2.4.2.1. Viên hai lớp chứa amoxicilin
Định lượng
Dùng phương pháp đo quang ở 272nm (λmax), so sánh D thử, D chuẩn và dựa vào nồng độ mẫu chuẩn để tính nồng độ mẫu thử, từ đó suy ra hàm lượng dược chất trong viên.
Mẫu chuẩn: dung dịch amoxicilin 200µg/ml trong đệm 6,8
Cân chính xác khoảng 100mg natri amoxicillin vào bình định mức 100ml, thêm 80ml đệm phosphat pH 6,8, siêu âm 15 phút, bổ sung đệm đến vạch được dung dịch gốc amoxicilin 1mg/ml.
Từ dung dịch gốc amoxicilin 1mg/ml, hút 10ml cho vào bình 50 ml, bổ sung đệm phosphat pH 6,8 vừa đủ 50ml được dung dịch chuẩn amoxicilin 200μg/ml.
Mẫu thử (định lượng): cân 10 viên, tính khối lượng trung bình, nghiền thành bột mịn. Cân chính xác lượng bột tương ứng với khoảng 400mg amoxicilin, cho vào
Lớp GPKD Nén sơ bộ
bình định mức 200ml, thêm 180 ml đệm phosphat pH 6,8, siêu âm 15 phút, bổ sung vừa đủ 200ml. Lọc và bỏ 20ml dịch lọc đầu. Hút lấy 10 ml dịch lọc cho vào bình định mức 100 ml, bổ sung đệm vừa đủ 100 ml được dung dịch có nồng độ amoxicilin khoảng 200μg/ml.
Tính kết quả:
Cth = Cch× HL = ×
× ×100%
Trong đó: Cth, Cch lần lượt là nồng độ mẫu thử và mẫu chuẩn.
Dth, Dch lần lượt là độ hấp thụ của mẫu thử và mẫu chuẩn. mth, mch là khối lượng cân của mẫu thử và mẫu chuẩn. HL là hàm lượng % của amoxicilin trong viên.
Thử hòa tan
Tiến hành trên máy thử hòa tan Pharma – Test. Dịch hòa tan được pha loãng, lọc, đo độ hấp thụ và so sánh với độ hấp thụ của mẫu chuẩn, từ đó tính ra lượng dược chất giải phóng và % dược chất giải phóng.
Điều kiện thử hòa tan.
Máy thử hòa tan Pharma – Test sử dụng cánh khuấy. Tốc độ quay: 75 ± 2 vòng/ phút.
Môi trường: 900 ml dung dịch đệm phosphat pH 6,8. Nhiệt độ: 37±0,50 C.
Thời gian lấy mẫu: 15 phút, 30 phút, 45 phút, 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ,5 giờ, 6 giờ.
Tiến hành
Cân khối lượng chính xác của từng viên, thử hòa tan trong điều kiện đã nêu trên.
Mẫu chuẩn: pha dung dịch amoxicilin 200µg/ml trong đệm phosphat pH 6,8 như mục định lượng ở trên.
Mẫu thử: tại mỗi thời điểm lấy mẫu, hút 5 ml dịch, lọc qua hệ thống lọc và bù lại bằng 5 ml môi trường. Pha loãng dịch lọc 5 lần bằng đệm phosphat pH 6,8 và đo quang tại λmax, so sánh với mẫu chuẩn.
Cách tính kết quả
Nồng độ amoxicilin trong mẫu thứ n:
C = C × (µg/ml) Dược chất giải phóng sau mẫu thứ n:
Mn = × × ⋯ × × (mg)
% amoxicilin giải phóng: H =
× ×100% Trong đó:
Cn, Dn: nồng độ amoxicilin, độ hấp thụ của dung dịch rút tại thời điểm n. Mn, Hn: lượng amoxicilin và % amoxicilin đã GP tính đến thời điểm n. Cch, Dch: nồng độ và độ hấp thụ của dung dịch amoxicilin chuẩn. HL: hàm lượng amoxicilin trong viên viên nén.
mv : khối lượng viên.
Khảo sát độ đúng, độ lặp lại của phương pháp đo quang xác định hàm lượng amoxicilin
Nguyên tắc
Độ đúng: khảo sát ảnh hưởng của các tá dược trong công thức lên độ hấp thụ của amoxicilin trong dịch định lượng hay thử hòa tan. Nguyên tắc: thêm chính xác một lượng chất chuẩn đã biết nồng độ vào hỗn dịch chứa các tá dược trong viên sao cho nồng độ DC nằm trong khoảng tuyến tính, đem lọc, thu được mẫu thử. Tiến hành đo quang ở λmax, dựa vào độ hấp thụ của dung dịch chuẩn và dung dịch thử để tính được lượng DC tìm thấy trong mẫu thử.
riêng biệt theo quy trình thử nghiệm được áp dụng lặp lại trên cùng mẫu, được đánh giá bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD.
