- Quy trình tổng hợp:
Sơ đồ 3.3. Tổng hợp ester ethyl 3-(benzimidazol-2-yl)propanoat (2a)
Thêm 30ml EtOH tuyệt đối vào bình cầu 2 cổ 100ml, làm lạnh đến 50C, vừa khuấy vừa thêm từ từ 0,36ml (4,9mmol) SOCl2, sau đó thêm tiếp 1g (4,9mmol) acid 3-(benzimidazol-2-yl)propanoic. Lắp sinh hàn, đun hồi lưu trong 2h. Sục khí N2 trong suốt quá trình phản ứng.
Phản ứng được theo dõi bằng TLC với pha động n-BuOH: AcOH: H2O = 9: 2: 2,5.
Xử lý: hỗn hợp phản ứng sau khi kết thúc được cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm. Làm lạnh bằng đá, thêm 30ml nước lạnh và trung hòa bằng Na2CO3 đến pH= 6 thì sẽ xuất hiện sản phẩm (2a) màu vàng nhạt. Lọc thu tủa qua phễu Buchner. Rửa tủa 2 lần với 10ml nước, hút kiệt và sấy khô.
Kết quả: Hiệu suất: 70,6% (0,81g) Cảm quan: chất rắn màu vàng nhạt. T0nc= 136-138oC Rf = 0,3 (CHCl3: MeOH= 20: 1) 3.1.3. Tổng hợp methyl 3-(benzimidazol-2-yl)propanoat (2b) - Quy trình tổng hợp:
Thêm 30ml MeOH vào bình cầu 2 cổ 100ml, làm lạnh đến 50C, vừa khuấy vừa thêm từ từ 0,36ml (4,9mmol) SOCl2, sau đó thêm tiếp 1g (4,9mmol) acid 3-(benzimidazol-2-yl)propanoic. Lắp sinh hàn, đun hồi lưu trong 2h. Sục khí N2 trong suốt quá trình phản ứng.
Phản ứng được theo dõi bằng TLC với pha động n-BuOH: AcOH: H2O = 9: 2: 2,5.
Xử lý: hỗn hợp phản ứng sau khi kết thúc được cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm. Làm lạnh bằng đá, thêm 30ml nước lạnh và trung hòa bằng Na2CO3 đến pH= 6 thì sẽ xuất hiện sản phẩm (2b) màu trắng. Lọc thu tủa qua phễu Buchner. Rửa tủa 2 lần với 10ml nước, hút kiệt và sấy khô. Kết quả: Hiệu suất: 62% (0,66g) Cảm quan: chất rắn màu trắng lấp lánh. T0nc= 144-1460C Rf = 0,24 (CHCl3: MeOH= 20: 1) 3.1.4. Tổng hợp 3-(benzimidazol-2-yl)propanhydrazid (3a-1) - Quy trình tổng hợp:
Sơ đồ 3.5. Tổng hợp 3-(benzimidazol-2-yl)propanhydrazid (3a-1)
Hòa tan hỗn hợp gồm: 1g (4,58mmol) ethyl 3-(benzimidazol-2- yl)propanoat và 17ml EtOH tuyệt đối trong bình cầu 100ml. Sau đó thêm 8ml (82,4mmol) hydrazin monohydrat 50%. Lắp sinh hàn, đun hồi lưu và khuấy trong 4h.
Xử lý: để lạnh trong 15 phút sẽ xuất hiện tủa sản phẩm (3a-1) màu trắng, lọc qua phễu Buchner, rửa tủa 2 lần với nước lạnh.
- Kết quả:
Hiệu suất: 77% (0,73g).
Cảm quan: chất rắn màu trắng. T0nc= 265-2680C.
