Phương pháp này trên thế giới chưa có tác giả nào công bố. Tại Việt Nam, Trần Khắc Vũ và cộng sự đã tiến hành khử hóa curcuminoid thành tetrahydrocurcuminoid với tác nhân là kẽm, trong sự có mặt của muối NiCl2.
Việc tổng hợp các tetrahydrocurcuminoid được mô tả ở sơ đồ dưới đây:
R1 HO R2 OH O OH R1 R2 1 OCH3 OCH3 2 OCH3 H 3 H H R1 HO R2 OH O O Zn-NiCl2 EtOH/H20 Siêu âm R1 R2 1' OCH3 OCH3 2' OCH3 H 3' H H
Hỗn hợp curcuminoid được phân lập bằng phương pháp sắc ký cột silicagel với hệ dung môi rửa giải dicloromethan: methanol tăng dần từ 100:0 đến 90:10, thu được curcumin (1), demethoxycurcumin (2) và bisdemethoxycurcumin (3).
Ở sơ đồ trên, các curcuminoid (1, 2, và 3) được hòa tan trong hệ dung môi
(ethanol: nước), sau đó hòa tan muối NiCl2 và cuối cùng bột kẽm được cho vào từ từ, đồng thời tiến hành siêu âm. Theo dõi quá trình phản ứng cho thấy, trong khoảng 30 phút đầu, khí hydro mới sinh thoát ra mạnh và sau khoảng thời gian này các curcuminoid dần dần bị mất màu, chuyển hóa thành các tetrahydrocurcuminoid. Quá trình chuyển hóa được kiểm tra bằng SKLM, hệ dung môi n-hexan: ethylaxetat. Để tránh bột kẽm nhanh bị ngộ độc bề mặt vì nhiều lý do dẫn đến mất hoạt tín, lượng kẽm được cho vào thành nhiều đợt trong khoảng thời gian 30 phút. Hiệu suất quá trình khử hóa các curcuminoid thành các tetrahydrocurcuminoid cao nhất là 82% đối với curcumin trong thời gian 2 giờ với tỷ lệ mol của curcumin: Zn: NiCl2 là 1: 6: 1,5. Cấu trúc của sản phẩm được khẳng định bởi phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR. Cơ chế chính xác của quá trình khử hóa này vẫn
chưa rõ. Tuy nhiên các công bố chỉ ra vai trò quan trọng của NiCl2 trong việc hoạt hóa bột kẽm để giải phóng hydro mới sinh dưới tác dụng của năng lượng siêu âm, còn sự có mặt của nước giúp hòa tan tốt hơn muối NiCl2 [6].
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU
Khóa luận đã sử dụng nguyên liệu là curcumin được chiết xuất và tinh chế tại phòng thí nghiệm Chiết xuất – Bộ môn Công nghiệp Dược.
Khóa luận cũng sử dụng các nguyên vật liệu, hóa chất, dụng cụ, thiết bị của phòng thí nghiệm Tổng hợp Hóa dược – Bộ môn Công nghiệp Dược, bao gồm:
Bảng 2.1. Danh mục các nguyên liệu
STT Nguyên liệu Nguồn gốc
1 Acid acetic Merck
2 Acid hydrocloric Trung Quốc
3 Acid sulfuric Trung Quốc
4 Dicloromethan Trung Quốc
5 Ethanol Trung Quốc
6 Ethyl acetat Trung Quốc
7 n-Hexan Trung Quốc
8 Kẽm bột Trung Quốc
9 Methanol Trung Quốc
10 Natri carbonat Trung Quốc
11 Natri sulfat Trung Quốc
12 Nước cất Việt Nam
13 Palladium -carbon 5% Sigma-Aldrich
14 Silicagel 60 GF254 Merck
2.2. DỤNG CỤ, THIẾT BỊ Bảng 2.2. Danh mục các dụng cụ, thiết bị. Bảng 2.2. Danh mục các dụng cụ, thiết bị. STT Thiết bị, dụng cụ Xuất xứ 1 Bản mỏng silicagel GF254 Đức 2 Bình chiết 250 mL Đức 3 Bình cầu 1 cổ, 2 cổ, 3 cổ 50mL, 100mL, 250mL Đức 4 Bộ lọc hút chân không Buchner Trung Quốc
5 Bình sắc ký Trung Quốc
6 Cân kỹ thuật Sartorius BP 2001S, độ nhạy 10-2 Thụy Sĩ
7 Cốc có mỏ 100mL Đức
8 Cột sắc ký Đức
9 Giấy lọc Việt Nam
10 Đĩa petri Trung Quốc
11 Máy cấy quay chân không Buchi B480 Thụy Sĩ 12 Máy đo nhiệt động nóng chảy EZ-Melt Mỹ
13
Máy đo phổ hồng ngoại GX-Perkin Elmer (Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam)
Mỹ
14
Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H- NMR) Bruker AV-500 (Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam)
Mỹ
15
Máy đo phổ khối lượng 1100 Series LC/MSD Trap (Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam)
Mỹ
16 Máy khuấy từ có bộ phận gia nhiệt IKA Đức
17 Máy sấy đèn hồng ngoại Đức
18 Máy sinh khí nitơ Đức
20 Ống đong 25mL, 50mL, 100mL Trung Quốc
21 Ống nghiệm Trung Quốc
22 Pipet chia vạch 1mL, 5mL, 10mL Trung Quốc
23 Quả bóp cao su Đức
24 Tủ sấy Memmert Đức
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Bán tổng hợp tetrahydrocurcumin từ curcmin theo sơ đồ sau:
H3CO HO OCH3 OH O O H3CO HO OCH3 OH [H] Tetrahydrocurcumin Curcumin O O
Tiến hành phản ứng khử hóa curcumin với hai tác nhân khử khác nhau là khí hydro có xúc tác Pd/C 5% và kẽm trong môi trường acid.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng.
Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM với hệ dung môi thích hợp và đo nhiệt độ nóng chảy.
Xác định cấu trúc sản phẩm bán tổng hợp được bằng cách đo phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR).
Thử tác dụng chống oxy hóa của sản phẩm bán tổng hợp được bằng phương pháp DPPH và phương pháp SOD.
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.4.1. Bán tổng hợp hóa học 2.4.1. Bán tổng hợp hóa học
Bán tổng hợp tetrahydrocurcumin từ curcumin bằng phản ứng khử hóa với hai tác nhân khử là khí hydro có xúc tác Pd/C 5% và kẽm trong môi trường acid. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng. Sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) với bản mỏng silicagel GF254 Merck 70-230 mesh và hệ dung môi thích hợp, quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm để theo dõi tiến triển của phản ứng.
Tinh chế sản phẩm: bằng phương pháp sắc ký cột silicagel với hệ dung môi thích hợp.
2.4.2. Kiểm tra độ tinh khiết
Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM trên bản mỏng silicagel GF254 Merck 70-230 mesh với hệ dung môi thích hợp, quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm.
Đo nhiệt độ nóng chảy trên máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt.
2.4.3. Xác định cấu trúc
Dựa trên các kết quả phân tích phổ IR, MS, 1H-NMR.
Phổ hồng ngoại (IR):
Phổ hồng ngoại được ghi tại Phòng phân tích cấu trúc phân tử, Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, các chất được ghi trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật viên nén KBr ghi trong vùng 4000 - 400cm-1. Các mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ khoảng 1: 200 rồi ép dưới dạng film mỏng dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm.
Phổ khối lượng (MS):
Được ghi theo phương pháp ESI tại Phòng Phân tích cấu trúc phân tử, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trên máy đo phổ khối lượng 1100 S1100 Series LC/MSD Trap.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR):
Được ghi trên máy Bruker AV-500 tại Phòng Phân tích cấu trúc phân tử, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.4.4. Thử tác dụng sinh học
Thử tác dụng chống oxy hóa: Đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH (phương pháp DPPH) và đánh giá tác dụng dọn gốc tự do superoxid (phương pháp SOD), được thực hiện tại Bộ môn Dược lực – Trường Đại học Dược Hà Nội.
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. BÁN TỔNG HỢP HÓA HỌC
Khóa luận đã thực hiện bán tổng hợp tetrahydrocurcumin từ curcumin bằng phản ứng khử hóa với hai tác nhân khử là khí hydro có xúc tác Pd/C 5% và kẽm trong môi trường acid.
3.1.1. Phản ứng khử hóa với tác nhân khử là khí hydro có xúc tác Pd/C 5%
Sơ đồ phản ứng: H3CO HO OCH3 OH O O H3CO HO OCH3 OH H2/Pd/C Tetrahydrocurcumin Curcumin O O Tiến hành phản ứng:
Hoạt hóa xúc tác: Cho xúc tác Pd/C 5% vào bình cầu ba cổ đáy tròn dung tích 250 ml, thêm 20 ml dung môi, khuấy từ ở nhiệt độ khoảng 0-5oC trong 5 phút, đồng thời sục khí nitơ để đuổi hết không khí trong bình phản ứng. Hòa tan 1,00 g curcumin (2,71 mmol) trong 100 ml dung môi, cho dung dịch thu được vào bình phản ứng trên. Tiếp tục khuấy hỗn hợp ở nhiệt độ phòng, đồng thời sục khí hydro liên tục trong quá trình phản ứng ở áp suất khí quyển. Theo dõi hỗn hợp phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi dicloromethan: methanol = 20:1 để xác định thời gian phản ứng thích hợp.
