Hợp chất DS4 được phân lập dưới dạng chất bột màu trắng. Các phổ 1H- NMR và 13C-NMR của nó gần như trùng khớp với các phổ của DS3 ngoại trừ việc xuất hiện thêm các tín hiệu của một nhóm metoxi tại C 56,78 và H 3,33 (3H, s).
Đặng Ngọc Bách 33 Hóa hữu cơ
Hình 3.4.a. Phổ 1H-NMR của DS4
Đặng Ngọc Bách 34 Hóa hữu cơ
Hình 3.4.c. Phổ 13C-NMR của DS4
Đặng Ngọc Bách 35 Hóa hữu cơ Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của DS4 C aδC δC b,c δH b,d dạng pic (J, Hz) HMBC (H→C) 1 36,9 36,79 1,15/1,80 m 2 31,6 31,50 1,50/1,82 m 3 71,6 71,48 3,60 m 4 42,5 42,15 2,27/2,33 m 2, 3, 5, 6, 10 5 146,2 146,19 - 6 120,9 120,80 6,06 dd (5,4; 1,2) 4, 7, 10 7 74,1 74,01 3,95 t (3,5) 5 8 37,3 37,25 1,47 m 9 42,9 42,80 1,28 m 7 10 37,6 37,50 - 11 20,9 20,88 1,39/1,44 m 12 39,2 39,12 1,20/1,94 m 13 42,2 42,35 - 14 49,2 49,12 1,48 m 15 24,4 24,34 0,96/1,60 m 16 28,8 28,32 1,85 m 15, 17 17 55,9 55,85 1,14 m 18 11,6 11,54 0,63 s 12, 13, 17 19 18,4 18,33 0,96 s 1, 5, 9, 10 20 36,0 35,87 1,37 m 21 18,9 18,81 0,89 d (7,0) 17, 20, 21 22 36,3 36,26 0,98/1,30 m 23 23,9 23,82 1,11/1,31 m 24, 28 24 39,7 39,62 1,07/1,15 m 25 28,2 28,11 1,50 m 24, 26, 27 26 22,7 22,65 0,85 d (7,0) 24, 25, 27 27 23,0 22,90 0,83 d (7,0) 24, 25, 26 OMe 56,9 56,87 3,68 s 7 a
Đặng Ngọc Bách 36 Hóa hữu cơ
Hình 3.4.e. Phổ HMBC của DS4
HO OMe
Hình 3.4.f. Các tương tác HMBC chính của DS4
So sánh số liệu phổ 13C-NMR của DS4 (Bảng 3.4) với các số liệu tương ứng
của 7β-metoxicholest-5-en-3β-ol [15] cho phép xác định vị trí của nhóm metoxi
xuất hiện thêm tại C-7. Ngoài ra, phân tích chi tiết các tương tác HMBC (Hình
3.4.f) cho phép xác định hợp chất DS4 là 7β-metoxicholest-5-en-3β-ol. 3.2.1.5. Hợp chất DS5: cholest-5-en-3β-ol
Các phổ 1H-NMR và 13C-NMR của nó có dạng tương tự như các phổ của DS2 và DS3. Sự khác biệt dễ nhận thấy nhất là sự mất đi các tín hiệu của một nhóm oximetin trên các phổ của DS5.
Đặng Ngọc Bách 37 Hóa hữu cơ
Hình 3.5.a. Phổ 1H-NMR của DS5
Đặng Ngọc Bách 38 Hóa hữu cơ
Hình 3.5.c. Phổ 13C-NMR của DS5
Đặng Ngọc Bách 39 Hóa hữu cơ Bảng 3.5. Số liệu phổ NMR của DS5 C aδC δCb,c δH b,d dạng pic (J, Hz) HMBC (H→C) 1 37,5 37,33 1,05/1,82 m 3, 5, 10, 19 2 31,6 31,70 1,51/1,81 m 3, 4 3 71,3 71,85 3,49 m 4 42,4 42,38 2,22/2,27 m 2, 3, 5, 6, 10 5 141,2 140,82 - 6 121,3 121,77 5,32 dd (1,5; 3,0) 4, 7, 8, 10 7 32,0 31,97 1,41/1,99 m 8 32,0 31,97 1,47 m 9 50,5 50,20 0,90 m 10 36,5 36,57 - 11 21,2 21,16 1,42/1,48 m 12 40,0 39,86 1,98 13 42,4 42,38 - 14 56,9 56,23 1,07 m 15 24,3 24,36 1,05/1,54 m 16 28,3 28,31 1,23/1,81 m 17 56,5 56,83 0,98 m 18 12,0 11,94 0,65 s 12, 13, 14, 17 19 19,4 19,47 0,98 s 1, 5, 9, 10 20 35,8 35,86 1,37 m 21 18,8 18,79 0,89 d (6,5) 17, 20, 22 22 36,4 36,27 0,97/1,30 m 23 24,1 23,91 1,09/1,31 m 24 39,6 39,59 0,98/1,15 m 25 28,0 28,09 1,19 m 26 22,6 22,64 0,84 d (6,5) 24, 25, 27 27 22,9 22,90 0,83 d (6,5) 24, 25, 26 a
Đặng Ngọc Bách 40 Hóa hữu cơ
Hình 3.5.e. Phổ HMBC của DS5
Hình 3.5.f. Các tương tác HMBC chính của DS5