Rf = 0,16 (CHCl3: MeOH = 9: 1)
3.1.5. Tổng hợp ethyl 3-(1-ethoxy carbonyl methyl-benzimidazol-2-yl)propanoat (3a-2) yl)propanoat (3a-2)
- Quy trình tổng hợp:
Sơ đồ 3.6. Tổng hợp ethyl 3-(1-ethoxy carbonyl methyl-benzimidazol-2- yl)propanoat (3a-2)
Hòa tan hỗn hợp gồm: 0,2g (0,9mmol) ethyl 3-(benzimidazol-2- yl)propanoat và 7ml DMF khan trong bình cầu 2 cổ 50ml. Thêm tiếp 0,13g (0,9mmol) K2CO3 khan, cuối cùng thêm từ từ 0,11ml (1,0mmol) ECA vào hỗn hợp trên. Lắp dụng cụ làm khan (có gắn CaO), sục khí N2 trong suốt quá trình phản ứng, khuấy ở nhiệt độ phòng trong 12h.
Phản ứng được theo dõi bằng TLC với pha động CHCl3: MeOH= 20: 1
Xử lý: hỗn hợp phản ứng sau khi kết thúc được lọc loại bỏ muối vô cơ, rửa bằng CH2Cl2, thêm 20ml nước lạnh rồi chiết 2 lần với CH2Cl2. Gộp dịch chiết và lắc dịch chiết với dung dịch NaOH để loại sản phẩm bị thủy phân. Dịch CH2Cl2 được làm khan và cất thu hồi dung môi ở áp suất giảm. Chất rắn (3a-2) được kết tinh lại trong nước, để trong tủ lạnh 1 ngày. Lọc thu tủa qua phễu Buchner.
Hiệu suất: 72% (0,2g)
Cảm quan: chất bột màu trắng. T0nc= 65-670C.
Rf = 0,7 (CHCl3: MeOH= 20: 1)
3.1.6. Tổng hợp ethyl 3-(1-benzyl-benzimidazol-2-yl)propanoat (3a-3)
- Quy trình tổng hợp:
Sơ đồ 3.7. Tổng hợp ethyl-3-(1-benzyl-benzimidazol-2-yl)propanoat (3a-3)
Hòa tan hỗn hợp gồm: 0,25g (1,15mmol) ethyl 3-(benzimidazol-2- yl)propanoat và 7ml DMF khan trong bình cầu 2 cổ 50ml. Thêm tiếp 0,16g (1,15mmol) K2CO3 khan, cuối cùng thêm từ từ 0,13ml (1,2mmol) benzyl clorid vào hỗn hợp trên. Lắp dụng cụ làm khan (có gắn CaO), sục khí N2 trong suốt quá trình phản ứng, khuấy ở nhiệt độ phòng trong 1h30 phút.
Phản ứng được theo dõi bằng TLC với pha động CHCl3: MeOH= 20: 1
Xử lý: hỗn hợp phản ứng sau khi kết thúc được lọc loại bỏ muối vô cơ, rửa bằng CH2Cl2, thêm 20ml nước lạnh rồi chiết 2 lần với CH2Cl2. Gộp dịch chiết dicloromethan, lắc dịch chiết với dung dịch NaOH 10% để loại sản phẩm bị thủy phân. Dịch CH2Cl2 được làm khan bằng Na2SO4 khan và cất thu hồi dung môi ở áp suất giảm. Chất rắn (3a-3) được kết tinh lại trong nước, để trong tủ lạnh 1 ngày. Lọc thu tủa qua phễu Buchner.
- Kết quả:
Hiệu suất: 46,0% (0,16g) Cảm quan: chất rắn màu nâu. T0nc= 85-880C.
Rf= 0,68 (CHCl3: MeOH= 20: 1)
3.1.7. Tổng hợp methyl 3-(1-ethoxy carbonyl methyl-benzimidazol-2- yl)propanoat (3b-1)
- Quy trình tổng hợp:
Sơ đồ 3.8. Tổng hợp methyl 3-(1-ethoxy carbonyl methyl-benzimidazol-2- yl)propanoat (3b-1)
Hòa tan hỗn hợp gồm: 0,2g (0,98mmol) methyl 3-(benzimidazol-2- yl)propanoat và 7ml DMF khan trong bình cầu 2 cổ 50ml. Thêm tiếp 0,14g (0,98mmol) K2CO3 khan, cuối cùng thêm từ từ 0,13ml (1,18mmol) ECA vào hỗn hợp trên. Lắp dụng cụ làm khan (có gắn CaO), sục khí N2 trong suốt quá trình phản ứng, khuấy ở nhiệt độ phòng trong 4h.
