3.4.1. Hợp chất TA08
- Tính chất: TA08 là chất kết tinh ở dạng tinh thể hình kim màu trắng (hình 3.8), nhiệt độ nóng chảy là 188-189oC. Tan trong cloroform, ethylacetat, không tan trong nước.
Hình 3.8. Ảnh tinh thể của TA08 dưới KHV vật kính 40
- Phổ khối lượng ESI-MS m/z = 427 [M+H]+. Công thức phân tử C30H50O, M=426.
- Phổ NMR (bảng 3.6) chỉ ra rằng chất này là triterpenoid có khung lup-20(29)-en.
Phổ 1H-NMR của TA08 cho thấy tín hiệu của 7 nhóm methyl (-CH3) cộng hưởng trong vùng trường mạnh, trong đó có 6 nhóm methyl bậc ba tại các giá trị δH 0,97 (3H, s, H-23); 0,76 (3H, s, H-24); 0,83 (3H, s, H-25); 1,03 (3H, s, H-26); 0,94 (3H, s, H-27); 0,79 (3H, s, H-28) và một tín hiệu CH3 tại δH 1,68 (3H, br, s, H-30) thuộc nhánh isopropenyl. Tín hiệu 2 proton thuộc nhánh isopropenyl xuất hiện tại δH 4,68 (1H, d, J=1,0Hz) và δH 4,56 (1H, d, J=1,0Hz). Ngoài ra, tín hiệu tại δH 3,19 (1H, dd J=11,5, 5,0 Hz, H-3) khẳng định sự có mặt của một nhóm oximethin (CH-O).
So sánh số liệu phổ NMR của chất TA08 với số liệu của hợp chất triterpen khung lup-20(29)-en đã biết là lupeol (3β-hydroxylup-20(29)-en)
[45] nhận được sự phù hợp hoàn toàn ở tất cả các vị trí tương ứng (bảng 3.7). Nhận định này được khẳng định thêm khi xem xét đến hằng số tương tác J của proton H-3. Proton H-3 cộng hưởng tại δ 3,19 (dd, J=11,5, 5,0 Hz), tín hiệu doublet này cho thấy hằng số tương tác J lớn, vì vậy H-3 ở vị trí axial (a) hay alpha (α) dẫn tới OH tại C-3 là equatorial (e) [45]. Từ các phân tích nêu trên hợp chất TA08 được xác định là 3β-hydroxylup-20(29)-en hay lupeol.
Bảng 3.6. Dữ liệu phổ NMR của TA08
C #C
[45]
C a,b DEPT Ha,c
1 38,7 38,76 CH2 2 27,5 27,46 CH2 3 79,0 79,03 CH 3,19 dd (11,5; 5,0) 4 38,9 38,89 - 5 55,3 55,36 CH 6 18,3 18,35 CH2 7 34,3 34,34 CH2 8 40,9 40,88 - 9 50,5 50,50 CH 10 37,2 37,21 - 11 21,0 20,97 CH2 12 25,2 25,21 CH2 13 38,1 38,11 CH 14 42,9 42,87 - 15 27,5 27,49 CH2 16 35,6 35,62 CH2 17 43,0 43,03 -
18 48,0 48, 01 CH 19 48,3 48, 36 CH 2,38 dd (11,0; 11,0; 6,0) 20 150,9 150,96 - 21 29,9 29,90 CH2 22 40,0 40,03 CH2 23 28,0 28,01 CH3 0,97s 24 15,3 15,38 CH3 0,76s 25 16,1 16,13 CH3 0,83s 26 16,0 16,01 CH3 1,03s 27 14,6 14,58 CH3 0,94s 28 18,0 18,03 CH3 0,79s 29 109,3 109,33 CH2 4,68s/4,56s 30 19,3 19,33 CH3 1,68s
#C của lupeol đo trong CDCl3 ở 25,25 MHz (13C) [45], a Đo trong CDCl3, b125 MHz,
c500 MHz. HO H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 24 23 25 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 26 27 28 29 30
3.4.2. Hợp chất TA09
- Tính chất: TA09 là dạng tinh thể màu vàng (hình 3.8). Nhiệt độ nóng chảy là 213oC. Tan trong methanol, ethylacetat. Công thức phân tử C18H16O7, M = 344.
