triển của Lactobacillus acidophilus
Mục tiêu
Đánh giá tác dụng của lactulose lên sự phát triển của L. acidophilus.
Xác định nồng độ thích hợp của lactulose.
Nguyên tắc
So sánh khả năng sinh trưởng, phát triển của Lactobacillus acidophilus khi được nuôi cấy trong các môi trường có sự thay đổi về nồng độ lactulose.
Tiến hành
Chuẩn bị môi trường MT1 với thành phần công thức được liệt kê tại mục 2.1.2, lactulose được bổ sung với các nồng độ: 0%, 0,25%, 0,5%, 1%, 2%, 3%. Phân phối môi trường vào các bình nón sạch có dung tích thích hợp, 45 mL/bình, nút kín. Tiến hành lên men chủng Lactobacillus acidophilus trong 6 bình nón trên theo mục 2.3.2. Sau 24h nuôi cấy, dịch nuôi cấy của 6 mẫu được đem đi đo pH (theo mục 2.3.3) và định lượng VSV theo phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch (theo mục 2.3.4). Các đĩa thạch được ủ trong tủ ấm CO2, nhiệt độ 37 oC trong 48h. Xác định số lượng khuẩn lạc trên các đĩa thạch. Tính số lượng VSV trong các mẫu (theo công thức nêu ở mục 2.3.4).
Tiến hành làm 3 lần, lấy kết quả trung bình.
Kết quả
Số lượng vi sinh vật (Lactobacillus acidophilus) và pH dịch nuôi cấy của 6 mẫu: MT1 và MT1 bổ sung lactulose với các nồng độ: 0,25%, 0,5%, 1%, 2%, 3% được báo cáo trong bảng 3.3.
n = 3
Số liệu ở bảng 3.3 cho thấy bổ sung lactulose với nồng độ 0,25% - 3% vào môi trường nuôi cấy có tác dụng kích thích rõ rệt sự sinh trưởng và phát triển của
Lactobacillus acidophilus. Điều đóthể hiện qua sự tăng số lượng VSV và sự giảm pH của dịch nuôi cấy.
Sự thay đổi số lượng VSV và pH dịch nuôi cấy khi thay đổi nồng độ lactulose bổ sung vào môi trường nuôi cấy Lactobacillus acidophilus được thể hiện trên hình 3.3.
Mẫu Số lượng VSV (cfu/ml) Tỉ lệ số lượng VSV so với mẫu MT1 pH MT1 7,20.108 1,0 3,93±0,049 MT1 + 0,25% lactulose 16,80.108 2,3 3,78±0,014 MT1 + 0,5% lactulose 22,00.108 3,1 3,77±0,014 MT1 + 1% lactulose 16,60.108 2,3 3,75±0,028 MT1 + 2% lactulose 14,00.108 1,9 3,74±0,021 MT1 + 3% lactulose 11,60.108 1,6 3,75±0,035
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của sự bổ sung lactulose vào môi trường nuôi cấy
Kết quả ở bảng 3.3 và hình 3.3 cho thấy, số lượng VSV tăng rõ rệt khi bổ sung lactulose vào môi trường nuôi cấy. Ở môi trường MT1 (không bổ sung lactulose), số lượng VSV đạt 7,20.108
cfu/ml. Con số này tăng lên 16,80.108 cfu/ml khi bổ sung 0,25% lactulose và đạt tới 22,00.108 cfu/ml khi bổ sung 0,5% lactulose, gấp 3,1 lần số lượng VSV thu được ở môi trường nuôi cấy thông thường. Khi tiếp tục tăng nồng độ lactulose bổ sung, số lượng VSV giảm dần và còn 11,60.108 cfu/ml khi nồng độ lactulose bổ sung là 3%. Như vậy, với các nồng độ khảo sát thì bổ sung lactulose ở nồng độ 0,5%, số lượng VSV thu được trong dịch nuôi cấy là cao nhất và sự tăng số
7.20 16.80 22.00 16.60 14.00 11.60 3.93 3.78 3.77 3.75 3.74 3.75 3.56 3.62 3.68 3.74 3.80 3.86 3.92 3.98 4.04 4.10 4.16 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 0 0.25 0.5 1 2 3 cfu/m l Số lượng VSV (.10 8 cfu/m l) nồng độ lactulose bổ sung Số lượng VSV pH
Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn biến thiên số lượng vi sinh vật và pH dịch nuôi cấy khi
lượng VSV khá đáng kể (tăng gấp 3,1 lần so với nuôi cấy trong môi trường thông thường).
