Pha các môi trường MT1 (đối với Lactobacillus acidophilus) hoặc MT3 (với
Bifidobacterium longum) với thành phần công thức được liệt kê tại mục 2.1.2. Phân phối môi trường vào bình nón sạch có dung tích thích hợp, nút kín. Tiệt khuẩn môi trường tại 115oC/20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn. Để nguội xuống nhiệt độ phòng. Cấy giống với tỉ lệ 10% vào bình nón trên trong tủ cấy vô trùng. Ủ trong tủ ấm 5% CO2 trong 24h (đối với Lactobacillus acidophilus) hoặc 48h (đối với Bifidobacterium longum) ở nhiệt độ 37oC [3], [4].
2.3.3. Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch
Pha môi trường MT2 với thành phần công thức được liệt kê tại mục 2.1.2. Phân phối môi trường vào bình nón sạch có dung tích thích hợp, nút kín. Tiệt khuẩn ở 115oC/20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn. Phân phối môi trường vào các đĩa petri đã được rửa sạch, hấp tiệt khuẩn và sấy khô, 20mL/đĩa, sao cho mặt thạch nhẵn, phẳng. Đợi thạch nguội và đông rắn lại, đậy kín.
Pha dung dịch pepton 0,1%. Phân phối dung dịch đã pha vào các ống nghiệm sạch, 9ml/ống, nút kín. Tiệt khuẩn ở 115oC/20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn. Để nguội xuống nhiệt độ phòng.
Xác định số lượng VSV trong 1ml dịch nuôi cấy.
Hút chính xác 1mL hỗn dịch sinh khối pha vào ống nghiệm pepton 0,1% thứ nhất, lắc đều. Hút chính xác 1mL dịch đã được đồng nhất trong ống nghiệm thứ nhất pha loãng sang ống nghiệm thứ 2, lắc đều. Tiếp tục pha loãng như vậy cho tới nồng độ pha loãng cuối cùng (trong thí nghiệm này là 10-6, 10-7, 10-8). Cấy trải lên mỗi đĩa petri 0,5ml dịch trong các ống pha loãng ở trên (làm trên 3 nồng độ cuối, mỗi nồng độ cấy trên 2 đĩa).
Các đĩa petri được ủ trong tủ ấm 5% CO2, nhiệt độ 37oC trong 48h. Xác định số lượng khuẩn lạc mọc trên các đĩa thạch .
Số lượng VSV có trong 1mL dịch nuôi cấy được tính theo công thức:
𝑋 = 2 ×
𝐴𝑛−2 × 10𝑛−2 + 𝐴𝑛−1 × 10𝑛−1+ 𝐴𝑛× 10𝑛3
Trong đó:
X: Số VSV có trong 1mL mẫu.
An: Số khuẩn lạc mọc trên các đĩa petri có cấy các nồng độ pha loãng n.
2.3.4. Phương pháp xác định pH dịch lên men
Lắc đều bình nón chứa hỗn dịch lên men. Đo pH hỗn dịch bằng máy đo pH Mettler Toledo.
Tiến hành đo 3 lần, lấy kết quả trung bình [16], [48].
2.3.5. Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đo mật độ quang
Tiến hành
Lắc đều bình nón chứa hỗn dịch lên men. Đo quang hỗn dịch ở bước sóng 610nm bằng máy đo quang Hitachi.
Tiến hành đo 3 lần, lấy kết quả trung bình [16].
Mẫu trắng
Phân phối môi trường lên men đã chuẩn bị vào ống nghiệm sạch, 10mL/ống, nút kín. Tiệt khuẩn môi trường tại 115oC/20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn .Để nguội xuống nhiệt độ phòng. Ống nghiệm này được sử dụng làm mẫu trắng.
2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu
Mỗi thí nghiệm được tiến hành 3 lần. Độ lệch chuẩn SD được sử dụng để đánh giá mức độ dao động của các phép thử song song. Kết quả được thể hiện dưới dạng x̅±SD.