Phân tích chi tiết các tương tác HMBC (Hình 3.5.f) kết hợp so sánh số liệu phổ 13C-NMR của DS5 với các số liệu đã được công bố trong tài liệu tham khảo
[16] cho phép xác định hợp chất DS5 là cholest-5-en-3β-ol. 3.2.1.6. Hợp chất DS6: Natri cholest-5-en-3β-sunfat
Các phổ 1H-NMR và 13C-NMR của DS6 gần như trùng khớp so với các phổ tương ứng của DS5. Sự khác biệt dễ nhận thấy nhất là sự dịch chuyển rất mạnh về phía vùng trường thấp của các tín hiệu proton và cacbon tại C-3 trên các phổ của DS6. Không có bất kỳ tín hiệu của một nhóm thế nào xuất hiện thêm trên các phổ của DS6 cho phép khẳng định nhóm OH tại vị trí C-3 của DS6 đã bị sunfat hóa, một quá trình xảy ra khá phổ biến ở các hợp chất thiên nhiên biển. Giá trị độ dịch
Đặng Ngọc Bách 41 Hóa hữu cơ
chuyển 1H-NMR của H-3 (H 4.14) hoàn toàn phù hợp với số liệu đã được công bố của hợp chất cholesterol-3-sunfat tại H 4.22 [17].
Hình 3.6.a. Phổ 1H-NMR của DS6
Đặng Ngọc Bách 42 Hóa hữu cơ
Hình 3.6.c. Phổ 13C-NMR của DS6
Đặng Ngọc Bách 43 Hóa hữu cơ Bảng 3.6. Số liệu phổ NMR của DS6 C aδC δCb,c δH b,d dạng pic (J, Hz) HMBC (H→C) 1 37,33 37,16 1,02/1,79 m 3, 5 2 31,70 28,85 1,57/1,99 m 3 3 71,85 79,09 4,14 m 3, 5, 6 4 42,38 39,22 2,28/2,45 m 5 140,82 140,02 - 6 121,77 122,53 5,30 br s 4, 7, 10 7 31,97 31,96 1,46/1,90 m 5, 6, 8, 14 8 31,97 31,07 1,36 m 9 50,20 50,07 0,85 m 10 36,57 36,22 - 11 21,16 21,07 1,43 12 39,86 39,77 1,47/1,90 m 13 42,38 42,35 - 14 56,23 56,19 1,03 m 13 15 24,36 24,32 1,08/1,27 m 16 28,31 28,26 1,19/1,78 m 15, 17 17 56,83 56,74 0,92 m 18 11,94 11,88 0,61 s 19 19,47 19.31 0,93 s 20 35,86 35,83 1,33 m 21 18,79 18,73 0,85 d (6,5) 17, 20 22 36,27 36,51 1,26/0,99 m 23 23,91 23,88 1,19/0,97 m 24 39,59 39,54 1,07/1,38 m 25 28,09 28,03 1,36 m 24 26 22,64 22,58 0,79 d (6,5) 24, 25, 27 27 22,90 22,84 0,80 d (6,5) 24, 25, 26 a
Đặng Ngọc Bách 44 Hóa hữu cơ
Hình 3.6.e. Phổ HMBC của DS6
Hình 3.f. Các tương tác HMBC chính của DS6
Phân tích chi tiết các tương tác HMBC (Hình 3.f) cho phép xác định hợp
Đặng Ngọc Bách 45 Hóa hữu cơ
Tập hợp các chất đã phân lập được từ loài cầu gai Diadema savignyi
DS1: 5α,8α-epiđioxi-cholest-6-en-3β-ol DS2: cholest-5-en-3β,7α-điol
DS3: cholest-5-en-3β,7β-điol DS4: 7β-metoxicholest-5-en-3β-ol
DS5: cholest-5-en-3β-ol DS6: natri cholest-5-en-3β-sunfat
3.2.2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất
Ung thư là một căn bệnh nan y mà cho tới nay các việc chữa trị vẫn còn gặp nhiều khó khăn. Theo các số liệu thống kê gần đây, tỷ lệ người mắc bệnh ung thư ngày càng gia tăng. Chính vì vậy, bên cạnh việc đầu tư cho các chuẩn đoán sớm các bệnh ung thư, việc tìm kiếm các phương pháp điều trị mới, các thuốc mới là vô cùng cần thiết đặc biệt là các hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên. Trong lĩnh vực tìm kiếm các chất chống ung thư, việc tìm kiếm, sàng lọc và đánh giá các chất có khả năng ức chế và tiêu diệt các tế bào khối u dựa trên khả năng gây độc các dòng tế bào khối u thực nghiệm gây ung thư là vô cùng quan trọng.