Phản ứng được theo dõi bằng TLC với pha động CHCl3: MeOH= 20: 1
Xử lý: hỗn hợp phản ứng sau khi kết thúc được lọc loại bỏ muối vô cơ, rửa bằng CH2Cl2, thêm 20ml nước lạnh rồi chiết 2 lần với CH2Cl2. Gộp dịch chiết dicloromethan, lắc dịch chiết với dung dịch NaOH 10% để loại sản phẩm bị thủy phân. Dịch CH2Cl2 được rửa, làm khan và cất thu hồi dung môi ở áp suất giảm. Chất rắn (3b-1) được kết tinh lại trong nước, để trong tủ lạnh 4 ngày. Lọc thu tủa qua phễu Buchner.
- Kết quả:
Hiệu suất: 64,2% (0,18g)
Cảm quan: tinh thể màu trắng, hình kim, nhẹ. T0nc= 103-1040C
Như vậy, chúng tôi đã tổng hợp được 7 chất. Sau đây là bảng tóm tắt kết quả tổng hợp hóa học: Bảng 3.1. Kết quả tổng hợp hóa học STT Chất CTCT Cảm quan T0nc Hiệu suất (%) Rf 1 1 Tinh thể màu trắng, hình kim. 229- 2300C 70% 0,67 2 2a Chất rắn màu vàng nhạt. 136- 1380C 70,6% 0,30 3 2b Chất rắn màu trắng lấp lánh. 144- 1460C 62% 0,24 4 3a-1 chất rắn màu trắng. 265- 2680C 77% 0,16 5 3a-2 Chất rắn màu trắng. 65- 670C 72% 0,69 6 3a-3 Chất rắn màu nâu 85- 880C 46% 0,68 7 3b-1 Tinh thể màu trắng, hình kim, nhẹ 103- 1040C 64% 0,48
3.2. Kiểm tra độ tinh khiết
Chúng tôi đã kiểm tra độ tinh khiết của các chất tổng hợp được bằng sắc kí lớp mỏng và nhiệt độ nóng chảy như sau:
- TLC được tiến hành trên bản nhôm tráng sẵn silicagel GF254 70-230 mesh, quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm.
- Dung môi hòa tan: EtOH 960.
- Hệ dung môi: n-BuOH: AcOH: H2O (9: 2: 2,5); cloroform: methanol (20: 1) và cloroform: methanol (9: 1).
Bảng 3.2. TLC của các chất trung gian (1, 2a, 2b)
TLC Vết o-ph 1 1 2a 1 2b Hệ dung môi n-BuOH: AcOH: H2O (9: 2: 2,5) CHCl3: MeOH (20: 1) CHCl3: MeOH (20: 1)
Ghi chú: o-ph: o-phenylendiamin
Bảng 3.3. TLC của các chất sản phẩm (3a-1, 3a-2, 3a-3, 3b-1)
TLC
Vết 2a 3a-1 2a 3a-2 2a 3a-3 2b 3b-1 Dung môi CHCl3: MeOH (9: 1) CHCl3: MeOH (20: 1) CHCl3: MeOH (20: 1) CHCl3: MeOH (20: 1)
- Đo nhiệt độ nóng chảy các chất.
Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (t0nc) của các chất được tóm tắt trong bảng
Bảng 3.4. Rf và t0nc của 7 chất tổng hợp được
Chất Hệ dung môi khai triển Rf T0nc(0C) 1 n-BuOH: AcOH: H2O (9: 2: 2,5) 0,67 229-230 2a CHCl3: MeOH (20: 1) 0,30 136-138 2b CHCl3: MeOH (20: 1) 0,24 144-146 3a-1 CHCl3: MeOH (9: 1) 0,16 265-268 3a-2 CHCl3: MeOH (20: 1) 0,70 65-67 3a-3 CHCl3: MeOH (20: 1) 0,68 85-88 3b-1 CHCl3: MeOH (20: 1) 0,48 103-104 Nhận xét:
- Kết quả TLC trên cả 2 hệ dung môi thu được 1 vết sản phẩm, gọn, rõ dưới ánh sáng đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm, không có vết lạ.