Độ lệch chuẩn SD được tính theo công thức:
x̅ = 1 n ∑ xi n i=1 SD = √ 1 n − 1∑(xi− x̅)2 n i =1
Trong đó : xi : giá trị của thí nghiệm thứ i.
x̅ : giá trị trung bình của n lần thí nghiệm. n : số lần thí nghiệm.
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Chương 3.
3.1. Khảo sát ảnh hưởng của inulin lên khả năng sinh trưởng, phát triển của
Lactobacillus acidophilus và Bifidobacterium longum
3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ inulin lên khả năng sinh trưởng, phát
triển của Lactobacillus acidophilus
Mục tiêu
Đánh giá tác dụng của inulin lên sự phát triển của L. acidophilus.
Xác định nồng độ thích hợp của inulin.
Nguyên tắc
So sánh khả năng sinh trưởng, phát triển của Lactobacillus acidophilus khi được nuôi cấy trong các môi trường có sự thay đổi về nồng độ inulin.
Tiến hành
Chuẩn bị môi trường MT1 với thành phần công thức được liệt kê tại mục 2.1.2, inulin được bổ sung với các nồng độ: 0%, 0,25%, 0,5%, 1%, 2%, 3%. Phân phối môi trường vào các bình nón sạch có dung tích thích hợp, 45 mL/bình, nút kín. Tiến hành lên men chủng Lactobacillus acidophilus trong 6 bình nón trên theo mục 2.3.2. Sau 24h nuôi cấy, dịch lên men của 6 mẫu được đem đi đo pH (theo mục 2.3.3) và định lượng VSV theo phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch (theo mục 2.3.4). Các đĩa thạch được ủ trong tủ ấm CO2, nhiệt độ 37 oC trong 48h. Xác định số lượng khuẩn lạc trên các đĩa thạch. Tính số lượng VSV trong các mẫu (theo công thức nêu ở mục 2.3.4).
Tiến hành làm 3 lần, lấy kết quả trung bình.
Kết quả
Số lượng vi sinh vật (Lactobacillus acidophilus) và pH dịch lên men của 6 mẫu MT1 bổ sung inulin với các nồng độ: 0%, 0,25%, 0,5%, 1%, 2%, 3% được thể hiện trong bảng 3.1 và hình 3.1.
n = 3 Mẫu Số lượng VSV (cfu/ml) Tỉ lệ số lượng VSV so với mẫu MT1 pH MT1 1,33.109 1,0 3,75±0,012 MT1 + 0,25% inulin 1,56.109 1,2 3,75±0,015 MT1 + 0,5% inulin 1,66.109 1,2 3,77±0,042 MT1 + 1% inulin 1,56.109 1,2 3,70±0,044 MT1 + 2% inulin 1,40.109 1,1 3,69±0,040 MT1 + 3% inulin 1,55.109 1,2 3,71±0,049
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn biến thiên số lượng vi sinh vật và pH dịch nuôi cấy
khi thay đổi nồng độ inulin bổ sung vào môi trường nuôi cấy L. acidophilus (n = 3)
1.33 1.56 1.66 1.56 1.40 1.55 3.75 3.75 3.77 3.70 3.69 3.71 3.40 3.46 3.52 3.58 3.64 3.70 3.76 3.82 3.88 3.94 4.00 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 0 0.25 0.5 1 2 3 pH Sốl ượ ng vi sinh vật (.10 9 cfu/m l) Nồng độ inulin bổ sung (%) Số lượng vi sinh vật pH
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của sự bổ sung inulin vào môi trường nuôi cấy
Số liệu ở bảng 3.1 và hình 3.1 cho thấy, bổ sung inulin vào môi trường nuôi cấy không có tác dụng rõ rệt lên sự sinh trưởng và phát triển của Lactobacillus acidophilus. Điều đóthể hiện qua sự thay đổi số lượng VSV và pH của dịch nuôi cấy.