Tiến hành:
Độ đúng:
Mẫu chuẩn: dung dịch amoxicilin 100µg/ml trong đệm phosphat pH 6,8 như mục định lượng ở trên.
Hỗn dịch TD: cân các thành phần trong CT (với lượng tương ứng trong viên) ngoại trừ amoxicilin, phân tán vào 1000ml đệm phosphat pH 6,8.
Mẫu thử: hút chính xác 10ml dung dịch amoxicilin chuẩn 1mg/ml trong đệm phosphat pH 6,8 (tương đương 10mg amoxicilin chuẩn) vào bình định mức 100ml, thêm 20ml hỗn dịch tá dược, bổ sung đệm phosphat pH 6,8 vừa đủ (hỗn dịch tá dược được pha loãng theo đúng tỷ lệ khi định lượng và thử hòa tan). Lọc, thu được dung dịch amoxicilin trong dung dịch tá dược có nồng độ 100µg/ml.
Độ lặp lại:
Mẫu chuẩn: dung dịch amoxicilin 200μg/ml trong đệm phosphat pH 6,8.
Mẫu thử: Trong cùng lô sản xuất, lấy ngẫu nhiên 10 viên, cân và tính khối lượng TB của mỗi viên. Nghiền viên thành bột mịn, trộn đều. Cân chính xác khoảng 312mg bột, cho vào bình định mức 100ml, thêm khoảng 80ml đệm. Sau đó, siêu âm khoảng 15 phút, rồi bổ sung đệm vừa đủ 100ml. Hút 10 ml từ dung dịch vừa pha cho vào bình 100ml, thêm đệm phosphat vừa đủ 100ml. Lọc, thu được mẫu thử. Làm lại 5 lần như vậy trên cùng khối bột đã nghiền đó.
So sánh hai đồ thị giải phóng
Chỉ số tương đồng f2: Chỉ số f2 thể hiện sự giống nhau giữa 2 đồ thị giải phóng dược chất và được tính theo công thức sau:
= 50 × 1 +1× ( − ) × 100
n: Số điểm lấy mẫu thử.
Ri, Ti: Phần trăm DC giải phóng tại thời điểm t của mẫu đối chiếu, mẫu thử.
50 ≤ f2 ≤ 100: Hai đồ thị được coi là tương đương.
Nếu f2 = 100:Hai đồ thị được coi là giống nhau hoàn toàn.
Nếu f2 = 50: Hai đồ thị có sự sai khác TB tại mỗi thời điểm là 10%. Nếu f2 < 50: Hai đồ thị được coi là không tương đương.
2.4.2.2.Viên hai lớp chứa amoxicilin và kali clavulanat
Tiến hành định lượng và thử hòa tan như viên nén amoxicilin 2 lớp nhưng xác định hàm lượng dược chất trong viên nén và dịch hòa tan được thực hiện bằng phương pháp HPLC – theo Dược Điển Việt Nam IV [5].
Các điều kiện sắc kí:
Pha động: hỗn hợp 5 thể tích methanol và 95 thể tích dung dịch kali dihydrophosphat 0,78% (kl/tt) đã được điểu chỉnh đến pH 4,4 bằng acid phosphoric
Cột: C18 (25cm × 4,6mm;5μm), Detector: 220nm, tốc độ dòng: 1,5ml/phút, thể tích tiêm mẫu: 20μL.
Dung dịch chuẩn
Cân chính xác khoảng 100mg natri amoxicillin vào bình định mức 100ml, thêm 80ml nước cất hai lần, siêu âm 15 phút, bổ sung nước cất hai lần đến vạch được dung dịch gốc amoxicilin 1mg/ml.
Cân chính xác khoảng 100mg acid clavulanic vào bình định mức 100ml, thêm 80ml nước cất hai lần, siêu âm 15 phút, bổ sung nước cất hai lần vừa đủ 100ml được dung dịch gốc acid clavulanic 1mg/ml.
Từ các dung dịch gốc trên pha loãng thành các dung dịch chuẩn có chứa đồng thời amoxicilin và acid clavulanic có nồng độ lần lượt là 200μg/ml và 10μg/ml. Lọc mẫu chuẩn qua màng lọc 0,45μm.