- Nhiệt độ nóng chảy của các chất dao động ở khoảng hẹp từ 2÷ 40 C.
Sơ bộ kết luận các chất đã tổng hợp được là tinh khiết.
Tiến hành đo phổ để xác định cấu trúc các chất tổng hợp được.
3.3. Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp đƣợc
3.3.1. Kết quả phân tích phổ các chất trung gian (acid 1 và ester 2a, 2b)
Bảng 3.5. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của 1, 2a, 2b
Chất CTCT Số sóng (cm-1) ứng với các dao động νmaxNH νmaxC=O νmaxC=C νmaxC-N
1 3177 1636 1557 1218
2a 3443 1728 1545 1272
2b 3149 1728 1537 1204
Nhận xét: Các chất đều có số sóng ứng với các dao động của các nhóm
liên kết, trong đó dao động của nhóm C=O là dao động mạnh. Ở 2a, 2b nhóm C=O rõ và cao hơn ở acid 1.
b. Phổ khối lượng (MS)
Bảng 3.6. Kết quả phân tích phổ khối lượng của 1, 2a, 2b
Chất Công thức cấu tạo m/z
1 M=190,07 189,0 [M-H]- 2a M=218,11 218 [M]+ 2b M=204,09 205,06 [M+H]+ Nhận xét: Từ các dữ liệu phân tích phổ ở bảng 3.4 và phổ đồ (phụ lục
8÷ 10) chúng tôi đều thấy có pic phân tử có số khối đúng bằng số khối dự kiến với cường độ mạnh.
c. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1
Bảng 3.7. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H của 1,2a,2b
Chất Công thức cấu tạo Số liệu phân tích 1
H-NMR 1 1 H-NMR (500MHz, DMSO, ppm): δ 2,80 (2H, t, C2H2); 3,04 (2H, t, C3H2); 7,11 (2H, d, C5’H + C6’H); 7,46 (2H, d, C4’H + C7’H) 2a 1 H-NMR (500MHz, DMSO, ppm): δ 1,21 (3H, t, CH3); 2,91 (2H, t, C2H2); 3,19 (2H, t, C3H2); 4,12 (2H, q,-CH2-); 7,20 (2H, dd, C5’H + C6’H); 7,50 (2H, dd, C4’H + C7’H) 2b 1 H-NMR (500MHz, DMSO, ppm): δ 2,88 (2H, t, C2H2); 2,06 (2H, t, C3H2); 3,59 (3H, s, O-CH3); 7,07-7,13 (2H, m, C5’H + C6’H); 7,41 (1H, d, C4’H); 7,51 (1H, d, C7’H); 12,21 (1H, s, NH)
Ghi chú: δ: Độ chuyển dịch hóa học (ppm); s: singlet; d: doublet; t: triplet; q: quartet;
m: multiplet
Nhận xét: dựa vào kết quả phân tích phổ ở bảng 3.5 và căn cứ vào phổ
đồ (phụ lục 15÷ 20) chúng tôi nhận thấy:
- Số lượng proton, độ dịch chuyển, độ bội của tín hiệu là phù hợp với công thức cấu tạo của 3 chất. Các chất đều có các proton của khung benzimidazol nằm trong vùng dịch chuyển từ 7,1÷ 7,5. Chất 1, 2b đều có proton của NH ở vùng 12; riêng chất 2a không hiện proton của NH là do đo trong dung môi
MeOD.