Đồng thời, quan sát biểu đồ 3.3 nhận thấy, sự thêm lactulose gây giảm pH rõ rệt ở tất cả các mẫu bổ sung khi so sánh với mẫu không bổ sung (giá trị pH giảm nhanh từ 3,93 xuống còn khoảng 3,74 – 3,78). Tuy nhiên giá trị pH đo được của các mẫu bổ sung lactulose không khác nhau nhiều khi nồng độ lactulose thay đổi, chỉ dao động trong khoảng 3,74 – 3,78.
Kết quả thu được cho thấy lactulose thật sự có tác dụng tốt với Lactobacillus acidophilus. Số lượng VSV trong dịch nuôi cấy đạt giá trị cao nhất ở nồng độ lactulose bổ sung là 0,5%. Tại nồng độ này, giá trị pH giảm đáng kể so với mẫu không bổ sung lactulose. Như vậy trong các nồng độ khảo sát, nồng độ lactulose bổ sung là 0,5% cho tác dụng tốt nhất với sự sinh trưởng và phát triển của Lactobacillus acidophilus. So với inulin (thí nghiệm tiến hành ở 3.1.1), rõ ràng lactulose có hiệu quả rõ rệt. Kết quả thu được của khóa luận cũng tương tự với các báo cáo của Salminen [61], Kontula [37] và nghiên cứu của D. Özer, S. Akin và B. Özer trên Lactobacillus acidophilus LA–5 trong sữa chua phối hợp Acidophilus-Bifidus [48]. Tuy nhiên trong môi trường nước sữa, báo cáo của Bojan Matijević và các cộng sự lại chỉ ra lactulose không có tác dụng rõ rệt đối với quá trình lên men cũng như sự tồn tại của Lactobacillus acidophilus LA–5 [13]. Như vậy, không chỉ chủng giống mà môi trường cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả kết hợp của probiotics/prebiotics. Ngoài ra, lactulose còn có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của một số loài Lactobacillus khác như: L. casei, L. zeae,... [21].
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ lactulose lên khả năng sinh trưởng, phát
triển của Bifidobacterium longum
Mục tiêu
Đánh giá tác dụng của lactulose lên sự phát triển của B. longum.
Xác định nồng độ thích hợp của lactulose.
Nguyên tắc
So sánh khả năng sinh trưởng, phát triển của Bifidobacterium longum khi được nuôi
cấy trong các môi trường có sự thay đổi về nồng độ lactulose.
Tiến hành
Chuẩn bị môi trường MT3 với thành phần công thức được liệt kê tại mục 2.1.2, lactulose được bổ sung với các nồng độ: 0%, 0,25%, 0,5%, 1%, 2%, 3%. Phân phối môi trường vào các bình nón sạch có dung tích thích hợp, 45 mL/bình, nút kín. Tiến hành lên men chủng Bifidobacterium longum trong 6 bình nón trên theo mục 2.3.2. Sau 48h nuôi cấy, dịch nuôi cấy của 6 mẫu được đem đi đo pH (theo mục 2.3.3) và định lượng VSV theo phương pháp đo mật độ quang (theo mục 2.3.5) với mẫu trắng là các ống nghiệm chứa các môi trường đã chuẩn bị ở trên.
Tiến hành làm 3 lần, lấy kết quả trung bình.
Kết quả
Số lượng vi sinh vật (Bifidobacterium longum) và pH dịch nuôi cấy của 6 mẫu: MT3 và MT3 bổ sung lactulose với các nồng độ: 0,25%, 0,5%, 1%, 2%, 3% được báo cáo trong bảng 3.4.