Hình 3.10. Ảnh tinh thể TA09 dưới KHV vật kính 40
Phổ 1H-NMR của TA09 chỉ ra các tín hiệu đặc trưng của flavon. Trên phổ có xuất hiện tín hiệu đơn của 3 nhóm methoxy tại δ 3,93 (s, 3H, O-Me-6), 3,90 (s, 3H, O-Me-7) và 3,73 (s, 3H, O-Me-3’). Ngoài ra còn xuất hiện tín hiệu của 5 olefinlic proton tại các vị trí cộng hưởng δ 6,93-6,95 (m, 3H, H -3, H-8 và H-5’) và δ 7,59-7,61(m, 2H, H -2’ và H-6’).
Trên phổ 13C-NMR của TA09 xuất hiện 18 tín hiệu carbon đặc trưng cho hợp chất flavon gồm 3 tín hiệu của nhóm methoxy, 5 tín hiệu carbon methyl và 10 tín hiệu carbon bậc bốn. Tín hiệu của nhóm carbonyl vòng C được xác định tại vị trí cộng hưởng δ 182,22 (C-4). Năm tín hiệu carbon bậc 4 gắn nguyên tử oxy được xác định tại các vị trí cộng hưởng 152,03(C-5), 131,87(C-6), 152,61(C-7), 148,04 (C-3’) và 150,87(C-4’). Bên cạnh đó còn xuất hiện tín hiệu của nối đôi vòng C tại các tín hiệu cộng hưởng 163,97(C- 2)/102,99(C-3).
So sánh với dữ liệu phổ của hợp chất cirsilineol (5, 4’-dihydroxy-6,7,3’- trimethoxyflavon) [30] thấy hoàn toàn phù hợp tại các vị trí tương ứng. Do
đó, có thể kết luận hợp chất TA09 là cirsilineol (5,4’-dihydroxy-6,7,3’- trimethoxyflavon).
Bảng 3.7. Dữ liệu phổ NMR của TA09
C #C [30] C a,b Ha,c 2 163,87 163,97 - 3 102,96 102,99 6,93-6,95 4 182,13 182,22 - 5 151,98 152,03 - 6 131,67 131,87 - 7 152,53 152,61 - 8 91,55 91,59 6,93-6,95 9 158,53 158,58 - 10 105,02 105,06 - 1’ 121,34 121,39 - 2’ 110,18 110,26 7,59-7,61 3’ 147,97 148,04 - 4’ 150,83 150,87 - 5’ 115,70 115,77 6,93-6,95 6’ 120,37 120,44 7,59-7,61 OMe-6 56,00 56,01 3,93 (3H, s) OMe-7 56,42 56,43 3,90 (3H, s) OMe-3’ 59,94 59,99 3,73 (3H, s)
Hình 3.11. Cấu trúc hóa học của hợp chất TA09
3.5. BÀN LUẬN
Rễ Ngưu bàng được sử dụng ở nhiều nước trên thế giới như Nhật Bản, Trung Quốc, Canada, Ấn Độ… Nhiều nghiên cứu về tác dụng sinh học của Ngưu bàng cho thấy dược liệu này có khả năng: chống viêm [39], [59], hạ đường huyết [44], [60], kháng khuẩn [42], [48], giảm ho [37], chống oxy hóa [31], [54], ức chế HIV và tế bào ung thư [21], [58], [59]… Mặc dù có nhiều tác dụng như vậy, nhưng việc nghiên cứu về rễ Ngưu bàng tại Việt Nam vẫn còn rất ít, đặc biệt là việc chiết tách các thành phần hóa học có tác dụng dược lý để chứng minh cho kinh nghiệm sử dụng rễ Ngưu bàng trong dân gian. Do đó việc tiến hành nghiên cứu đề tài này là hết sức cần thiết, góp phần khẳng định giá trị sử dụng của dược liệu này.