Dung dịch thử: Cân 10 viên, tính khối lượng trung bình, nghiền thành bột mịn. Tiến hành tương tự như mục 2.4.2.1 để thu được dung dịch có nồng độ amoxicilin và acid clavulanic khoảng 200μg/ml và 12,5 μg/ml trong nước cất 2 lần. Lọc mẫu qua màng lọc 0,45μm.
CHƯƠNG 3: TH 3.1. Thẩm định phương pháp đ quang
3.1.1. Xác định bước sóng h
Tiến hành quét ph phosphat pH 6,8 trong kho sóng cực đại λmax= 272nm.
Hình 3.1:
Dựa theo kết qu
bước sóng đo quang trong đ
3.1.2. Độ tuyến tính
Pha một loạt các dung d 300μg/ml và đo độ hấp th mục 2.4.2.1. Kết quả thu đư
Bảng 3.1: Nồng đ
Nồng độ (µg/ml) D
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN C
nh phương pháp định lượng amoxicilin bằng phương pháp đo
c sóng hấp thụ cực đại
n hành quét phổ UV-VIS dung dịch amoxicilin100
phosphat pH 6,8 trong khoảng bước sóng từ 200 – 400nm. Kết quả cho b = 272nm.
Hình 3.1: Phổ hấp thụ UV-VIS của dung dịch amoxicilin
t quả quét bước sóng trong đệm phosphat pH 6,8, l đo quang trong định lượng.
các dung dịch amoxicilin chuẩn có nồng độ
p thụ của các dung dịch này tại bước sóng 272nm như mô t thu được như sau:
ng độ amoxicilin và mật độ quang tại bước sóng 272
50 100 150 200
0,159 0,314 0,463 0,628
NGHIÊN CỨU ng phương pháp đo
100μg/mLtrong đệm ết quả cho bước sóng
ủa dung dịch amoxicilin
pH 6,8, lấy 272nm là từ 50μg/ml đến c sóng 272nm như mô tả ở c sóng 272nm 250 300 0,782 0,931
Hình 3.2: Mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ của dung dịchamoxicilin
Nhận xét: Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ khảo sát 50 – 300 μg/ml có mối tương quan tỉ lệ thuận chặt chẽ giữa độ hấp thụ và nồng độ dung dịch amoxicilin trong đệm phosphat pH 6,8, với giá trị R2=0,9998.
3.1.3. Độ đúng, độ lặp lại Độ đúng Độ đúng
Tiến hành pha các mẫu chuẩn và mẫu thử, đo quang ở bước sóng 272 nm như mô tả ở mục 2.4.2.1, kết quả được trình bày dưới bảng 3.2.
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng amoxicilin
STT Clý thuyết (μg/ml) Cthực tế (μg/ml) %DC tìm được TB (%) RSD (%) Lần 1 10 10,30 102,97 102,43 0,74 Lần 2 10 10,30 102,97 Lần 3 10 10,30 102,97 Lần 4 10 10,15 101,54 Lần 5 10 10,19 101,90
Nhận xét: kết quả cho thấy, % DC tìm được từ 101,54 – 102,97%, tỉ lệ trung
bình DC tìm được ở các mẫu là 102,43 % (RSD=0,74), điều này chứng tỏ phương pháp có độ đúng cao. y = 0.003x + 0.003 R² = 0.999 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0 50 100 150 200 250 300 350 M ật đ ộ q u an g Nồng độ (μg/ml)
Độ lặp lại
Tiến hành pha các mẫu chuẩn và mẫu thử, đo quang ở bước sóng 272nm như mô tả ở mục 2.4.2.1, kết quả được trình dưới bảng 3.3.
Bảng 3.3: Kết qủa KS độ lặp lại của phương pháp định lượng amoxicilin
STT Mật độ quang Hàm lượng DC (%) TB (%) RSD (%) Lần 1 568 102,10 102,00 0,69 Lần 2 566 101,00 Lần 3 560 100,80 Lần 4 559 100,50 Lần 5 567 102,00
Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối RSD của cả 5 mẫu là 0,69% (< 2%),
chứng tỏ là phương pháp có độ lặp lại cao.
Kết luận: Có thể sử dụng phương pháp đo quang để định lượng amoxicilin trong viên nén hai lớp chỉ chứa amoxicilin.
