ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng và vật liệu nghiên cứu
2.3.2.5.Xác định hàm lượng prolin
Tính kết quả: 1 2 1 (OD OD ) 0,1 C OD Trong đó:
C - lượng tinh bột bị thuỷ phân
OD1 - mật độ quang của dung dich đối chứng (là lượng tinh bột ban đầu)
OD2 - mật độ quang của dung dịch thí nghiệm 0,1 - lượng tinh bột phân tích (g)
(là lượng tinh bột còn lại sau khi bị amylaza thuỷ phân)
Sự khác nhau giữa mật độ quang của bình đối chứng và bình thí nghiệm là lượng tinh bột bị thuỷ phân.
Tính hoạt độ amylaza (đv/g) 6,889 0, 029388 1000 w C H Trong đó:
w : lượng chế phẩm enzym đem thí nghiệm (mg) C : lượng tinh bột bị thuỷ phân (g)
2.3.2.5. Xác định hàm lượng prolin
Xác định hàm lượng prolin theo pheo phương pháp của Bates (1973) và cải tiến của Đinh Thị Phòng (2001) [32].
Cân 0,5g mẫu cần phân tích nghiền kỹ, thêm 10ml dung dịch axit sulfosalixylic 3%, ly tâm 7000 vòng/phút trong thời gian 20 phút, lọc lấy dịch trong. Lấy 2ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm 2ml axit axetic, sau đó thêm 2ml ninhidrin ( tinh thể ninhidrin pha với axit axetic), ủ trong nước nóng 100oC trong vòng 1 giờ, sau đó ủ lạnh khoảng 5 phút. Bổ sung vào ống nghiệm đó 4ml toluen, lắc đều. Lấy phần dịch màu hồng ở phần trên của ống
nghiệm để đo mật độ quang học (OD-Optical density) ở bước sóng =520nm trên máy UV - Visible - Spectrophotometer, UV - 2450 do hãng Shimadzu của Nhật sản xuất. Hàm lượng axit amin prolin tính theo công thức:
Y 0,0179 X 0,095 R2 = 1
Trong đó:
Y: Nồng độ prolin (mg/l)
X: Giá trị OD đo được trên máy R2: Hệ số tương quan P V Y A Trong đó: A: Hàm lượng prolin (µg/g) P: Khối lượng mẫu (g)
V: Thể tích dịch prolin chiết được (ml)
Tất cả các axit amin đều phản ứng màu với ninhidrin tạo thành hợp chất màu xanh tím, riêng axit amin như prolin tạo thành hợp chất màu vàng với cơ chế phức tạp. Hợp chất màu vàng này có cực đại hấp thụ ở bước sóng
=520nm.