7. Điểm mới của đề tài
2.2. Môi trƣờng
2.2.1. Môi trường phân lập
Môi trường Gause I
Hóa chất g Tinh bột tan 20 KH2PO4 0,5 KNO3 1,0 MgSO4.7H2O 0,5 NaCl 0,5 Nƣớc cất 1000ml FeSO4 0,01 Thạch agar 20 pH 7,2
21
Môi trường Czapeck- tinh bột
Hóa chất g Tinh bột tan 20 KCl 0,5 NaNO3 3 MgSO4.7H2O 0,5 K2HPO4 1 CaCO3 3 FeSO4 (dạng vết) 0,01 Thạch agar 20 pH 7,2 Nƣớc cất 1000ml
Môi trường Czapeck - glucose
Hóa chất g Glucose 20 KCl 0,5 NaNO3 3 MgSO4.7H2O 0,5 K2HPO4 1 CaCO3 3 FeSO4 (dạng vết) 0,01 Thạch agar 20 pH 7,0 Nƣớc cất 1000ml
2.2.2. Môi trường bảo quản và giữ giông
22
2.2.3. Môi trường thử hoạt tính enzyme
Thử hoạt tính: thành phần khoáng vẫn giống nhƣ trên nhƣng thay nguồn cacbon bằng giấy lọc, CMC, các phế phụ phẩm nông nghiệp.
Môi trường CMC Hóa chất g NaNO3 1,5 K2HPO4 0,5 MgSO4.7H2O 0,5 KCl 0,5 NaCl 10 Thạch agar 20 CMC 10 Nƣớc cất 1000ml
Môi trường bột giấy
Hóa chất g NaNO3 1,5 K2HPO4 0,5 MgSO4.7H2O 0,5 KCl 0,5 NaCl 10 Thạch agar 20 Bột giấy 10 Nƣớc cất 1000ml
23
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu
Dùng dao lấy khoảng 10 – 15 g đất theo các độ sâu: 0 cm, 5 cm, 10 cm, 15 cm, 20 cm, 25 cm, 30 cm tại đồi Thằn Lằn, Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc (hình 2.1). Các mẫu đất đƣợc đựng vào túi nilon đã khử trùng, buộc kín miệng túi. Mỗi túi đựng một mẫu đất ở một độ sâu nhất định. Trên mỗi túi ghi rõ nơi lấy mẫu, loại đất, thời gian và độ sâu lấy mẫu. Sau đó, các mẫu đất đƣợc chuyển về phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập ngay hoặc có thể bảo quản trong tủ lạnh ở 40C tối đa 6 ngày.
Hình 2.1. Bản đồ khu vực đất đồi Xuân Hòa, Phúc Yên,Vĩnh Phúc
2.3.2. Phương pháp phân lập xạ khuẩn từ mẫu đất
Có thể dùng phƣơng pháp cấy trải trên môi trƣờng thạch đĩa hoặc trộn trong thạch.
2.3.2.1. Phân lập bằng phương pháp cấy trải trên bề mặt môi trường thạch đĩa
Bƣớc 1: Phân phối môi trƣờng vô trùng vào đĩa Petri vô trùng bao gồm:
Đun môi trƣờng cho tan thạch, để nguội đến 45 - 500 C.
24
Lật ngƣợc đĩa Petri – Ghi tên môi trƣờng, ngày tháng lên mặt của đĩa Petri.
Đặt đĩa Petri trên một giá đỡ gần ngọn lửa đèn cồn.
Tay phải cầm bình môi trƣờng. Dùng ngón út và ngón nhẫn của bàn tay trái mở nút môi trƣờng.
Dùng các ngón tay còn lại của bàn tay trái hé mở nắp đĩa Petri rồi rót môi trƣờng vào đĩa Petri ( khoảng 20 – 25 ml cho đĩa Petri loại 10cm x 10cm Đặt đĩa Petri xuống mặt bàn phẳng để nguội.
Tất cả các thao tác trên cần làm nhanh,gọn ở gần ngọn đèn. Nếu có điều kiện nên tiến hành trong tủ vô trùng. Nếu làm ở phòng làm việc thì nên tránh gió lùa.