3.2. Khảo sát giải phóng dược chất từ viên đối chiếu Augmentin SR 1000mg/62,5mg. 1000mg/62,5mg.
Để làm cơ sở cho việc xây dựng CT bào chế viên nén hai lớp chứa amoxicilin và kali clavulanat GPKD, lựa chọn chế phẩm Augmentin SR 1000/62,5mg của hãng GlaxoSmithKline (GSK) làm VĐC. Tiến hành định lượng và đánh giá % GP dược chất như mục 2.4.2.2. Kết quả được trình bày trong bảng 3.4 – hình 3.3, 3.4.
Bảng 3.4: % GP amoxicilin và kali clavulanat từ viên đối chiếu (n=9)
Thời gian %Amoxicilin % Acid clavulanic
0 0 0 15 phút 33,73±11,45 40,92±22,17 30 phút 47,82±2,41 65,56±8,40 45 phút 58,30±1,91 92,88±4,54 1 giờ 60,38±1,91 96,36±3,38 2 giờ 62,94±0,42 94,59±2,10 3 giờ 68,31±1,40 94,30±2,24 4 giờ 75,30±3,38 91,75±1,14 5 giờ 93,30±1,45 90,26±1,75 6 giờ 96,39±1,87 87,80±2,80
Hình 3.3: % GP amoxicilin từ viên đối chiếu
0 20 40 60 80 100 0 1 2 3 4 5 6 % a m o x ci li n G P
Hình 3.4: % GP kali clavulanat từ viên đối chiếu
Nhận xét:
Từ đồ thị giải phóng dược chất, nhận thấy trong giờ đầu tiên, %GP của acid clavulanic tăng rất nhanh (sau 1giờ đạt 96,36%), tuy nhiên trong các giờ tiếp theo giảm dần và sau 6h chỉ còn 87,8%.
Phần trăm GP của amoxicilin cũng tăng nhanh trong một giờ đầu tiên (sau 1giờ đạt 60,38%), nhưng sau đó tăng chậm hơn từ giờ thứ 2 đến giờ thứ 4, và tăng nhanh trong hai giờ cuối, giải phóng hết sau 6 giờ.
Kết quả % GP dược chất từ viên đối chiếu được sử dụng để đánh giá hệ số tương đồng f2 cho những công thức khảo sát sau này.
3.3. Khảo sát ảnh hưởng của tá dược và tỉ lệ tá dược đến GP dược chất
3.3.1.Khảo sát ảnh hưởng của tá dược
Để khảo sát ảnh hưởng của tá dược, công thức bào chế viên được dựa theo nghiên cứu Lê Thị Hằng (2014) [6]. Theo nghiên cứu của Storm K.H và cộng sự, amoxicilin trihydrat không bền trong môi trường acid [25] nên ở lớp GPKD thay amoxicilin trihydrat bằng natri amoxicilin. CT bào chế viên nén ban đầu được dự kiến như sau:
0 20 40 60 80 100 0 1 2 3 4 5 6 % G P k al i cl av u la n at
Bảng 3.5: CT lớp GPN, GPKD xây dựng ban đầu cho một viên
Lớp GPN Lớp GPKD (K1)
Thành phần Khối lượng Thành phần Khối lượng
Amoxicilin trihydrat 86,26% (dạng compact) 649mg Natri amoxicilin 95,1% 463mg Kali clavulanat 41,9% 150mg HPMC K100LV 160mg Talc 16mg Avicel PH 102 94mg
Magnesi stearat 16mg Aerosil 4mg
Magnesi stearat 8mg
Tổng 831mg Tổng 729mg
3.3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của loại amoxicilin
Theo Lê Thị Hằng (2014) [6], amoxicilin trihydrat dạng hạt compact được sử dụng cho cả hai lớp GPN và GPKD. Amoxicilin trihydrat ở dạng này thuận tiện cho quá trình dập viên và nghiên cứu. Tuy nhiên, amoxicilin trihydrat lại kém bền trong môi trường acid dịch vị [25], natri amoxicilin bền hơn trong môi trường acid [25], chính vì vậy, natri amoxicilin được lựa chọn thay thế amoxicilin trihydrat trong lớp GPKD. Công thức K0, K1 khảo sát ảnh hưởng của loại nguyên liệu amoxicilin đến GP amoxicilin trong viên nén 2 lớp, có thành phần được trình bày trong bảng sau:
Bảng 3.6: Các CT khảo sát ảnh hưởng của loại amoxicilin
Thành phần K0(M6) K1
GPN Amoxicilin trihydrat (86,36%) 649mg, Avicel 74mg, talc 16mg, magnesi stearat 16mg. GPKD Amoxicilin trihydrat 86,36% 510 _ Natri amoxicilin 95,1% _ 463 HPMC K100LV 160 160 Avicel PH102 51 94 Aerosil 4 4 Magnesi stearat 8 8 Tổng 733 729
Tiến hành bào chế CT viên như bảng 3.6, sau đó định lượng và đánh giá % GP amoxicilin theo mục 2.4.2.2. Kết quả được trình bày ở bảng 3.7– hình 3.5.