Trên thế giới, các nhà khoa học đã phân lập được một số chất từ rễ Ngưu bàng như: baicalin, genistin, fructan, acid chlorogenic. Trong đề tài này, cũng xuất phát từ rễ Ngưu bàng chúng tôi đã tiến hành phân lập một số chất trong phân đoạn ethyl acetat, kết quả đã phân lập được 2 chất là TA08 và TA09. Dựa vào các dữ liệu phổ MS, 1D- và 2D- NMR đã nhận dạng TA08 là 3β-hydroxyl-20(29)-en hay lupeol, TA09 là 5,4’-dihydroxy-6,7,3’- trimethoxyflavon hay cirsinilineol.
Lupeol có trong nhiều loài thực vật, nó được tìm thấy trong bắp cải, hạt tiêu, dưa chuột, cà chua, trong trái cây (ôliu, xoài, dâu tây, nho đỏ), trong cây
thuốc (nhân sâm, chó đẻ răng cưa, phèn đen…), phân bố rộng rãi trong các họ thực vật (Asteraceae, Apocynaceae, Euphorbiaceae, Rutaceae…). Năm 1983, Schmidt J. đã phân lập được lupeol từ dịch chiết chloroform của vỏ thân (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Plumeria obtusifolia bằng phương pháp sắc ký cột với chất nhồi cột là silicagel[52]. Ngoài ra, lupeol cũng được phân lập từ dịch chiết ether dầu hỏa [51], dịch chiết methanol vỏ cây Gạo [14]. Cũng bằng phương pháp sắc ký cột trên silicagel, đề tài đã lần đầu tiên phân lập được lupeol từ rễ Ngưu bàng. Lupeol có nhiều tác dụng dược lý: chống viêm, chống oxy hóa, hạ huyết áp, chống sốt rét, bảo vệ gan, chống xơ vữa thành mạch và đặc biệt kìm hãm sự phát triển tế bào ung thư [32], [50], [62]. Bên cạnh đó khi sử dụng lupeol, người bệnh không bị sút cân trầm trọng như khi sử dụng phương pháp hóa trị liệu. Nhận thấy vai trò quan trọng của lupeol, con người đang tích cực đầu tư cho nghiên cứu phân lập hợp chất này từ các nguồn dược liệu khác nhau như: chiết tách lupeol từ lá me rừng [12], phân lập các triterpen ancol từ cây
Xerospermum lavevigatum Radlk [20]. Vì vậy việc phân lập ra lupeol từ rễ cây Ngưu bàng là định hướng mở rộng nguồn dược liệu có giá trị khai thác lupeol tại Việt Nam. Tuy nhiên cần tiến hành xác định hàm lượng lupeol có trong cây Ngưu bàng để làm cơ sở cho việc khai thác.
Cirsilineol đã được các nhà khoa học khác nhau trên thế giới phân lập và chứng minh tác dụng dược lý. Năm 2006, Ahmet Cakir và cộng sự đã phân lập được cirsilineol từ dịch chiết aceton của Teucrium orientale L. bằng phương pháp sắc ký cột và chứng minh được hoạt tính chống oxy hóa của cirsilineol [28]. Theo Takahiko và cộng sự, cirsilineol có hoạt tính kháng khuẩn mạnh với Helicobacter pylori (IC90 = 3,2 µg/ml), kháng khuẩn yếu với
Escherichia coli (IC90 = 25-50 µg/ml) và Salmonella enteritidis (IC90 = 25-50 µg/ml) [34]. Ngoài ra, theo [53], cirsilineol phân lập từ Artemisia vestita Wall cũng được chứng minh có tác dụng chống ung thư.
Việc phân lập được lupeol và cirsilineol là một đóng góp mới của khóa luận, bổ sung thêm các chất phân lập từ cây Ngưu bàng nói chung và rễ Ngưu bàng nói riêng. Sự có mặt của lupeol và cirsilineol trong rễ Ngưu bàng với những tác dụng được biết đến của chúng đã phần nào chứng minh được tác dụng dược lý cũng như kinh nghiệm sử dụng vị thuốc này trong dân gian.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN
Sau thời gian tiến hành làm thực nghiệm, khóa luận đã thu được một số kết quả sau đây:
1. Chiết xuất cắn ethylacetat từ rễ Ngưu bàng bằng phương pháp chiết nóng với máy chiết liên tục (Shoxlet) với hàm lượng là 5,46%.