Xử lý phản ứng:
Hỗn hợp phản ứng đem lọc hút chân không để loại bỏ xúc tác. Dịch lọc đem cất loại dung môi bằng máy cất quay chân không ở nhiệt độ khoảng 50oC. Tinh chế sản phẩm bằng phương pháp sắc ký cột silica gel với hệ dung môi dicloromethan: methanol = 20:1.
Các bước tiến hành sắc ký cột:
Bước 1: Chuẩn bị
- Cân 100,00 g silicagel, ngâm trong pha động trong khoảng 30 phút.
- Cột rửa sạch, sấy khô, cho bông và giấy lọc vào đáy, kẹp thẳng góc trên giá.
- Cho dung môi đến khoảng nửa chiều cao cột, mở van, từ từ nhồi liên tục silicagel vào cột cho đến hết lượng silicagel cần nhồi, đồng thời gõ nhẹ để nén các lớp silicagel. Chú ý không để mực dung môi xuống thấp hơn mực silicagel để tránh hiện tượng khô cột.
- Cho một miếng giấy lọc lên trên bề mặt lớp silicagel
Bước 3: Đưa chất phân tích vào cột
- Hòa tan cắn sản phẩm thô vào một lượng tối thiểu dung môi pha động. - Hạ mực dung môi trong cột xuống ngang mực giấy lọc, rồi nạp hết dung dịch chất phân tích vào cột.
Bước 4: Triển khai cột
- Cho dung môi rửa giải chạy qua cột, hứng các phân đoạn có thể tích khoảng 20-30 ml.
- Các phân đoạn được cất quay chân không để loại bớt dung môi, sau đó kiểm tra bằng SKLM với hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH = 20:1.
Bước 5: Thu hồi các phân đoạn
- Các phân đoạn có kết quả SKLM giống nhau được gộp lại, cất quay chân không, sấy khô và cân định lượng.
Khảo sát phản ứng:
Chúng tôi đã tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng, bao gồm dung môi phản ứng và tỷ lệ khối lượng xúc tác so với curcumin.
a. Khảo sát dung môi phản ứng
Tiến hành khảo sát với 3 dung môi là MeOH tuyệt đối, EtOH tuyệt đối và EtOH 96%.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất phản ứng bán tổng hơp tetrahydrocurcumin từ curcumin với tác nhân khử là H2/Pd/C
TT Dung môi phản ứng Tỷ lệ KL xt/curcumin (%) tpư (h) KL sp (g) Hpư (%) T o nc (oC)
1 MeOH tuyệt đối 10 12 0,65 64,33 95.0 – 98,0
2 EtOH tuyệt đối 10 12 0,62 61,36 95,0 – 98,0
3 EtOH 96% 10 12 0,59 58,39 95,0 – 98,5
Nhận xét:
- Với cả ba dung môi sử dụng, nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm thu được đều phù hợp với nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm dự kiến (To
nc,THC = 95,0 – 97,0oC
[18]).
- Dung môi là EtOH 96% cho hiệu suất phản ứng thấp nhất (58,39%). Khi sử dụng dung môi là EtOH tuyệt đối cho hiệu suất phản ứng cao hơn (61,36%).
- Dung môi là MeOH tuyệt đối cho hiệu suất phản ứng cao nhất (64,33%). Tuy nhiên, MeOH lại độc hơn nhiều so với EtOH.
Từ các dữ liệu trên cho thấy dung môi EtOH có nhiều ưu điểm hơn, do đó EtOH tuyệt đối được chọn làm dung môi cho các phản ứng khảo sát tiếp theo.
b. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ xúc tác đến thời gian và hiệu suất phản ứng
Sau khi chọn được dung môi thích hợp cho phản ứng là EtOH tuyệt đối, tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ xúc tác đến thời gian và hiệu suất phản ứng. Tiến hành khảo sát với các tỷ lệ khối lượng xúc tác là 2%, 5%, 8% và 10% so với curcumin .