Bƣớc 2: Chuẩn bị và pha loãng dịch huyền phù đất
Dùng dao vô trùng lấy khoảng 10 – 15g đất trồng cho vào cối sứ nghiền nhỏ, trộn đều, sau đó cân 1g cho vào bình nón chứa 99ml nƣớc cất vô trùng, khuấy bằng đũa thủy tinh cho tan hết đất. Ta có dịch pha loãng 10-2
Lấy 1ml nƣớc dịch huyền phù đất ở độ pha loãng 10-2 đƣa vào ống nghiệm chứa 9ml nƣớc cất vô trùng. Trộn đều bằng máy trộn dung dịch, hoặc lắc bằng tay vài phút ta có độ pha loãng 10-3 .Tiếp tục làm nhƣ trên ta có một loạt
độ pha loãng liên tục dịch đất khác nhau nhƣ ý ở cấp độ pha loãng 10-n
25
Bƣớc 3: Cấy dịch huyền phù đất lên môi trƣờng thạch trong đĩa Petri
2.3.2.2. Phân lập bằng phương pháp pha loãng dịch đất trong môi trường thạch nóng chảy
Tiến hành cân mẫu tƣơng tự nhƣ trên, song dịch đất sau khi đã pha loãng sơ bộ, đƣợc tiếp tục pha loãng ở môi trƣờng thạch nóng chảy đã để nguội đến 45 - 500C đbình nón. Lắc đều môi trƣờng rồi đổ vào các đĩa Petri. Gói các đĩa Petri lại và để vào tủ ấm, sau đó em ra chọn đĩa Petri có số lƣợng khuẩn lạc nằm trong khoảng 30 – 300 CFU/đĩa để tính số CFU trong 1ml mẫu ban đầu.
2.3.3. Phương pháp bảo quản chủng giống
Sau từ 7 - 12 ngày nuôi cấy mẫu trong tủ ấm 28 - 30ºC, chuyển sang để ở tủ lạnh nhiệt độ 2 - 4ºC. Cấy chuyền định kì 2 tháng 1 lần trên môi trƣờng Gause I. Trƣớc khi sử dụng giống cần hoạt hóa xạ khuẩn [1].
2.3.4. Phương pháp quan sát hình thái xạ khuẩn
Quan sát hình thái của hệ sợi khí sinh
Dựa theo tài liệu của ISP, Gause và cộng sự (1983), xác định màu sắc của HSKS dựa vào bảng màu của Tresner và Buckus. Căn cứ vào màu sắc HSKS của các chủng mới phân lập để phân thành 8 nhóm màu: White (W) nhóm trắng, Gray (Gy) nhóm xám, Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm vàng, Green (Gn) nhóm xanh, Blue (B) nhóm xanh da trời, Violet (V) nhóm tím, và nhóm màu không xác định (X).
Quan sát màu sắc của hệ sợi cơ chất
Màu sắc của HSCC đƣợc xác định qua quan sát trực tiếp trên môi trƣờng thạch đĩa hoặc thạch nghiêng và mô tả theo thang màu chuẩn của Bondarsev (1953), Tresner và cộng sự (1961).
Quan sát cuống sinh bào tử
Xạ khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng Gause I có găm lamen nghiêng 45ºC trên bề mặt môi trƣờng. Sau 7 – 9 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ
26
phòng lấy ra quan sát hình dạng chuỗi sinh bào tử trên lamen dƣới kính hiển vi quang học. Chuỗi sinh bào tử có dạng thẳng hay lƣợn sóng ký hiệu là RF (Rectus Flexibilis), hình móc câu hay hình xoắn không hoàn toàn ký hiệu là RA (Rectinaculum Apertum) và xoắn hoàn toàn ký hiệu là S (Spira) [21
2.3.5. Phương pháp xác định khả năng sinh cellulase của xạ khuẩn
Phƣơng pháp nhỏ dịch: Nuôi lắc xạ khuẩn trong môi trƣờng Gause I. Lắc 160 vòng/ phút trong 3 ngày. Sau đó ly tâm 4000 vòng/phút loại sinh khối. Nhỏ 0,1ml dịch enzyme vào lỗ thạch trong hộp petri trong môi trƣờng chứa cơ chất và thạch. Để hộp lồng vào trong tủ lạnh 4h, sau đó nuôi trong tủ ấm 2 ngày. Thử hoạt tính bằng thuốc thử rồi đo vòng phân giải [7].