Sự thay đổi mật độ quang và pH dịch nuôi cấy khi thay đổi nồng độ lactulose bổ sung vào môi trường nuôi cấy Bifidobacterium longum được thể hiện trên hình 3.4.
n = 3
Mẫu pH Mật độ quang Tỉ lệ mật độ quang so
với mẫu MT3 MT3 4,44±0,014 0,246±0,0064 1,0 MT3 + 0,25% lactulose 4,34±0,028 0,380±0,0566 1,5 MT3 + 0,5% lactulose 4,31±0,007 0,427±0,0488 1,7 MT3 + 1% lactulose 4,24±0,021 0,488±0,0071 2,0 MT3 + 2% lactulose 4,19±0,044 0,476±0,0436 1,9 MT3 + 3% lactulose 4,16±0,015 0,549±0,0495 2,2
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của sự bổ sung lactulose vào môi trường nuôi cấy
lên khả năng sinh trưởng, phát triển của B. longum
0.246 0.380 0.427 0.488 0.476 0.549 4.44 4.34 4.31 4.24 4.19 4.16 4.06 4.12 4.18 4.24 4.30 4.36 4.42 4.48 4.54 4.60 4.66 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 0.25 0.5 1 2 3 pH Mật độ quang nồng độ lactulose bổ sung (%) Mật độ quang pH
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn biến thiên pH và mật độ quang dịch nuôi cấy
Kết quả ở bảng 3.4 và hình 3.4 cho thấy, bổ sung lactulose vào môi trường nuôi cấy có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của Bifidobacterium longum BB536. Điều đó thể hiện qua sự tăng mật độ quang và sự giảm pH của dịch nuôi cấy. Đồng thời từ số liệu thu được có thể thấy mối tương quan giữa sự thay đổi của giá trị mật độ quang và pH của dịch nuôi cấy khi bổ sung inulin với các nồng độ khác nhau.
Ở môi trường không bổ sung lactulose, mật độ quang đo được là 0,246. Khi bổ sung lactulose với các nồng độ tăng dần từ 0,25% cho đến 3%, mật độ quang cũng tăng dần và đạt giá trị cao nhất là 0,549 ở mẫu bổ sung 3% lactulose. Giá trị này cao gấp 2,2 lần giá trị mật độ quang đo được ở môi trường nuôi cấy không bổ sung lactulose. Như vậy, trong các nồng độ khảo sát, bổ sung inulin với nồng độ 3% vào môi trường nuôi cấy B. longum cho kết quả tốt nhất.
Đồng thời số liệu thu được cũng cho thấy sự giảm pH rõ rệt khi bổ sung lactulose vào môi trường nuôi cấy B. longum. pH đo được ở môi trường không bổ sung lactulose là 4,44 và con số này giảm dần khi tăng nồng độ lactulose bổ sung. Giá trị pH thấp nhất đo được là 4,16 ở môi trường bổ sung 3% lactulose.
Sự tăng dần của giá trị mật độ quang cũng như sự giảm dần của giá trị pH dịch nuôi cấy thể hiện tác dụng kích thích của lactulose lên sự sinh trưởng và phát triển của
Bifidobacterium longum BB536. Trong đó bổ sung lactulose với nồng độ 3% cho kết quả tốt nhất trong các nồng độ khảo sát. Tại nồng độ này, giá trị mật độ quang đo được là cao nhất và giá trị pH xác định được là thấp nhất. Như vậy cùng với inulin, lactulose cũng là một lựa chọn thích hợp để tạo thành một cặp prebiotics/probiotics tiềm năng với Bifidobacterium longum. Nghiên cứu của Thuy Thi Pham và Nagendra P. Shah tiến hành trên B. longum 20099 và B. animalis subsp. lactis BB12 trong môi trường sữa đậu nành [70] cũng cho kết quả tương tự khóa luận. Trong khi đó báo cáo của Bojan Matijević và các cộng sự lại khẳng định lactulose không có tác dụng rõ rệt đối với quá trình lên men của B. animalis subsp. lactis BB12 khi nghiên cứu trên môi trường nước
sữa [13]. Theo quan điểm của chúng tôi, sự khác nhau này có thể do ảnh hưởng từ sự khác nhau của môi trường nuôi cấy.
