- Đánh giá tác dụng sau 15 phút dùng mẫu thử.
- Đánh giá tác dụng sau dùng mẫu thử 5 ngày.
Đánh giá hoạt tính androgen của OS35 trên chuột cống đực trưởng thành.
2.2.2. Liều sử dụng trong nghiên cứu
Trong thí nghiệm thăm dò liều có tác dụng (đánh giá tác dụng của thuốc trên test cương dương), sử dụng 3 mức liều 50 mg/kg, 150 mg/kg, 250 mg/kg. Kết quả cho thấy, liều 50mg/kg OS35 bắt đầu thể hiện tác dụng, nhưng 2 mức liều thể hiện tác dụng rõ nhất là 150 mg/kg và 250 mg/kg. Do vậy, đề tài sử dụng mức liều 150 mg/kg và 250 mg/kg cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.3. Đánh giá tác dụng tăng cường chức năng sinh sản nam của OS35 thông qua hành vi tình dục trên động vật thực nghiệm hành vi tình dục trên động vật thực nghiệm
Sử dụng mô hình nghiên cứu hành vi tình dục ở chuột cống trắng phương pháp tiến hành như sau [12, 13, 46]:
Nguyên tắc: Cho chuột đực đã có kinh nghiệm tình dục giao phối với chuột cái đang trong thời kỳ động dục. Quan sát và ghi lại hành vi giao phối. So sánh các chỉ số thu được giữa các lô.
Cách tiến hành:
Bước 1: Tạo chu kỳ động dục nhân tạo cho chuột cái.
- Gây mê chuột cái bằng thiopental và xylazin hydrochrorid, cắt bỏ buồng trứng.
Tiếp tục nuôi chuột bằng chế độ ăn uống và các điều kiện khác như bình thường trong khoảng 14 ngày.
- Tạo chu kì động dục nhân tạo cho chuột cái bằng cách tiêm dưới da estradiol benzoat liều 0,25 mg/kg trước khi giao phối 52 giờ, và progesteron 2,5 mg/kg trước khi giao phối 4 giờ.
Bước 2: Huấn luyện hành vi tình dục cho chuột đực và sàng lọc khả năng tình dục của chuột trước khi thử thuốc.
Huấn luyện hành vi tình dục cho chuột đực :
Chuột đực trưởng thành (12-13 tuần tuổi, cân nặng 180-200g) được làm quen với test hành vi tình dục trong 3 đợt huấn luyện (mỗi đợt cách nhau 4 ngày). Các test này được tiến hành vào pha tối của chu kì sinh học trong cùng phòng thí nghiệm.
Phương pháp tiến hành test hành vi tình dục cụ thể như sau:
- Cho con đực vào một chuồng quan sát, để chuột làm quen với điều kiện thí nghiệm 4-5 phút, sau đó cho chuột cái đã được gây động dục nhân tạo vào. Quan sát và ghi lại các hành vi giao phối của chuột trong thời gian bằng máy ghi hình có độ phân giải 8 megapixels.
- Nếu trong khi huấn luyện, con cái không thể hiện sự tiếp cận tốt (không chịu đực) thì sẽ bị loại và thay bằng 1 con cái khác.
Chuột sau khi được huấn luyện 3 lần như trên tiếp tục được được trải qua 4 test hành vi (mỗi đợt cũng cách nhau 4 ngày) nhằm sàng lọc khả năng tình dục.
Cách tiến hành tương tự như trên.
Thử nghiệm được hoàn thành sau khi ghi được thời gian nhảy lại (PEI). Các chuột được coi là không hoàn thành test huấn luyện khi thời gian xâm nhập (IL) hoặc thời gian nhảy lại (PEI) lớn hơn 15 phút hoặc thời gian xuất tinh (EL) lớn hơn 30 phút.
Chỉ những chuột có hoạt động tình dục kém (không hoàn thành ít nhất 1 test sàng lọc) mới được đưa vào nghiên cứu.
Bước 3: Đánh giá ảnh hưởng của OS35 trên hành vi tình dục của chuột.
Sau 4 đợt sàng lọc để đánh giá khả năng tình dục, những chuột có hoạt động tình dục kém được chia ngẫu nhiên thành các lô.
- Lô chứng (n=9): uống dung môi để pha mẫu thử Na-CMC 0,5 % 10 ml/kg.
- Lô sildenafil (n=7): uống sildenafil pha trong Na-CMC 0,5 % liều 10 mg/kg.
- Lô OS 35 (n=8): uống OS35 pha trong Na-CMC 0,5 % liều 150 mg/kg.
Tiến hành ghép chuột đực và chuột cái để quan sát hành vi giao phối giống như test huấn luyện đã tiến hành ở trên sau khi uống thuốc 15 phút và 5 ngày sau uống thuốc để đánh giá ảnh hưởng của việc dùng liều đơn và việc dùng liều lặp lại OS35 trên hành vi tình dục.
Các thông số được đánh giá bao gồm:
- Số lần nhảy (MF): số lần nhảy trước khi xuất tinh.
- Số lần xâm nhập (IF): số lần xâm nhập trước khi xuất tinh.
- Thời gian nhảy (ML): là khoảng thời gian từ khi con đực gặp con cái đến lần nhảy đầu tiên.
- Thời gian xâm nhập (IL): là khoảng thời gian từ khi con đực gặp con cái đến lần
- Thời gian xuất tinh (EL): là khoảng thời gian từ khi con đực gặp con cái đến lần xuất tinh đầu tiên.
- Thời gian nhảy lại (PEI): thời gian từ lần xuất tinh đầu tiên đến lần xâm nhập
tiếp theo.
So sánh các chỉ số nghiên cứu của lô chuột dùng thuốc thử với lô chứng để đánh giá tác dụng của mẫu thử.
0 4 18 23 28 33 38 43 48 53 58 Ngày
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu hành vi tình dục ở chuột cống trắng