Xác định hoạt tính cellulase bằng môi trƣờng chứa 1% CMC và bột giấy, thử bằng thuốc thử lugol I.
Phƣơng pháp cấy chấm điểm: Chuẩn bị môi trƣờng chứa thạch đĩa chứa môi trƣờng chứa 1% CMC hoặc bột giấy. Dùng que cấy chấm nhẹ vào khuẩn lạc sau đó chấm nhẹ một điểm xuống bề mặt thạch đĩa. Nuôi khuẩn lạc trong tủ ấm 4 ngày mang ra thử hoạt tính với thuốc thử lugol I, đo vòng phân giải [7]. Quan sát hình thái xạ khuẩn chụp ảnh bào tử, hệ sợi trên kính hiển vi 1000 lần và co thể có một số mẫu của chủng tuyển chọn chụp hiển vi điện tử. Nhiều nơi thuê chụp đƣợc nhƣ Viện Công nghệ Sinh học, Viện Pasteur, …
27
2.3.6. Phương pháp toán học trong thống kê và xử lý số liệu.
Tôi xử lý các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phƣơng pháp:
Số trung bình cộng: dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm: 1 1 n i i X X n
Trung bình bình phƣơng các sai lệch:
1 ) ( 1 2 n X X n i i
Sai số đại diện của trung bình cộng:
M = S n Hệ số biến thiên: Cv = S X x 100% Trong đó: n: Số lần nhắc lại
Xi: Giá trị của lần thứ i S: Độ lệch chuẩn
28
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn trong đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc
3.1.1. Phân lập xạ khuẩn trong đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc Phúc
3.1.1.1. Đặc điểm khuẩn lạc
Phƣờng Xuân Hòa có tọa độ 21°17′18″B 105°43′35″Đ nằm trong khu vực châu thổ sông Hồng thuộc trung du và miền núi phía bắc, diện tích tự nhiên là 423,9 ha. Nhiệt độ trung hàng năm là 24°C. Lƣợng mƣa trung bình hàng năm đạt 1.400 mm đến 1.600 mm. Trong đó, lƣợng mƣa bình quân cả năm của vùng đồng bằng và trung du tại trạm Vĩnh Yên là 1.323,8 mm. Lƣợng mƣa phân bố không đều trong năm, tập trung chủ yếu từ tháng 5 đến tháng 10, chiếm 80% tổng lƣợng mƣa cả năm. Mùa khô từ tháng 11 đến tháng 4 năm sau chỉ chiếm 20% tổng lƣợng mƣa trong năm. Số giờ nắng: Tổng số giờ nắng bình quân trong năm là 1.400 đến 1.800 giờ, trong đó, tháng có nhiều giờ nắng trong năm nhất là tháng 6 và tháng 7, tháng có ít giờ nắng trong năm ít nhất là tháng 3. Chế độ gió: Trong năm có 2 loại gió chính: Gió đông nam thổi từ tháng 4 đến tháng 9; gió đông bắc: thổi từ tháng 10 đến tháng 3 năm sau. Độ ẩm không khí: Độ ẩm bình quân cả năm là 83%. Nhìn chung độ ẩm không có sự chênh lệch nhiều qua các tháng trong năm giữa vùng núi với vùng trung du và vùng đồng bằng. Vùng núi độ ẩm không khí đƣợc đo tại trạm Tam Đảo, vùng trung du đƣợc đo tại trạm khí tƣợng Vĩnh Yên. Lƣợng bốc hơi: Bốc hơi bình quân trong năm là 1.040 mm, lƣợng bốc hơi bình quân trong 1 tháng từ tháng 4 đến tháng 9 là 107,58 mm, từ tháng 10 đến tháng 3 năm sau là 71,72 mm.