Trong khuôn khổ luận văn, chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được từ loài cầu gai Diadema savignyi trên với ba
Đặng Ngọc Bách 46 Hóa hữu cơ
dòng tế bào là HL-60 (ung thư máu), PC-3 (ung thư tuyến tiền liệt) và SNU-C5 (ung thư ruột kết). Kết quả được đưa ra trong Bảng 3.7.
Bảng 3.7. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào Hợp chất Giá trị IC50 (M) HL-60 PC-3 SNU-C5 DS1 4,95±0,07 6,99±0,28 6,14±0,22 DS2 7,89±0,18 29,22±0,17 30,70±0,27 DS3 22,36±0,84 27,94±0,63 31,20±1,04 DS4 5,33±0,03 9,22±0,67 23,73±0,75 DS5 - - - DS6 26,41±0,81 68,87±6,08 - Mitoxantronea 0,06±0,02 1,05±0,34 19,00±1,40 a Chất chuẩn dương
Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào cho thấy, hợp chất DS1 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh trên cả ba dòng tế bào ung thư người được thử nghiệm là HL-60 (ung thư máu), PC-3 (ung thư tuyến tiền liệt) và SNU-C5 (ung thư ruột kết) với giá trị IC50 tương ứng là 4,95, 6,99 và 6,14 µM. Hợp chất DS4 thể hiện hoạt tính mạnh trên hai dòng tế bào là HL-60 (IC50 = 5,33 µM) và PC-3 (IC50 = 9,22 µM) và hoạt tính trung bình trên dòng SNUC-5 (IC50 = 23,73 µM). Hợp chất DS2 chỉ thể hiện hoạt tính mạnh trên dòng HL-60 với giá trị IC50 = 7,89 µM và hoạt tính trung bình trên các dòng PC-3 (IC50 = 29,22 µM) và SNU-C5 (IC50 = 30,70 µM).
Ngoài ra, hợp chất DS3 thể hiện hoạt tính trung bình trên cả ba dòng tế bào ung thư người được thử nghiệm. Hợp chất DS6 thể hiện hoạt tính trung bình trên dòng HL-60, hoạt tính yếu trên dòng PC-3 và không thể hiện hoạt tính trên dòng SNU-C5. Hợp chất DS5 không có biểu hiện hoạt tính trên cả ba dòng tế bào ung thư đã thử nghiệm.
Đặng Ngọc Bách 47 Hóa hữu cơ
KẾT LUẬN
1. Bằng các phương pháp sắc ký kết hợp, 06 hợp chất đã được phân lập từ
dịch chiết metanol của loài cầu gai Diadema savignyi.
2. Cấu trúc của 06 các hợp chất này được xác định nhờ vào các phương pháp
phổ hiện đại là; DS1: 5α,8α-epiđioxi-cholest-6-en-3β-ol; DS2: cholest-5-en-3β,7α- điol; DS3: cholest-5-en-3β,7β-điol; DS4: 7β-metoxicholest-5-en-3β-ol; DS5: cholest-5-en-3β-ol; DS6: natri cholest-5-en-3β-sunfat.
3. Đây là lần đầu tiên các hợp chất này được phân lập từ loài cầu gai
Diadema savignyi.
4. Đã tiến hành thử nghiệm hoạt tính gây độc đối với 3 dòng tế bào là HL-60 (ung thư máu), PC-3 (ung thư tuyến tiền liệt) và SNU-C5 (ung thư ruộ kết) đối với các hợp chất đã phân lập được. Hợp chất DS1 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh trên cả ba dòng tế bào ung thư người, DS4 thể hiện hoạt tính mạnh trên hai dòng tế bào là HL-60 (ung thư máu) và PC-3(ung thư tuyến tiền liệt). DS2 chỉ thể hiện hoạt tính mạnh trên dòng HL-60 (ung thư máu), DS3 thể hiện hoạt tính trung bình trên cả ba dòng tế bào, DS6 thể hiện hoạt tính trung bình trên dòng HL-60 (ung thư máu) yếu trên dòng PC-3 (ung thư tuyến tiền liệt) và không thể hiện hoạt tính trên dòng SNU-C5 (ung thư ruộ kết). Hợp chất DS5 không có biểu hiện hoạt tính trên cả ba dòng tế bào ung thư đã thử nghiệm.
