2.1.5.1. Chỉ tiêu nghiên cứu
Hình 2.4. Sơ đồ chỉ tiêu nghiên cứu của khoá luận.
2.1.3.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu
i- Khảo sát phổ hấp thụ ư v và lựa chọn các bước sóng phân tích:
Mỗi hoạt chất có bước sóng hấp thụ cực đại khác nhau, vậy nên cần phải khảo sát phổ hấp thụ u v để xác định các bước sóng hấp thụ cực đại. Các dung dịch mẫu chuẩn, mẫu thử dùng để thiết lập điều kiện xây dựng quy trình định lượng sẽ được đo độ hấp thụ quang tại các bước sóng cực đại này để giảm thiểu sai số.
Pha các dung dịch chuẩn Metronidazol và Spiramycin rồi quét phổ hấp thụ quang trên giải sóng 200-400nm.
4- Khảo sát độ tuyến tính của các thành phần phân tích.
Nồng độ mỗi chất phân tích đều có mối quan hệ tuyến tính với độ hấp thụ quang tại bước sóng xác định (trong một khoảng nồng độ nhất định nào
đó), nghĩa là trong khoảng nồng độ đó thì độ hấp thụ quang A phụ thuộc vào nồng độ c theo một hàm bậc nhất:
A - a.c + b
Cần phải xác định khoảng tuyến tính này bằng thực nghiệm, từ đó làm cơ sở để pha các dung dịch phân tích có nồng độ nằm trong khoảng tìm được.
Tiến hành pha một dung dịch gốc, sau đó pha loãng dung dịch gốc này để thu được một dãy dung dịch chuẩn đã biết trước nồng độ. Đo độ hấp thụ quang của các dung dịch này tại các bước sóng hấp thụ cực đại của mỗi chất. Lập phương trình hồi quy, đánh giá độ tuyến tính thông qua hệ số tưong quan r của mỗi chất tại mỗi bước sóng phân tích.
-ế- Khảo sát tính cộng phổ của dung dịch hỗn họp chứa Metronidazol và Spiramycin
Phương pháp định lượng chúng tôi xây dựng dựa trên nguyên tắc “ífợ
hấp thụ quang của một hỗn hợp bằng tổng độ hấp thụ quang của các thành
phần trong hỗn hợp đ ấ ỷ \ do đó cần phải kháo sát tính cộng phổ của dung
dịch hỗn họp để chứng minh rằng, trong khoảng nồng độ đã chọn thỏa mãn nguyên tắc trên.
Tiến hành pha các dung dịch chuẩn của từng thành phần riêng rẽ có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính và dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ từng thành phần bằng nồng độ của các thành phần trong dung dịch chuẩn riêng rẽ. Đo độ hấp thụ của từng dung dịch, tính tỷ lệ giữa tổng độ hấp thụ của từng thành phần với độ hấp thụ của dung dịch chuẩn hỗn hợp.
4- Phân tích mẫu:
Pha các dung dịch thử và dung dịch chuẩn, với nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính, tiến hành đo quang các dung dịch đó tại các bước sóng đã chọn. Xử lý kết quả bằng phương pháp toán học.
ị- Đánh giá độ lặp lại và độ đúng của phương pháp
Khảo sát độ lặp lại bằng cách tiến hành định lượng lặp lại nhiều lần hoạt chất cần phân tích của mẫu rồi xử lý kết quả bằng phương pháp thống kê.
Độ đúng của phương pháp được đánh giá thông qua khả năng thu hồi của kết quả phân tích khi dùng phương pháp thêm chuẩn. Thêm vào mẫu thử một lưọng chính xác chất chuẩn đã biết trước hàm lượng sao cho dung dịch cuối cùng có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát và xác định phần trăm thu hồi.
ề- So sánh giá trị trung bình và độ lặp lại của phương pháp vừa xây dựng với phưong pháp theo các TCCS trong nước đối với kết quả định lượng ME.
So sánh độ lặp lại (Test F) và so sánh giá trị trung bình (Test T) đối với kết quả định lượng ME theo hai phương pháp nêu trên.
2.1.3.2. Phương pháp xử lý số liệu
i- Dữ liệu thu được được xử lý bằng phương pháp thống kê - sử dụng công cụ hỗ trợ là phần mềm Microsoft Excel.