3.2.3. Bàn luận
Từ các kết quả thu được, có thể thấy lactulose thực sự có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của cả Lactobacillus acidophilus ATCC 4653 và
Bifidobacterium longum BB536. Tác dụng thể hiện trên L. acidophilus tốt hơn so với
B. longum. Trong các nồng độ khảo sát, nồng độ lactulose bổ sung tốt nhất cho quá trình lên men của L. acidophilus và B. longum tương ứng là 0,5% và 3%. Tại các nồng độ này, số lượng L. acidophilus cao gấp 3,1 lần và mật độ quang của dịch nuôi cấy B. longum cao gấp 2,2 lần so với mẫu không bổ sung lactulose. Từ các thí nghiệm trên nhận thấy lactulose thích hợp với cả 2 loài L. acidophilus và B. longum cho vai trò prebiotics và sự kết hợp đó cho chúng ta 2 cặp probiotics/prebiotics tiềm năng là
Lactobacillus acidophilus/lactulose và Bifidobacterium longum/lactulose. Dựa trên các kết quả thu được, nghiên cứu góp phần khẳng định giá trị của các sản phẩm synbiotics với sự kết hợp của 2 cặp probiotics/prebiotics này.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
I. Kết luận
Khi bổ sung inulin và lactulose với các nồng độ 0,25% - 3% vào môi trường nuôi cấy Lactobacillus acidophilus ATCC 4653 và Bifidobacterium longum BB536, đề tài đã thu được các kết quả như sau:
1. Inulin không thể hiện tác dụng rõ rệt đối với L. acidophilus nhưng lại kích thích tốt sự phát triển của B. longum. Bổ sung inulin với nồng độ 3% vào môi trường nuôi cấy B. longum cho kết quả tốt nhất trong các nồng độ khảo sát. Như vậy, B. longum/inulin thực sự là một cặp probiotics/prebiotics tiềm năng cho sản xuất các dạng chế phẩm synbiotics.
2. Lactulose kích thích tốt quá trình lên men của cả hai loài này. Trong các nồng độ khảo sát, nồng độ lactulose thích hợp nhất tương ứng với L. acidophilus và B. longum là 0,5% và 3%. Như vậy, L. acidophilus/lactulose và B. longum/lactulose cũng là 2 cặp probiotics/prebiotics tiềm năng cho sản xuất các dạng chế phẩm synbiotics.
II. Đề xuất
Vì thời gian có hạn nên khóa luận chưa đề cập được hết những vấn đề có liên quan. Do đó chúng tôi đề xuất một số hướng phát triển nghiên cứu như sau:
1. Nghiên cứu ảnh hưởng của inulin và lactulose lên sự sinh trưởng và tồn tại của L. acidophilus và B. longum trong môi trường giả ruột.
2. Nghiên cứu tạo pellet synbiotics từ các cặp L. acidophilus/lactulose, B. longum/inulin, B. longum/lactulose.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. PGS. TS. Trần Tử An (2007), Hóa phân tích tập 1, Nhà xuất bản y học, Hà Nội. 2. Nguyễn Lân Dũng (2000), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo dục, Việt Nam,
tr. 221-228.
3. Trịnh Thị Phương Dung (2014), Xây dựng quy trình xác định (định tính, định lượng) Bifidobacterium longum trong các chế phẩm probiotics, luận văn thạc sĩ, trường Đại học Dược Hà Nội.
4. Hà Thị Thanh Huyền (2014), Nghiên cứu sử dụng alginat làm chất bảo vệ trong quá trình đông khô Lactobacillus acidophilus, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, trường Đại học Dược Hà Nội.
5. Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành (2006), Công nghệ sinh học, Nhà xuất bản giáo dục, tr. 129-154.
Tiếng Anh
6. Aamir G. Khan, Alfred Gangl, Justus Krabshuis (2009), "World Gastroenterology Organisation practice guideline: Probiotics and prebiotics", Arab J Gastroenterol, 10(1), pp. 33-42.
7. Aider M, De Halleux D. (2007), "Isomerization of lactose and lactulose production: review",Trends Food Sci Technol, 18, pp. 356–64.