Đặng Ngọc Bách 48 Hóa hữu cơ
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Châu Văn Minh, Nguyên Xuân Cường, Nguyễn Hải Đăng, Nguyễn Phương Thảo, Trần Hồng Quang, Nguyễn Hữu Tùng, Nguyễn Hoài Nam, Nguyễn Văn Hùng, Pham Văn Kiệm (2012), “Điểm lại các nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học một số loài sinh vật biển Việt Nam trong giai đoạn 2006-
2012”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 50(6), tr. 827-829.
2. Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm, Nguyễn Văn Hùng, Nguyễn Hoài Nam, Phạm
Văn Cường (2012), Dược liệu biển Việt Nam – Thực trạng và cơ hội phát
triển, NXB Khoa học tự nhiên và Công nghệ, tr. 55-56.
3. Phạm Thị Thùy (2010), Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất sản
phẩm trứng cầu gai lên men tự nhiên, Luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Nha
Trang.
4. Nguyễn Đình Triệu (2013), Các phương pháp vật lý hiện đại ứng dụng trong
hóa học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội.
Tiếng Anh
5. http://animaldiversity.org/accounts/Diadema_savignyi/.
6. Dictionary of Natural Products on DVD, version 18.1, Copyright® 1982-2009 CRC Press.
7. http://gophuquoc.vn/vn/article_detail.aspx?mid=5&aid=294.
8. Kol'tsova EA, Maksimov OB (1981), “Pigments of sea urchins Diadema setosum and Diadema savignije”, Quinoid pigments of echinoderms,
Khimiya Prirodnykh Soedinenii, 1, p. 115.
9. Minh CV, Kiem PV, Huong le M, Kim YH (2004), “Cytotoxic constituents of
Đặng Ngọc Bách 49 Hóa hữu cơ
10. Yamada K, Tanabe K, Miyamoto T, Kusumoto T, Inagaki M, Higuchi R (2008), “Isolation andstructure of a monomethylated ganglioside possessing neuritogenic activity from the ovary of the sea urchin Diadema setosum”,
Chem Pharm Bull (Tokyo), 56(5),pp. 734-737.
11. Mishchenko NP, Fedoreyev SA, Van TTT, Hieu VMN, Ly BM (2013),
Identification of polyhydroxylated naphoquinone pigments from Nha Trang Bay sea urchins,The 2ndinternational workshop on marine bioresources of Vietnam, Hanoi, pp. 18-24.
12.Carmichael J, DeGraff WG, Gazdar AF, Minna JD, Mitchell JB (1987),
“Evaluation of a Tetrazolium-based Semiautomated Colorimetric Assay:
Assessment of Radiosensitivity”, Cancer Research, 47(4), pp. 943-946.
13. Ioannou E, Abdel-Razik AF, Zervou M, Christofidis D, Alexi X, Vagias C, AlexisMN, Roussis V (2009), “pidioxysterols from the gorgonian Eunicella cavolini and the ascidian Trididemnum inarmatum: isolation and evaluation of their antiproliferativeactivity”, Steroids, 74(1), pp. 73-80.
14. Carvalho JF, Cruz Silva MM, Moreira JN, Simoes S, Sa EMML (2009),
“Efficient chemoenzymatic synthesis, cytotoxic evaluation, and SAR of
epoxysterols”, J MedChem, 52(13), pp. 4007-4019.
15. Tian X-R, Tang H-F, Li Y-S, Lin H-W, Chen X-L, Ma N, Yao M-N, Zhang P-
H(2011), “New cytotoxic oxygenated sterols from the marine bryozoan Cryptosula pallasiana”, Marine Drugs, 9(2), pp. 162-183.
16. J. Buchanan H, J. Cox P, M. S. V. Doidge-Harrison S, Alan Howie R, Jaspars M,L. Wardell J (1997), “Syntheses and structures of 3-stannylcholest-5-ene species”, Journal ofthe Chemical Society, Perkin Transactions 1, (24), pp.
3657-3664.
17. D'Auria MV, Finamore E, Minale L, Pizza C, Riccio R, Zollo F, Pusset M, Tirard P (1984), “Steroids from the starfish Euretaster insignis: a novel
Đặng Ngọc Bách 50 Hóa hữu cơ
group of sulphated 3β,21- dihydroxysteroids”, Journal of the Chemical