Một số đặc trưng thống kê được sử dụng:
Độ lệch chuẩn • s = \ —---
V « - 1
Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) : RSD (%) = = x 1 0 0
Giá trị trung bình ; X
Khoảng tin cậy : X ± —^ ^
Phương sai : =/ = 1________________________
■ Sai số chuẩn : s , = - ^
s,x í xioo
■ Sai số tương đối ; A% = ^ _
So sánh hai phương sai (test F) : Ftn^ ^ s "
■ So sánh hai giá trị trung bình (test T)
„ 2 i n ữ h
2.2. THUỐC THỬ, HOÁ CHÂT, DỤNG c ụ .
4- Thuốc thử: dung dịch HCl 0,1N, dung dịch NaOH 0,1N, methanol tuyệt đối ( theo DĐVNIII - “Thuốc thử”).
■«I- Chất đối chiếu: Metronidazol và Spiramycin chuẩn (do Viện kiểm nghiệm - Bộ Y tế cung cấp).
4- Thiết bị: Máy quang phổ tử ngoại khả kiến Lambda EZ210, cân phân tích, máy siêu âm (Bộ môn Hoá Dược, Trưòng Đại học Dược Hà Nội).
4* Dụng cụ: bình định mức các loại 50ml, lOOml; pipet Iml, 2ml, 5ml, lOml...
2.3. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG METRONIDAZOL VÀ SPIRAMYCIN TRONG HỖN HỢP BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG PHỒ UV-VIS
2.3.1. Khảo sát phổ hấp thụ uv và lựa chọn các bước sóng phân tích
Cân chính xác khoảng 50mg ME chuẩn, cho vào bình định mức lOOml, thêm 70ml NaOH 0,1N, lắc đều cho tan hết trong khoảng 5 phút, bổ sung NaOH 0,1N vừa đủ cho đến vạch. Lọc, bỏ 20ml dung dịch đầu. Hút chính xác 2ml dịch lọc tiếp theo cho vào bình định mức lOOml, thêm NaOH 0,1N đến vạch, thu được dung dịch Metronidazol lOjug/ml trong môi trường NaOH 0,1N.
Cân chính xác khoảng 30mg SP chuẩn, cho vào bình định mức lOOml, thêm 70ml dung dịch methanol tinh khiết, lắc đều cho tan hết, bổ sung methanol tinh khiết vừa đủ tới vạch. Lọc, bỏ 20ml dung dịch ban đầu. Hút chính xác 5ml dịch lọc tiếp theo cho vào bình định mức lOOml, bổ sung dung dịch NaOH 0,1N vừa đủ tới vạch, thu được dung dịch Spiramycin 15/ug/ml trong môi trường NaOH 0, IN.
Tiến hành ghi phổ hấp thụ riêng biệt mỗi dung dịch trên trong giải sóng 200-400nm, mẫu trắng là dung dịch NaOH 0,1N, thu được phổ đồ ở hình 2.5 và hình 2.6.
A b s P h o S P / N a O H 0. 4 0. 3 0.2 0.1- ...H / /' \\ 232nm 1 — — 1 \ E \ z ^ ỉ' \\ z ' V \ — — ■■ 1 n m 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0
Hình 2.5. Phổ hấp thụ Spiramycin trong môi trường NaOH OJN.
A b s 0.5-ị: P h o M E/ N a OH 0. 4 0. 3 0.2 0.1 0.0 228nm 319nm 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 nm
Hình2.6. Phổ hấp thụ của Metronidazol trong môi trường NaOH 0,1N.
Nhận xét: trong môi trưÒTig NaOH 0,1N, SP có cực đại hấp thụ tại
bước sóng 232nm, còn ME có 2 cực đại hấp thụ tại các bước sóng 319nm và 228nm. Cũng dựa vào dữ liệu phổ, chúng tôi nhận thấy ở bước sóng lớn hơn 300nm, trong môi trường NaOH 0,1N, SP không còn hấp thụ quang. Vậy nên, độ hấp thụ quang của dung dịch hỗn hợp MS ở bước sóng lớn hơn 300nm
cũng là độ hấp thụ quang của ME. Bởi vậy, từ độ hấp thụ quang của dung dịch hỗn họfp ở bước sóng 319nm, chúng tôi có thể suy ra được nồng độ ME trong dung dịch hỗn hợp. Từ nồng độ ME đã tính được, từ độ hấp thụ quang của dung dịch hỗn hợp tại bước sóng 232nm và theo định luật Lamber-Beer, chúng tôi suy ra được nồng độ SP. Do đó, chúng tôi chọn 2 bước sóng phân tích là 3 19nm và 232nm.