- Kết hợp với kết quả phổ IR, phổ MS có thể khẳng định 3 chất 1, 2a, 2b
3.3.1. Kết quả phân tích phổ các chất sản phẩm (3a-1; 3a-2; 3a-3; 3b-1)
a. Phổ hồng ngoại (IR)
Bảng 3.8. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của 3a-1, 3a-2, 3a-3, 3b-1
Chất CTCT Số sóng (cm-1) ứng với các dao động νmax C-H νmax C-N νmax C=O νmax C=C νmax nhóm đặc trưng khác 3a-1 2853 1175 1655 1534 3274 (ν NH) 3a-2 2993 2937 1174 1733 1519 3a-3 2926 2863 1176 1728 1509 3b-1 2959 2886 1170 1736 1515
Nhận xét: Các chất đều có số sóng ứng với các dao động của các nhóm
liên kết. Trong đó dao động của nhóm NH là dao động mạnh, đặc trưng cho
3a-1. Dao động của nhóm C=O đặc trưng cho các sản phẩm 3a-2, 3a-3, 3b-1.
b. Phổ khối lượng (MS)
Bảng 3.9. Kết quả phân tích phổ khối lượng của 3a-1, 3a-2, 3a-3, 3b-1
Chất Công thức cấu tạo m/z
3a-1
M= 204,10 204 [M]
3a-2 M= 304,14 305,13 [M+H] + 3a-3 M= 308,15 309,13 [M+H] + 3b-1 M= 290,13 291,09 [M+H] + Nhận xét: Từ các dữ liệu phân tích phổ ở bảng 3.7 và phổ đồ (phụ lục
11÷ 14) chúng tôi đều thấy pic phân tử có số khối đúng bằng số khối dự kiến với cường độ mạnh.
c. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1
H-NMR)
Bảng 3.10. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 3a-1, 3a-2, 3a-3, 3b-1
Chất Công thức cấu tạo Số liệu phân tích 1
H-NMR 3a-1 1 H-NMR (500MHz, DMSO, ppm): δ 2,55 (2H, t, C3H2); 3,01 (2H, t, C2H2); 4,16 (2H, s, NH2); 7,05-7,11 (2H, m, C5’H + C6’H); 7,37 (1H, d, C4’H); 7,48 (1H, d, C7’H); 9,06 (1H, s, O- NH); 12,15 (1H, s, NH) 3a-2 1 H-NMR (500MHz, DMSO, ppm): δ 1,17 (3H, t, CH3); 1,22 (3H, t, CH3); 2,86 (2H, t, C2H2); 3,03 (2H, t, C3H2); 4,07 (2H, q, O-CH2); 4,18 (2H, q, O- CH2); 5,21 (2H, s, N-CH2); 7,14-7,19 (2H, m, C5’H + C6’H); 7,47 (1H, d, C4’H); 7,55 (1H, d, C7H’)
3a-3 1 H-NMR (500MHz, DMSO, ppm): δ 1,15 (3H, t, CH3); 2,87 (2H, t, C2H2); 3,08 (2H, t, C3H2); 4,05 (2H, q, O- CH2); 5,50 (2H, s, N-CH2); 7,12-7,15 (4H, m, 4CH); 7,26-7,28 (1H, m, CH); 7,31-7,33 (2H, m, 2CH); 7,44-7,46 (1H, m, CH); 7,56-7,58 (1H, m, CH) 3b-1 1 H-NMR (500MHz, DMSO, ppm): δ 1,22 (3H, t, CH3); 2,89 (2H, t, C2H2); 3,03 (2H, d, C3H2); 3,61 (3H, s, OCH3); 4,18 (2H, q, OCH2); 5,12 (2H, s, N-CH2); 7,14-7,19 (2H, m, C5’H + C6’H); 7,47 (1H, d, C4’H); 7,56 (1H, d, C7’H)
Ghi chú: δ: Độ chuyển dịch hóa học (ppm); s: singlet; d: doublet; t: triplet; q: quartet;
m: multiplet
Nhận xét: dựa vào kết quả phân tích phổ ở bảng 3.8 và căn cứ vào phổ
đồ (phụ lục 21÷ 28) chúng tôi nhận thấy:
- Số lượng proton, độ dịch chuyển, độ bội của tín hiệu là phù hợp với công thức cấu tạo của 4 chất dự kiến. Các chất đều có các proton của khung benzimidazol nằm trong vùng dịch chuyển từ 7,1÷ 7,6. Chất 3a-1 vẫn có 1
proton của NH ở vị trí 12 do không thế vào vị trí N1 giống như 3a-2, 3a-3, 3b-1. Chất 3a-3 có 9 proton ở vùng dịch chuyển từ 7,1÷ 7,6 do trong phân tử
có 2 vòng benzen.