2. Định tính cắn ethylacetat bằng SKLM với hệ dung môi khai triển thích hợp cho thấy: Cắn ethylacetat cho 11 vết ở UV365nm, 9 vết ở UV254nm
trước khi phun thuốc thử và 6 vết ở AST sau khi phun thuốc thử.
3. Từ cắn ethylacetat đã phân lập được 2 chất là: lupeol, cirsilineol. Sau khi kiểm tra bằng SKLM cho thấy 2 chất phân lập được là tinh khiết. Cấu trúc được xác định dựa trên các dữ liệu phổ MS, NMR (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT).
ĐỀ XUẤT
Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên những kết quả nghiên cứu trên của chúng tôi mới chỉ đóng góp phần nào trong công trình nghiên cứu về cây Ngưu bàng. Vì vậy chúng tôi xin đưa ra một số đề xuất:
- Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học của rễ Ngưu bàng. - Nghiên cứu tác dụng sinh học của rễ Ngưu bàng.
- Nghiên cứu dạng bào chế phù hợp, tiện sử dụng, hiệu quả trong điều trị từ rễ Ngưu bàng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Bộ môn Dược cổ truyền - Trường Đại học Dược Hà Nội (2000), Dược học cổ truyền, Nhà xuất bản Y học, tr.135.
2. Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội (1998), Bài giảng dược liệu, tập 1, Nhà xuất bản Y học.
3. Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội (2006), Thực tập dược liệu.
4. Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội (2005), Thực vật học, tr. 318-320.
5. Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Y học.
6. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, tr. 855-856.
7. Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, tập 1, tr.334.
8. Vũ Văn Chuyên (1971), Phân loại học thực vật- thực vật bậc cao, Nhà xuất bản Y học Hà Nội, tập 2, tr.205-206.
9. Vũ Văn Chuyên (1976), Tóm tắt đặc điểm các họ cây thuốc, Nhà xuất bản Y học Hà Nội, tr.45-46.
10. Vũ Văn Chuyên - Lê Trần Trấn - Trần Hợp (1987), Địa lý các họ cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, tr.174-175.
11. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1980), Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, Nhà xuất bản Y học Hà Nội.
12. Phạm Hữu Hiển, Lê Thị Anh Đào (2004), "Chiết tách lupeol từ lá me rừng", Tạp chí hóa học và ứng dụng, số 10, 20-22.
13. Lập Thạch Hòa (Trần Anh Kiệt chuyển ngữ - 2003), Canh dưỡng sinh, tr.41-42, 171-175.
14. Phùng Thị Hồng (2012), Chiết xuất, phân lập một số thành phần từ lá cây Gạo, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học, Trường Đại học dược Hà Nội, Hà Nội. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
15. Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr.624-625.
16. Hoàng Thị Sản - Hoàng Thị Bé (2003), Thực hành phân loại thực vật, Nhà xuất bản Giáo dục.
17. Hà Đăng Thành (2007), Nghiên cứu đặc diểm thực vật và thành phần hóa học của rễ cây ngưu bàng thu hái tại Sapa, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội.
18. Trần Thị Thu Thủy (2010), Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây Ngưu bàng thu hái tại địa bàn Hà Nội, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội.
19. Trần Thị Thu Trang (2007), Nghiên cứu đặc điểm vi học và thành phần hóa học của vị thuốc Ngưu bàng căn thu mua trên thị trường Hà Nội, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội. 20. Lê Anh Tuấn và cộng sự (2004), "Các triterpene ancol từ cây
Xerospermum lavevigatum Radlk.", Tạp chí Hóa học, 42(4), tr.466-469. 21. Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, tr.426-430.
22. Quách Tuấn Vinh (2005), Dùng cây thuốc, Nhà xuất bản Y học và Quân đội Nhân Dân, tr 218-219.
23. Hoàng Văn Vinh (2001), Cây thuốc – vị thuốc Đông Y, Nhà xuất bản Hà Nội, tr.1313 -1320.
TIẾNG ANH
24. Awale S. et al. (2006), “Identification of arctigenin as an antitumor agent having the ability to eliminate the tolerance of cancer cells to nutrient starvation”, Cancer Res., 66(3), 1751-1757.