29
Tiến hành lấy mẫu đất đồi Xuân Hòa ở các độ sâu khác nhau theo thứ tự 0cm, 5cm,10cm, 15cm, 20cm, 25cm, 30cm. Chuẩn bị 3 môi trƣờng phân lập: Gause I, Czepeck- tinh bột, Czepeck. Tiến hành phân lập theo phƣơng pháp phân lập xạ khuẩn mẫu đất ở trên (mục 2.3.2 chƣơng 2). Chọn các hộp petri mà ở đó các khuẩn lạc mọc riêng rẽ, có thể tuyển chọn đƣợc, không thấy có nấm mốc, không xét các khuẩn lạc nhẵn, nhày, ƣớt, loại bỏ các hộp petri không có khuẩn lạc hoặc các khuẩn lạc phát triển dày khít nhau. Xạ khuẩn mới phân lập thƣờng có hoạt tính kháng sinh chống vi sinh vật kiểm định, nên có thể xung quanh khuẩn lạc sẽ có vòng vô khuẩn. Một số khuẩn lạc xạ khuẩn thƣờng có dạng tia phóng xạ. Quan sát sau 5 ngày, chúng tôi đã thu đƣợc 18 khuẩn lạc xạ khuẩn. Các hộp lồng không xuất hiện khuẩn lạc hoặc các khuẩn lạc phát triển quá dày đƣợc đem đi hấp bẩn, khử trùng và làm sạch, 18 khuẩn lạc xạ khuẩn đƣợc đem đi thực hiện các nghiên cứu tiếp theo. Kết quả phân lập đƣợc trình bày ở bảng 3.1.
30
Bảng 3.1. Các chủng xạ khuẩn phân lập trong đất đồi Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc
STT Độ sâu Độ pha
loãng
Môi trƣờng
Gause I Czapeck Czapeck-
tinh bột 1 0 cm 10-5 Đ1 10-6 2 5 cm 10-5 Đ2, Đ3 Đ4 10-6 3 10 cm 10-5 Đ5 Đ6 10-6 Đ8, Đ9 Đ7 4 15 cm 10-5 Đ10, Đ11 Đ14 10-6 Đ12, Đ13 Đ15 5 20 cm 10-5 Đ16 10-6 6 25 cm 10-5 Đ17 10-6 7 30 cm 10-5 Đ18 10-6
Tiến hành phân lập xạ khuẩn trên môi trƣờng nuôi cấy để kiểm tra xạ khuẩn trong đất có khả năng phân giải cellulose, chúng tôi xác định đƣợc 18 chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces trong đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc có khả năng phân giải cellulose. Các chủng xạ khuẩn tuyển chọn có khuẩn lạc dạng tròn, dày, bông, xốp, có màu sắc đa dạng. Phần lồi ra khỏi bề mặt môi trƣờng chính là phần HSKS, phần này có những cuống sinh bào tử nên làm cho khuẩn lạc bông, xốp. Phần bám chặt vào môi trƣờng thạch chính là phần HSCC, phần này rất khó tách ra. Khi sử dụng que cấy để
31
cấy chuyền sang môi trƣờng thạch nghiêng thì chỉ lấy đƣợc phần HSKS còn phần HSCC vẫn nằm trong môi trƣờng thạch.
Trên 3 môi trƣờng Gause I, Czapeck- tinh bột, Czapeck cả xạ khuẩn, nấm mốc và một số vi khuẩn đều mọc. Nguyên nhân là các loại VSV này đều có khả năng phân giải cellulose. Nhƣng có thể phân biệt rõ ràng các khuẩn lạc này qua hình 3.3.
Khuẩn lạc vi khuẩn thƣờng nhày, ƣớt và nhẵn.
Khuẩn lạc xạ khuẩn cũng có nhiều màu sắc nhƣ khuẩn lạc nấm mốc nhƣng khác ở chỗ nấm mốc phát triển nhanh và to hơn khuẩn lạc xạ khuẩn nhiều lần.
Khuẩn lạc xạ khuẩn thì bông, xốp, khô, rắn chắc, xù xì, dạng da, dạng nhung, dạng phấn, nhìn kỹ có dạng sợi nấm nhƣng đƣờng kính sợi bé hơn sợi nấm rất nhiều chỉ bằng 1 đến 2 phần 10 đƣờng kính sợi nấm, nếu không có HSKS thì khuẩn lạc có dạng màng dẻo.
A B Hình 3.3. Đặc điểm khuẩn lạc của xạ khuẩn, nấm mốc
A. Khuẩn lạc của xạ khuẩn B. Khuẩn lạc của nấm mốc
32
Sau 3 ngày phát triển khuẩn lạc xạ khuẩn có kích thƣớc khoảng 0,5 – 2mm. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn theo tiêu chuẩn sau: có sợi bông, xốp, khô, màu đặc trƣng, nhìn kỹ có dạng sợi nấm, có thể có dạng phóng xạ, có thể có vòng vô khuẩn bao quanh, khuẩn lạc to.