Bảng 3.7:%GP amoxicilin từ các CT K0, K1 Thời gian K0 K1 VĐC 15 phút 19,93±4,72 52,40±2,11 33,73±11,45 30 phút 42,56±3,57 68,15±5,35 47,82±2,41 45 phút 55,59±4,85 73,18±2,27 58,30±1,91 1 giờ 61,55±5,02 77,04±0,98 60,38±1,91 2 giờ 67,82±4,87 81,80±0,81 62,94±0,42 3 giờ 71,94±2,35 88,49±3,01 68,38±1,40 4 giờ 75,67±1,16 88,81±5,25 75,30±3,38 5 giờ 77,76±0,14 89,57±2,71 93,30±1,45 6 giờ 91,45±0,85 90,62±2,08 96,39±1,87 f2 60,8 39,1 Hình 3.5: Đồ thị GP amoxicilin từ CT K0, K1 Nhận xét:
Khi thay amoxicilin trihydrat của lớp GPKD bằng natri amoxicilin , GP amoxicilin của CT K1 nhanh hơn rất nhiều so với CT ban đầu (K0), Sau 1 giờ, % GP amoxicilin của CT K1 đạt 77,04%, trong khi đó, CT K0 chỉ đạt 61,55%, cả hai đều nhanh hơn VĐC (60,38%). Sau 5 giờ, % GP của CT K1 là 89,57% nhanh hơn
0 20 40 60 80 100 0 1 2 3 4 5 6 % G P a m o x ic il in
Thời gian (giờ) ĐC K1 Ko
CT K0 (77,76%), nhưng đều chậm hơn so với VĐC (93,3%). Hai CT K0, K1 đều không GP hoàn toàn sau 6h, % GP đạt được sau 6h của K1, K0 lần lượt là 91,45%, 90,62 % , trong khi đó VĐC đạt 96,39%. Đồ thị GP của CT K1 không tương đương với VĐC, chỉ số f2 đạt 39,1 (< 50).
Như vậy, khi thay nguyên liệu amoxicilin trihydrat của lớp GPKD bằng natri amoxicilin, tốc độ GP từ viên khảo sát nhanh hơn. Nguyên nhân do natri amoxicilin (dạng muối) hòa tan tốt hơn amoxicilin trihydrat ở dạng ngậm nước [3], làm cho % GP amoxicilin tăng lên, GP nhanh hơn cả VĐC.
3.3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của HPMC K100LV
Theo khảo sát các CT K0, K1 như mục 3.3.1.1, nguyên nhân có sự thay đổi phần trăm GP dược chất (amoxicilin, kali clavulanat) trong CT K1 so với CT K0 là do thay nguyên liệu lớp GPKD amoxicilin trihydrat bằng natri amoxicilin. Do đógiữ nguyên CT lớp GPN, và chỉ khảo sát CT của lớp GPKD. Để thuận tiện cho nghiên cứu, acid clavulanic được loại bỏ trong CT của lớp GPN, thêm lượng Avicel đúng bằng lượng Avicel chứa trong nguyên liệu kali clavulanat đã loại bỏ của CT lớp GPN. Dập viên có CT lớp GPN cố định, thay đổi CT lớp GPKD để khảo sát ảnh hưởng của tá dược và tỉ lệ của tá dược đến GP amoxicilin.
CT K1 có đồ thị GP dược chất nhanh hơn VĐC rất nhiều, để làm giảm tốc độ GP dược chất, CT K2, K3 được xây dựng với tỉ lệ HPMC K100LV tăng lên. CT K2, K3 được trình bày trong bảng sau:
Bảng 3.8: Các CT khảo sát ảnh hưởng của HPMC K100LV
Thành phần K1 (mg) K2 (mg) K3 (mg) GPN Amoxicilin trihydrat (86,36%) 649mg, Avicel 74mg, talc
16mg, magnesi stearat 16mg. GPKD Natri amoxicilin 95,1% 463 HPMC K100LV 160 194 224 Avicel PH102 94 60 50 Aerosil 4 4 4 Magnesi stearat 8 8 8 Tổng 729 729 749
Tiến hành bào chế CT viên như bảng 3.8, sau đó định lượng và đánh giá %