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ xúc tác đến thời gian và hiệu suất phản ứng bán tổng hợp tetrahydrocurcumin từ curcumin với tác nhân khử là H2/Pd/C
TT KL curcumin (g) KL xt (g) Tỷ lệ KL xt/curcumin (%) tpư (h) KL sp(g) Hpư (%) T o nc (oC) 1 1,00 0,02 2 24 0,57 56,41 95,0–98,0 2 1,00 0,05 5 18 0,66 65,32 95,0–98,0 3 1,00 0,08 8 15 0,63 62,35 96,0–98,5 4 1,00 0,10 10 12 0,62 61,36 96,0–98,0 Nhận xét:
- Nhiệt độ nóng chảy của các sản phẩm thu được từ các thí nghiệm khảo sát các tỷ lệ xúc tác khác nhau không có sự chênh lệch đáng kể.
- Khi tăng tỷ lệ xúc tác thì thời gian phản ứng giảm, hiệu suất phản ứng cũng thay đổi. Với tỷ lệ xúc tác là 2%, thời gian phản ứng là 24h, hiệu suất phản ứng là thấp nhất (56,41%). Hiệu suất phản ứng đạt được cao nhất là 65,32% khi tỷ lệ xúc tác là 5%, thời gian phản ứng là 18h. Tiếp tục tăng tỷ lệ xúc tác thì hiệu suất phản ứng giảm.
Từ các dữ liệu trên, chúng tôi lựa chọn tỷ lệ xúc tác là 5%, với thời gian phản ứng là 18h.
Từ các kết quả khảo sát trên đã thấy rằng, điều kiện thích hợp nhất cho phản ứng khử hóa curcumin với tác nhân là khí hydro có xúc tác Pd/C 5% là:
- Dung môi: Ethanol tuyệt đối - Tỷ lệ khối lượng xt/curcumin: 5% - Thời gian phản ứng: 18h.
3.1.2. Phản ứng khử với tác nhân là kẽm trong môi trường acid
Sơ đồ phản ứng: H3CO HO OCH3 OH O O H3CO HO OCH3 OH Zn/H+ Tetrahydrocurcumin Curcumin O O
Tiến hành phản ứng:
Hòa tan 1,00 g curcumin (2,71 mmol) vào 100 ml EtOH tuyệt đối trong bình cầu ba cổ đáy tròn dung tích 250 ml. Sục nitơ để đuổi hết không khí trong bình phản ứng, thêm acid vào bình phản ứng.
Cân bột kẽm, thêm từ từ vào hỗn hợp phản ứng thành nhiều đợt trong thời gian khoảng 30 phút. Khuấy hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng, duy trì pH acid trong suốt quá trình phản ứng. Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi ethyl acetat: n-hexan = 7:3 để xác định thời gian phản ứng thích hợp, so sánh với THC tinh khiết thu được ở phản ứng 1.
Xử lý phản ứng:
- Lọc loại kẽm dư
- Trung hòa dịch lọc bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa đến pH trung tính, lọc loại tủa.
- Dịch lọc đem cất loại bớt một phần dung môi, sau đó đem chiết với dicloromethan: Lần 1 chiết với 30ml dicloromethan, thêm 20ml nước cất. Lần 2 và 3, mỗi lần 30ml dicloromethan.
- Lớp dung môi hữu cơ được gộp lại, thêm 5,00g Na2SO4 khan, lắc đều, để yên khoảng 1h để loại nước. Sau đó lọc, dịch lọc đem cất loại dung môi bằng máy cất quay chân không ở nhiệt độ khoảng 40oC.
- Tinh chế sản phẩm bằng phương pháp sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n- hexan: ethyl acetat thay đổi từ 50:0 đến 1:1. Cách tiến hành sắc ký cột tương tự như đã trình bày ở mục 3.1.1.
Khảo sát phản ứng:
Chúng tôi đã tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng, bao gồm acid phản ứng, nồng độ acid và tỷ lệ mol Zn/curcumin.
a. Khảo sát acid
Tiến hành khảo sát với 3 acid là: acid acetic băng, acid hydrocloric 20% và acid sulfuric 10%.
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của acid đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp tetrahydrocurcumin từ curcumin với tác nhân khử là Zn/acid
TT Acid V acid (ml) KL kẽm (g) tpư (h) KL sp (g) Hpư (%) Tonc (oC) Ghi chú
1 Acid acetic băng 15 5 4 0 0
Không xuất hiện vết THC 2 Acid hydrocloric 20% 5 5 4 0,58 57,40 95,0-98,0 3 Acid sulfuric 10% 5 5 4 0,50 49,49 95,0-98,5 Nhận xét:
- Khi thực hiện phản ứng với acid acetic, kiểm tra hỗn hợp phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi ethyl acetat: n-hexan = 7:3 và so sánh với THC thu được ở phản ứng 1 thì trong hỗn hợp phản ứng không thấy xuất hiện vết THC.
- Thực hiện phản ứng với acid hydrocloric (H=57,40%) cho hiệu suất phản ứng