Số lượng VSV tăng nhưng chỉ tăng nhẹ khi bổ sung inulin vào môi trường nuôi cấy. Ở môi trường MT1 (không bổ sung inulin), số lượng VSV đạt 1,33.109 cfu/ml. Khi bổ sung thêm inulin, con số này tăng lên khoảng 1,40.109 - 1,66.109 cfu/ml (chỉ cao hơn gấp 1,1 – 1,2 lần so môi trường nuôi cấy thông thường). Như vậy, với các nồng độ khảo sát thì số lượng L. acidophilus tăng không đáng kể so với kết quả thu được ở dịch nuôi cấy không bổ sung inulin.
Số liệu thu được cũng thể hiện pH dịch nuôi cấy hầu như không thay đổi khi bổ sung inulin vào môi trường nuôi cấy, giá trị pH của các mẫu dao động quanh khoảng 3,70 – 3,75.
Qua thí nghiệm trên có thể thấy inulin không thể hiện khả năng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của Lactobacillus acidophilus ATCC 4653. Trong báo cáo của D. Özer, S. Akin và B. Özer [48], khi tiến hành với 2 nồng độ inulin bổ sung là 0,5% và 1%, các tác giả cũng nhận thấy không có sự khác biệt rõ rệt về số lượng L. acidophilus
LA-5 giữa mẫu không bổ sung inulin với các mẫu có bổ sung inulin. Báo cáo kết luận inulin không có tác dụng đối với sự phát triển của L. acidophilus LA-5. Siok-Koon Yeo và Min-Tze Liong cũng thu được kết quả tương tự khi nghiên cứu ảnh hưởng của inulin lên 2 chủng L. acidophilus FTDC 8033 và L. acidophilus ATCC 4356 trong sữa đậu nành [64].
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ inulin lên khả năng sinh trưởng, phát
triển của Bifidobacterium longum
Mục tiêu
Đánh giá tác dụng của inulin lên sự phát triển của B. longum.
Nguyên tắc
So sánh khả năng sinh trưởng, phát triển của Bifidobacterium longum khi được nuôi cấy trong các môi trường có sự thay đổi về nồng độ inulin.
Tiến hành
Chuẩn bị môi trường MT3 với thành phần công thức được liệt kê tại mục 2.1.2, inulin được bổ sung với các nồng độ: 0%, 0,25%, 0,5%, 1%, 2%, 3%. Phân phối môi trường vào các bình nón sạch có dung tích thích hợp, 45 mL/bình, nút kín. Tiến hành lên men chủng Bifidobacterium longum trong 6 bình nón trên theo mục 2.3.2. Sau 48h nuôi cấy, dịch lên men của 6 mẫu được đem đi đo pH (theo mục 2.3.3) và định lượng VSV theo phương pháp đo mật độ quang (theo mục 2.3.5) với mẫu trắng là các ống nghiệm chứa các môi trường đã chuẩn bị ở trên.
Tiến hành làm 3 lần, lấy kết quả trung bình.
Trong thí nghiệm với Bifidobacterium longum, khóa luận sử dụng phương pháp định lượng VSV theo phương pháp đo mật độ quang thay cho xác định số lượng VSV theo phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường đặc đã tiến hành với L. acidophilus. Nguyên nhân do B. longum vốn là loài đòi hỏi kị khí tuyệt đối. Trong điều kiện thí nghiệm không có tủ cấy kị khí, phải tiến hành cấy trong tủ cấy thông thường sau đó nuôi B. longum trong tủ ấm 5% CO2, tuy khóa luận đã nuôi cấy thành công
Bifidobacterium longum nhưng khi tiến hành định lượng VSV theo phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường đặc với kĩ thuật cấy dưới thạch, khuẩn lạc mọc lên rất nhỏ và yếu, gây tốn thời gian và khó khăn cho việc đếm chính xác. Vì vậy, sau khi tham khảo nghiên cứu của Chen He và các cộng sự [16], nhận thấy kết quả tương đồng giữa 2 phương pháp, khóa luận đã chọn phương pháp định lượng VSV theo phương pháp đo mật độ quang để tiến hành.
Kết quả
Số lượng vi sinh vật (Bifidobacterium longum) và pH dịch nuôi cấy của 6 mẫu: MT3 và MT3 bổ sung inulin với các nồng độ: 0,25%, 0,5%, 1%, 2%, 3% được báo cáo trong bảng 3.2.
n = 3
Số liệu bảng 3.2 cho thấy bổ sung inulin vào môi trường nuôi cấy có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của Bifidobacterium longum. Điều đóthể hiện qua sự tăng mật độ quang và sự giảm pH của dịch nuôi cấy.