2.3.2. Khảo sát tính tuyến tính và tính cộng phổ ờ các bước sóng phân tích của dung dịch hỗn hợp Metronidazol và Spiramycin
Cân chính xác khoảng 20mg ME chuẩn cho vào bình định mức 200ml, thêm khoảng 150ml dung dịch NaOH 0,1N, lắc đều cho tan hết, bổ sung NaOH 0,1N vừa đủ tới vạch. Lọc, bỏ 50ml dung dịch đầu. Dịch lọc thu được
là dung dịch chuẩn ME 100jug/ml trong môi trường NaOH 0,1N (dung dịch
A).
Cân chính xác khoảng 30mg SP chuẩn vào bình định mức 200ml, thêm khoảng 150ml methanol tinh khiết, lắc đều cho tan hết, bổ sung dung dịch methanol vừa đủ tới vạch. Lọc, bỏ 50ml dung dịch đầu. Dịch lọc thu được là
dung dịch chuẩn SP 150ng/ml trong môi trường methanol (dung dịch B).
Tiến hành pha các dung dịch chuẩn và dung dịch chuẩn hỗn hợp theo bảng 2.1.
Bảng 2.1 .Pha dãy dung dịch chuẩn và dung dịch chuẩn hỗn họp. Dung dịch
chuân M E’lF M E’2 ME’3 SP’l\ r SP’2 SP’3 M S’l MS’2 MS’3 Sô ml dung dịch cân lây vào bình định mức 5Om
A (ml) 1 0 5 2 1 0 5 2 B (ml) 1 0 5 2 1 0 5 2 Nông độ (|Lig/ml) 2 0 1 0 4 30 15 6 20MR 30SP lOME 15SP 4ME 6SP
Tiến hành đo độ hấp thụ quang của các dung dịch trên theo ở các bước sóng 232nm và 319nm, mẫu trắng là dung dịch NaOH 0,1N. Kết quả về tính tuyến tính được trình bày ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Kết quả khảo sát tương quan hồi quy tuyến tính đối với ME và SP trong môi trường NaOH 0,1N tại 2 bước sóng đã chọn.
Bước sóng (nnì) Metronidazol Spiramycin Hệ sô tương quan (r)
Phương trình hôi quy y=ax + b
Hệ sô tương quan (r)
Phương trình hôi quy y = ax + b 232 0,9999 y = 0,018x + 0,0004 0,9999 y = 0 ,0 3 5 7 x -0,0002
319 1 , 0 0 0 0 y = 0,0497x + 0,0002 <Chông hâp thụ
Nhận xét: Bảng 2.2 cho thấy có sự tương quan tuyến tính rõ rệt giữa độ
hấp thụ quang và khoảng nồng độ khảo sát của ME và SP tại 2 bước sóng đã nêu.
Kết quả về tính cộng phổ của ME và SP trong dung dịch hỗn hợp được trình bày ở bảng 2.3.
Bảng 2.3. Kết quả khảo sát tính cộng phổ của ME và SP.
Bước sóng (nm) Nông độ ME-SP (ng/ml) Độ hâp thụ ME Độ hâp thụSP Tông độ hấp thụ ME+SP Độ hâp thụ hỗn hợp ME, SP ™ x , 0 0 T (%) Thống kê 232 4-6 0,071 0,211 0,282 0,283 100,35 Xtb=100,14% RSD = 0,21% n = 3 10-15 0,183 0,541 0,724 0,725 100,14 20-30 0,360 1,070 1,430 1,429 99,93 319 4-6 0,199 0 , 0 0 1 0 , 2 0 0 0 , 2 0 1 100,50 Xtb-1 0 0 ,2 0 % RSD = 0,30% n = 3 10-15 0,497 0 ,002 0,499 0,500 100,20 20-30 0,994 0,004 0,998 0,997 99,90
Nhận xét: Bảng 2.3 cho thấy độ hấp thụ quang của dung dịch hỗn hợp Metronidazol và Spiramycin có tính cộng phổ rõ ràng ở 2 bước sóng phân tích.