Hình 3.4. Khuẩn lạc xạ khuẩn
Qua kết quả phân lập xạ khuẩn trong đất đồi Xuân Hòa đƣợc thống kê ở bảng 3.1 có thể rút ra một số nhận xét sau:
Sự phân bố của xạ khuẩn phân giải cellulose trong đất đồi Xuân Hòa là rộng do trong đất đồi có xác động, thực vật: lá rụng, rễ chết, than cành cây chết, xác các động vật nguyên sinh trong đất...cùng với các sản phẩm tiết của rễ cây sống làm cho hệ vi sinh vật đất phát triển phong phú trong đó có xạ khuẩn. Vì vậy tiến hành phân lập xạ khuẩn trên môi trƣờng nuôi cấy để kiểm tra xạ khuẩn trong đất có khả năng phân giải cellulose, tôi đã xác định đƣợc 18 chủng thuộc nhóm xạ khuẩn chi Streptomyces trong đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc có khả năng phân giải cellulose mạnh, tuy nhiên mật độ xạ khuẩn phân bố thấp. Theo những kết quả nghiên cứu về xạ khuẩn đã đƣợc khẳng định từ trƣớc tới nay của nhiều tác giả trong và ngoài nƣớc thì xạ khuẩn là vi sinh vật hoại sinh, hiếu khí. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh
33
trƣởng và phát triển của xạ khuẩn là 25- 300C, độ ẩm thích hợp từ 40- 50%.Trên cơ sở này có thể giải thích sự phân bố mật độ thấp của xạ khuẩn nhƣ sau:
Đất đồi Xuân Hòa là loại đất feralit đỏ vàng, bị xói mòn, rửa trôi mạnh, kết vón và trơ đá. Loại đất này rất nghèo chất dinh dƣỡng, ít cây cối mọc đƣợc chỉ có bạch đàn, keo lá tràm và lớp cỏ mọc thấp, thƣa thớt. Đất chua ( pH:6,0 – 6,2), độ ẩm thấp. Những đặc điểm này không thuận lợi cho sự sinh trƣởng và phát triển của xạ khuẩn đặc biệt là xạ khuẩn phân giải cellulose.
Bảng 3.2. Số lƣợng và sự phân bố của xạ khuẩn theo độ sâu STT Độ sâu ( cm ) Số lƣợng chủng phân lập Tỷ lệ (%) 1 0 1 5.56 2 5 3 16.66 3 10 5 27.77 4 15 6 33.33 5 20 1 5.56 6 25 1 5.56 7 30 1 5.56 8 Tổng 18 100
34 5.56 16.66 27.77 33.33 5.56 5.56 5.56 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 5 10 15 20 25 30 Tổng
Hình 3.5. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ các chủng xạ khuẩn theo độ sâu
Qua bảng 3.2 và biểu đồ hình 3.5 chúng tôi thấy ở độ sâu 5cm, 10cm, 15 cm phân lập đƣợc nhiều chủng xạ khuẩn nhất. Hiện tƣợng đất đồi Xuân Hòa có số lƣợng xạ khuẩn ở lớp đất trên ít hơn so với lớp đất dƣới, điều này có thể đƣợc giải thích nhƣ sau: Ở lớp đất mặt thƣờng có cƣờng độ chiếu sáng liên tục và mạnh với các tia cực tím có khả năng diệt khuẩn mạnh. Đồng thời nhiệt độ cao cùng với trời mƣa cũng cuốn trôi một phần xác hữu cơ làm giảm một phần độ màu mỡ của lớp đất bề mặt. Ở lớp đất dƣới cƣờng độ ánh sáng yếu, nhiệt độ tƣơng đối ổn định, xác hữu cơ đƣợc tích tụ và phân giải dƣới tác động của nhiều nhóm vi sinh vật trung gian tạo thành các chất hữu cơ trung gian và hàm lƣợng oxy hòa tan khá cao, thuận lợi cho sự sinh trƣởng và phát triển của xạ khuẩn.
Qua bảng 3.2 chúng tôi thấy môi trƣờng Gause I phân lập đƣợc nhiều xạ khuẩn nhất do: Môi trƣờng Gause I có thành phần môi trƣờng thích hợp