8. Amenta M. Cascio M. T., Di Fiore P., Venturini I. (2006), "Diet and chronic constipation. Benefits of oral supplementation with symbiotic zir fos (Bifidobacterium longum W11 + FOS Actilight)", Acta Biomed, 77(3), pp. 157- 62.
9. Ana M.P. Gomes, F. Xavier Malcata (1999), "Bifidobacterium spp. and
Lactobacillus acidophilus: biological, biochemical, technological and therapeutical properties relevant for use as probiotics", Trends in Food Science & Technology, 10, pp. 139-157.
10. Bahaka D., Neut C., Khattabi A., Monget D., Gavini F. (1993), "Phenotypic and genomic analyses of human strains belonging or related to Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, and Bifidobacterium breve", Int J Syst Bacteriol, 43(3), pp. 565-73.
11. Berg R. D. (1998), "Probiotics, prebiotics or conbiotics", Trends in Microbiology, 6, pp. 89-92.
12. Beringer A., Wenger R. (1995), "Inulin in der erna¨ hrung des diabetikers", Dtsch. Z. Verdauungs Stofwechselkrankh, 15, pp. 268-272.
13. Bojan Matijević, Rajka Božanić (2009), "The influence of lactulose on growth and survival of probiotic bacteria Lactobacillus acidophilus La-5 and
Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 in reconstituted sweet whey", Mljekarstvo, 59(1), pp. 20-27.
14. Brighenti F., Casiraghi M. C., Ferrari A. Canzi E., Testolin G. (1995), "One month consumption of ready-to-eat breakfast cereal containing inulin mark-edly lowers serum lipids in normolipidemic men", 7th European Nutrition Conference, May 24 –28, Vienna, Austria.
15. Carlos Ricardo Soccol, Luciana Porto De Souza Vandenberghe, Michele Rigon Spier, Adriane Bianchi Pedroni Mederios, Caroline Tiemi Yamaguishi (2010),
The potential of probiotics, Brazil and Indian, pp. 413-434.
16. Chen He, Hu Man, Shu Guowei (2011), "Effect of prebiotics on growth of
Bifidobacterium bifidum", International Conference on Human Health and Biomedical Engineering, pp. 981-984.
17. Coudray C., Bellanger J., Castiglia-Delavaud C., Re´Me´ S C., Vermorel M., Rayssignuier Y (1997), "Effect of soluble or partly soluble dietary fibres supplementation on absorption and balance of calcium, magnesium, iron and zinc in healthy young men",Eur. J. Clin. Nutr, pp. 375–380.
18. Crittenden Rg, Playne Mj (1996), "Production, properties and applications of food-grade oligosaccharides",Trends Food Sci Technol, 7, pp. 353–61.
19. Deleenheer L., Hoebregs H. (1994), "Progress in the elucidation of the composition of chicory inulin",Starch, 46, pp. 193.
20. Delzenne N., Roberfroid M. (1994), "Physiological effects of non-digestible oligosaccharides",Technol, pp. 1–6.
21. Desai A. R., Powell I. B., Shah N. P. (2004), "Survival and activity of probiotic
lactobacilli in skim milk containing prebiotics", J. Food. Sci, 69, pp. FMS57–
FMS60.
22. Dimitris Charalampopoulos, Robert Rastall, Springerlink (2009), Prebiotics and probiotics science and technology, Vol. 1, Springer.
23. Dirk Haller, Jean-Michel Antoine, Stig Bengmark, Paul Enck, Ger T. Rijkers (2010), "Guidance for substantiating the evidence for beneficial effects of probiotics: Probiotics in chronic inflammatory bowel disease and the functional disorder irritable bowel syndrome", The Journal of Nutrition, 140, pp. 690S– 697S.
24. Djouzi Z., Andrieux C. (1997), "Compared effects of three oligosaccharides on metabolism of intestinal microflora in rats inoculated with a human faecal flora",Br. J. Nutr, 78, pp. 313–324.
25. Ewa Wasilewska, Maria Bielecka, Lidia Markiewicz (2003), "Numerical analysis of biochemical and morphological features of bifidobacteria as a tool
for species characteristic and identification", Polish Journal of Food and