2.3.3. Phân tích chế phẩm Rodogyl
i- Chuẩn bị dung dịch chuẩn:
Cân chính xác khoảng 50mg ME chuẩn, cho vào bình định mức lOOml, thêm 70ml NaOH 0,1N, lắc đều cho tan hết, bổ sung dung dịch NaOH 0,1N vừa đủ. Lọc, bỏ 20ml dịch lọc đầu. Lấy chính xác Iml dịch lọc tiếp theo, cho vào bình định mức 50ml, thêm NaOH 0,1N vừa đủ, lắc đều, thu được dung dịch chuân Metronidazol lOßg/ml trong môi trường NaOH 0,lN.
Cân chính xác khoảng 75mg SP chuẩn, cho vào bình định mức lOOml, thêm 70ml methanol tinh khiết, lắc đều cho tan hết, bổ sung methanol vừa đủ. Lọc, bỏ 20ml dịch lọc đầu. Lấy chính xác Iml dịch lọc tiếp theo cho vào bình định mức 50ml, thêm NaOH 0,1N vừa đủ, lắc đều, thu được dung dịch chuẩn Spiramycin 15ịug/ml trong môi trường NaOH 0, ỈN.
4- Chuẩn bị mẫu thử:
Cạo bỏ lóp bao film bên ngoài, cân 10 viên, tính khối lượng trung bình viên, nghiền kỹ thành bột mịn trong cối sứ. Cân một lượng bột tương ứng với khoảng lOmg ME cho vào bình định mức lOOml. Thêm 40ml methanol và 40ml NaOH 0,1N, lắc kỹ, đem siêu âm 10 phút, bổ sung NaOH vừa đủ tới vạch. Lọc, bỏ 20ml dịch lọc đầu, lấy chính xác lOml dịch lọc tiếp theo cho vào bình định mức lOOml, thêm NaOH 0,1N vừa đủ, lắc đều, thu được dung dịch thử.
4- Đo độ hấp thụ quang của mẫu thử:
Đo độ hấp thụ quang của các dung dịch chuẩn và thử tại 2 bước sóng đã chọn với mẫu trắng là dung dịch NaOH 0,1N.
4- Cách tính nồng độ của Spiramycin và Metronidazol sau khi đo độ hấp thụ quang của các dung dịch chuẩn và thử:
■ Các quy ước về thông số:
là độ hấp thụ quang của MS tại bước sóng 3 19nm (đo được) Ả™/ là độ hấp thụ quang của MS tại bước sóng 232nm (đo được).
là độ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn ME tại bước sóng
319nm (đo được)
A™' là độ hấp thụ quang của ME trong dung dịch thử tại bước sóng 319nm.
là độ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn ME tại bước sóng
232nm (đo được)
A™¡,^ là độ hấp thụ quang của ME trong dung dịch thử tại bước sóng
232nm.
Asp là độ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn SP tại bước sóng
232nm (đo được)
A™ là độ hấp thụ quang của SP trong dung dịch thử tại bước sóng 232nm.
là nồng độ dung dịch chuẩn của ME (|ag/ml) (biết trước) cịp là nồng độ dung dịch chuẩn của SP (|Lig/ml) {biết trước) C™ là nồng độ của SP trong dung dịch thử
là nồng độ của ME trong dung dịch thử
■ Xây dựng công thức tính nồng độ ME và SP trong dung dịch thử:
* ở bước sóng 319nm:
Độ hấp thụ quang của MS chính là độ hấp thụ quang của ME trong hỗn họp.