- Kết hợp với kết quả phổ IR, phổ MS có thể khẳng định 4 chất 3a-1,
3.4. Thử tác dụng sinh học
Với mục đích tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học cao, có triển vọng trong sử dụng làm thuốc, chúng tôi đã tiến hành thử tác dụng sinh học của các dẫn chất tổng hợp được. Dựa vào một số kết quả nghiên cứu về hoạt tính sinh học của benzimidazol-2-yl và benzimidazol hydrazid như: kháng nấm, kháng khuẩn, chống ung thư, virus, chống co giật, giảm đau, chống viêm…. [6,9,11,19], chúng tôi đã định hướng thăm dò tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của chất 2a, 2b, 3a-1, 3a-2, 3a-3, 3b-1.
3.4.1. Nguyên tắc, cách tiến hành thử hoạt tính kháng khuẩn
3.4.1.1. Các vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu
Thử tác dụng kháng khuẩn được thực hiện đối với 5 vi khuẩn Gram(+) và 5 vi khuẩn Gram(-) sau:
Vi khuẩn Gram(+) gồm: Bacillus cereus ATCC 9946 (Bc),
Bacilluspumilus ATCC 10241 (Bp),
Bacillussubtilis ATCC 6633 (Bs),
Sarcina lutea ATCC 9341 (SL),
Staphylococcusaureus ATCC 1128 (Sta). Vi khuẩn Gram(-) gồm: Escherichia coli ATCC 25922 (EC),
Proteus mirabilis BV 108 (Pro),
Pseudomonas aeruginosa VM 201 (Pseu),
Salmonellatyphi DT 220 (Sal),
Shigellaflexneri DT 112 (Shi). Kháng sinh đối chứng: Streptomycin: 14 µg/ml
Penicillin: 27 UI/ml
3.4.1.2. Môi trường thử nghiệm
Thành . phần MT NaCl (%) Cao thịt (%) Pepton (%) Thạch (%) Nƣớc pH Canh thang
nuôi cấy VSV 0,5 0,3 0,5 0 Vừa đủ
100ml
7,0÷ 7,4
Thạch thường 0,5 0,3 0,5 1,6
3.4.1.3. Nguyên tắc
Thử tác dụng kháng khuẩn tiến hành theo phương pháp khuếch tán trên thạch. Mẫu thử (có chứa hoạt chất thử) được đặt lên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy vi sinh vật kiểm định, hoạt chất từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn.
Phép thử được thực hiện tại bộ môn Vi sinh- Sinh học, Trường Đại học Dược Hà Nội.
3.4.1.4. Tiến hành
- Mẫu thử được pha vào dung môi thích hợp (EtOH) với nồng độ là 100 µg/ml. Các khoanh giấy lọc vô trùng và đã được sấy khô được tẩm 3 lần với dung dịch mẫu thử gồm: mẫu chất 2a, 2b, 3a-1, 3a-2, 3a-3, 3b-1, sau mỗi lần tẩm các khoanh giấy lọc có chứa mẫu thử đều được sấy ở nhiệt độ thấp hơn 600C đến khô hết dung môi.
- Chuẩn bị môi trường và cấy VSV kiểm định: VSV kiểm định được cấy vào môi trường canh thang, rồi nuôi cấy cho
phát triển trong tủ ấm 370C trong thời gian 18÷ 24 giờ đến nồng độ 107 tế bào/ml (kiểm tra bằng pha loãng và dãy dịch chuẩn). Môi trường thạch
thường vô trùng (tiệt trùng 1180C/30 phút) được làm lạnh về 45÷ 500 C và được cấy giống VSV kiểm định vào với tỷ lệ 2,5 ml/100 ml. Lắc tròn để VSV