Sự thay đổi mật độ quang và pH dịch nuôi cấy khi thay đổi nồng độ inulin bổ sung vào môi trường nuôi cấy Bifidobacterium longum được thể hiện trên hình 3.2.
Mẫu pH Mật độ quang Tỉ lệ mật độ quang
so với mẫu MT3 MT3 4,33±0,047 0,202±0,0121 1,0 MT3 + 0,25% inulin 4,29±0,012 0,240±0,0240 1,2 MT3 + 0,5% inulin 4,25±0,041 0,320±0,0173 1,6 MT3 + 1% inulin 4,25±0,017 0,308±0,0191 1,5 MT3 + 2% inulin 4,20±0,049 0,524±0,0462 2,6 MT3 + 3% inulin 4,20±0,040 0,560±0,0346 2,8
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của sự bổ sung inulin vào môi trường nuôi cấy
Kết quả ở bảng 3.2 và hình 3.2 cho thấy, mật độ quang tăng rõ rệt khi bổ sung inulin vào môi trường nuôi cấy. Ở môi trường không bổ sung inulin, giá trị mật độ quang chỉ đạt 0,202. Khi bổ sung inulin với các nồng độ tăng dần từ 0,25% cho đến 3%, mật độ quang cũng tăng dần và đạt giá trị cao nhất là 0,560 ở mẫu bổ sung 3% inulin. Giá trị này cao gấp 2,8 lần giá trị mật độ quang đo được ở môi trường nuôi cấy không bổ sung inulin. Như vậy, trong các nồng độ khảo sát, bổ sung inulin với nồng độ 3% vào môi trường nuôi cấy B. longum cho kết quả tốt nhất.
Quan sát biểu đồ 3.2 có thể thấy pH dịch nuôi cấy Bifiodobacterium longum giảm rõ rệt khi bổ sung inulin vào môi trường nuôi cấy. Giá trị pH đo được ở dịch nuôi cấy sau 48h với môi trường không bổ sung inulin là 4,33 và con số này giảm dần khi bổ
0.202 0.240 0.320 0.308 0.524 0.560 4.33 4.29 4.25 4.25 4.20 4.20 3.84 3.90 3.96 4.02 4.08 4.14 4.20 4.26 4.32 4.38 4.44 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 0.25 0.5 1 2 3 pH Mật độ quang nồng độ inulin bổ sung (%) Mật độ quang pH
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn biến thiên pH và mật độ quang dịch nuôi cấy
sung thêm inulin vào môi trường nuôi cấy. Giá trị pH thấp nhất đo được là 4,20 ở các mẫu có inulin bổ sung với nồng độ 2% và 3%.
Như vậy, bổ sung inulin vào môi trường nuôi cấy có tác dụng kích thích rõ rệt sự sinh trưởng, phát triển của B. longum BB536. Từ mối tương quan thay đổi giữa giá trị mật độ quang và pH dịch lên men của các mẫu, nhận thấy trong các nồng độ khảo sát, bổ sung inulin ở nồng độ 3% cho tác dụng tốt nhất đối với quá trình nuôi cấy B. longum. Kết quả thu được cũng tương tự với nghiên cứu của Siok-Koon Yeo và Min- Tze Liong trên chủng B. longum FTDC 8643 trong sữa đậu nành [64]. Ngoài ra một số báo cáo trên thế giới chỉ ra inulin còn có tác dụng trên cả loài Bifidobacterium khác như B. bifidum [16], [48].