Vậy nên, nồng độ ME trong dung dịch thử tính được theo công thức sau: ^ C H \ .TH \ C ™ _ L y ME A m E / 1 \ ME jC H \ V A me * Tại bước sóng 232nm: Độ hấp thụ của MS là: .7 7 /2 _ .TH 2 .TH Ams ~ Ame Asp
Dựa vào các thông số đã đo được và tính được ở trên, độ hấp thụ của ME trong dung dịch hỗn hợp thử ở bước sóng 232nm tính được theo công
^ T H .C H 2
thức: (3)
Từ (2) và (3), ta có thể tính được độ hấp thụ quang của SP trong dung dịch thử ở sóng 232nm.
Do đó, nồng độ của Spiramycin trong dung dịch thử tính được theo công thức:
.in
^ T H ^ A sP ^ C sF / 4 X
L y SP .C H ^ ^
Äsp
4- Cách tính hàm lượng hoạt chất trong viên:
■ Hàm lượng hoạt chất trong viên được tính theo công thức sau:
H (mg/v) = — X / X c
m
■ Trong đó :
M là khối lượng trung bình một viên (g). f là hệ số pha loãng
c là nồng độ đo được của Metronidazol và Spiramycin. m là khối lượng bột cân.
4- Ket quả định lượng:
Với kết quả đo quang của các dung dịch chuẩn và thử ở 2 bước sóng đã xác định, áp dụng công thức tính mới xây dựng, chúng tôi thu được kết quả định lượng ME và SP ở bảng 2.4.
Bảng 2.4. Kết quả định lượng các thành phần trong chế phẩm Rodogyl
M cân (g)
Nông độ thu được (|Lig/ml) Hàm lượng tính được (mg/ml) % Hàm lượng đạt được ME SP ME SP ME SP 0,0520 10,56 16,44 119,72 186,39 95,78 96,93 0,0545 11,20 17,24 121,16 186,49 96,92 96,98 0,0508 10,45 16,11 121,28 186,96 97,02 97,22 0,0533 10,80 17,36 119,46 185,07 95,57 96,24 0,0515 10,67 16,35 122,15 187,17 97,72 97,33 xểỉ: bảng 2.4 cho thấy:
Ậ Hàm lượng ME trong chế phẩm là 119,46 - 122,15mg, đạt quy định theo tiêu chuẩn của nhà sản xuất (118,7-131,3n^g)•
i■ Hàm lượng SP trong chế phẩm là 185,07 - 187,17mg; tương đương với 721.773-729.963 UI, đạt quy định theo tiêu chuẩn của nhà sản xuất (712.000-788.000 UI).
2.3.4. Đánh giá độ đúng và độ lặp lại của phương pháp
Một phương pháp phân tích thưÒTig được đánh giá bằng cách khảo sát độ đúng và độ lặp lại.
4- Nguyên tắc:
Độ lặp lại được xác định dựa trên các dữ liệu (còn gọi là số liệu) của N phép thử song song trên cùng một mẫu tại một phòng thí nghiệm trong cùng điều kiện (do người thực hiện trong khoảng thời gian ngắn).
Độ đúng được xác định thông qua khả năng thu hồi kết quả phân tích khi dùng phương pháp thêm chuẩn.
4 Tiến hành:
Chúng tôi tiến hành khảo sát độ lặp lại và độ đúng trên chế phẩm Rodogyl. Kết quả khảo sát độ lặp lại được trình bày ở bảng 2.5.
Bảng 2.5. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp.
TT Bột viên (g) Metronidazol Spiramycin Nông độ (ng/ml) Hàm lượng (mg/v) Nông độ (ịig/ml) Hàm lượng (mg/v) 1 0,0485 9,85 119,73 15,35 186,59 2 0,0477 9,82 121,36 15,10 186,63 3 0,0483 9,73 120,51 15,21 185,65 4 0,0476 9,77 1 2 1 , 0 0 15,09 186,90 5 0,0480 9,73 119,51 15,23 187,01 Xử lý thông kê Giá trị trung bình ( X t b) 120,42 186,56 Độ lệch chuân (s) 0,7957 0,5366
Độ lệch chuân tương đôi
RSD (%) 0,6607 0,2877
Sai sô chuân (Sx) 0,3552 0,2396
Khoảng tin cậy (ụ,) 0,9875 0,6660
Sai sô tương đôi (A%) 0,8200 0,3570
Nhận xét: Kết quả cho thấy phương pháp có độ lặp lại tốt với cả hai