - diceton của curcumin", Hóa học & Ứng dụng, 2(50).
5. Bùi Vũ Dũng (2011), Cải tiến phương pháp chiết xuất curcuminoids từ củ Nghệ vàng, Luận văn thạc sĩ dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội.
6. Vũ Đình Hoàng, Hoàng Xuân Tiến, Trần Khắc Vũ (2011), "Phương pháp đơn giản tổng hợp các tetrahydrocurcuminoid", Tạp chí Khoa học và Công nghệ các trường đại học kỹ thuật.
7. Vũ Mạnh Hùng (2007), "Một số tác dụng dược lý của curcumin trên thực nghiệm", Tạp chí Dược học, 375.
8. Nguyễn Đình Luyện (2009), Kỹ thuật hóa dược, tập I, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr. 94 - 111.
Tiếng Anh
9. Akram M., et al. (2010), "Curcuma longa and curcumin: A review article",
Rom. J. Biol. - Plant Biol., 55(2), pp. 65 - 70.
10. Alegrio L.V., et al. (2002), Arzneimittel-Forschung/Drug Research, 52(2),
pp. 120 - 124.
11. Changtam C., et al. (2010), European Journal of Medicinal Chemistry,
45(3), pp. 945 - 956.
12. Hoehle S.I., et al. (2006), "Metabolism of curcuminoids in tissue slices and subcellular fraction from rat liver", J. Agric. Food Chem., 54, pp. 756 - 764. 13. Ivan S. (2004), "Curcumin", Chemical and Technical Assessment.
14. Jayaprakasha G.K., et al. (2005), "Chemistry and biological activitives of C. longa", Trends in Food Science & Technology, 16, pp. 533 - 548.
15. Kaehler M., et al. (2004), "Novel curcumin/tetrahydrocurcumin derivatives for using in cosmetics, pharmaceuticals and for nutrition", The Unites States (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Patent and Trademark Office.
16. Ko H.J., et al. (2009), "Antioxidant and Antiradical Activities of Wu Ling Shenin a Cell Free System", The American Journal of Chinese Medicine,