3.1.3. Bàn luận
Kết quả thu được thể hiện inulin không có tác dụng trên chủng Lactobacillus acidophilus ATCC 4653 nhưng lại kích thích tốt sự phát triển của Bifiodobacterium longum BB536. Trong các nồng độ khảo sát, nồng độ inulin bổ sung thích hợp nhất với
B. longum là 3%. Tại nồng độ này, mật độ quang của dịch nuôi cấy Bifidobacterium longum cao gấp 2,8 lần (so với mật độ quang của mẫu không bổ sung inulin). Từ kết quả thu được, có thể thấy sự kết hợp của Lactobacillus acidophilus ATCC 4653 với inulin là không có ý nghĩa. Trái ngược lại, Bifidobacterium longum/inulin biểu hiện là một cặp probiotics/prebiotics tiềm năng. Tuy nhiên trên thị trường, các chế phẩm synbiotics chứa L. acidophilus và inulin có mặt khá phổ biến như Fonkan (Dược VTYT Hải Dương), Santafe (Chr. Hansen),… Theo quan điểm của chúng tôi, hiệu quả của các chế phẩm này có thể do sự có mặt của cặp probiotics/prebiotics khác trong chế phẩm hoặc cũng có thể do chủng L. acidophilus trong chế phẩm khác với chủng khóa luận tiến hành nghiên cứu.
3.2. Khảo sát ảnh hưởng của lactulose lên khả năng sinh trưởng, phát triển của
Lactobacillus acidophilus và Bifidobacterium longum
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ lactulose lên khả năng sinh trưởng, phát
triển của Lactobacillus acidophilus
Mục tiêu
Đánh giá tác dụng của lactulose lên sự phát triển của L. acidophilus.
Xác định nồng độ thích hợp của lactulose.
Nguyên tắc
So sánh khả năng sinh trưởng, phát triển của Lactobacillus acidophilus khi được
nuôi cấy trong các môi trường có sự thay đổi về nồng độ lactulose.
Tiến hành
Chuẩn bị môi trường MT1 với thành phần công thức được liệt kê tại mục 2.1.2, lactulose được bổ sung với các nồng độ: 0%, 0,25%, 0,5%, 1%, 2%, 3%. Phân phối môi trường vào các bình nón sạch có dung tích thích hợp, 45 mL/bình, nút kín. Tiến hành lên men chủng Lactobacillus acidophilus trong 6 bình nón trên theo mục 2.3.2. Sau 24h nuôi cấy, dịch nuôi cấy của 6 mẫu được đem đi đo pH (theo mục 2.3.3) và định lượng VSV theo phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch (theo mục 2.3.4). Các đĩa thạch được ủ trong tủ ấm CO2, nhiệt độ 37 oC trong 48h. Xác định số lượng khuẩn lạc trên các đĩa thạch. Tính số lượng VSV trong các mẫu (theo công thức nêu ở mục 2.3.4).
Tiến hành làm 3 lần, lấy kết quả trung bình.
Kết quả
Số lượng vi sinh vật (Lactobacillus acidophilus) và pH dịch nuôi cấy của 6 mẫu: MT1 và MT1 bổ sung lactulose với các nồng độ: 0,25%, 0,5%, 1%, 2%, 3% được báo cáo trong bảng 3.3.
n = 3
Số liệu ở bảng 3.3 cho thấy bổ sung lactulose với nồng độ 0,25% - 3% vào môi trường nuôi cấy có tác dụng kích thích rõ rệt sự sinh trưởng và phát triển của
Lactobacillus acidophilus. Điều đóthể hiện qua sự tăng số lượng VSV và sự giảm pH của dịch nuôi cấy.
Sự thay đổi số lượng VSV và pH dịch nuôi cấy khi thay đổi nồng độ lactulose bổ sung vào môi trường nuôi cấy Lactobacillus acidophilus được thể hiện trên hình 3.3.
Mẫu Số lượng VSV (cfu/ml) Tỉ lệ số lượng VSV so với mẫu MT1 pH MT1 7,20.108 1,0 3,93±0,049 MT1 + 0,25% lactulose 16,80.108 2,3 3,78±0,014 MT1 + 0,5% lactulose 22,00.108 3,1 3,77±0,014 MT1 + 1% lactulose 16,60.108 2,3 3,75±0,028 MT1 + 2% lactulose 14,00.108 1,9 3,74±0,021 MT1 + 3% lactulose 11,60.108 1,6 3,75±0,035