25. Bhat SH., Azmi AS., Hadi SM. (2007), “Prooxidant DNA breakage induced by caffeic acid in human peripheral lymphocytes: Involvement of endogenous copper and a putative mechanism for anticancer properties”,
Toxicol. Appl. Pharm., 218, 249-255.
26. Bouayed J. et al. (2007), “Chlorogenic acid, a polyphenol from Prunus domestica (Mirabelle), with coupled anxiolytic and antioxidant effects”, J. Neurol Sci., 262, 77-84.
27. Cao J. et al. (2012), “Antidiabetic effect of budrock (Arctium lappa L.) root ethanol extract on streptozotocin induced diabetic rats”, African Journal of Biotechnology, 11(37), 9079-9085.
28. Cakir A. et al. (2006), “Antioxidant activities of the extracts and components of Teucrium orientale L. var. orientale”, Turk. J. Chem., 30, 483-494.
29. Chen F.A., Wu A.B., Chen C.Y. (2004), “The influence of different treatments on the free radical scavenging activity of burdock and variations of its active components”, Food Chem., 86, 479-484.
30. Chris O. Van Den Broucke et al. (1982), “Three methylated flavonones from Thymus vulgaris”, Phytochemistry, 21(10), 2581-2583.
31. Duh P.D. (1998), “Antioxidant activity of Burdock (Arctium lappa
Linné): Its scavenging effect on free-radical and active oxygen”, J. Am. Oil Chem. Soc., 75(4), 455-461.
32. Gallo M.B.C., Sarachine M.J. (2009), "Biological activities of lupeol",
33. Gao Y., Dong X., Kang T.G. (2002), “Activity of in vitro anti-influenza virus of arctigenin” , Zhong Yong Cao, 33, 48-54.
34. Isobe T. et al. (2006), “The anti-Helicobacter pylori flavones in a Brazilian plant, Hyptis fasciculata, and the activity of methoxyflavones”,
Biol. Pharm. Bull., 29(5), 1039-1041.
35. Jaiswal R., Kuhnert N. (2011), “Identification and characterization of five new classes of chlorogenic acids in burdock (Arctium lappa L.) roots by liquid chromatography/ tandem mass spectrometry”, Food Funct., 2(1), 63-71.
36. Jeelani S., Khuro M.A. (2012), “Triterpenoids from Arctium lappa”,
Nat. Prod. Res., 26(7), 654-658.
37. Kardosová A. et al. (2003), “A biologically active fructan from the roots of Arctium lappa L., var. herkules”, Int. J. Biol. Macromol., 33(1-3), 135-140.
38. Li Y. et al. (2008), “Neuroprotective effects of chlorogenic acid against apoptosis of PC12 cells induced by methylmercury”, Environ. Toxicol. Phar., 26, 13-21.
39. Lin C.C. et al. (1996), “Anti-inflammatory and radical scavenge effects of Arctium lappa”, Am. J. Chin. Med., 24(2), 127-37.
40. Lin S. C. et al. (2000), “Hepatoprotective effects of Arctium lappa on carbon tetrachloride- and acetaminophen-induced liver damage”, Am. J. Chin. Med., 28, 163-173. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
41. Lin S.C. et al. (2002), “Hepatoprotective effects of Arctium lappa Linne on liver injuries induced by chronic ethanol consumption and potentiated by carbon tetrachloride”, J. Biomed. Sci., 9, 401-409.
42. Lin X.C. et al. (2004), “Extraction and content comparision of chlorogenic acid in Arctium lappa L. leaves collected from different terrain and its restraining bacteria test”, Nat. Prod. Res. & Dev., 16, 328-330.
43. Liu H. et al. (2010), “Determination of the major constituents in fruit of
Arctium lappa L. by matrix solid-phase dispersion extraction coupled with HPLC separation and fluorescence detection”, J. Chromatogr. B, 878, 2707-2711.
44. Mitsuo M., Nobuo Y., Katsya T. (2005), “Inhibitory compounds of alpha glucosidase activity from Arctium lappa L.”, J. Oleo. Sci., 54, 589- 594.
45. Mochamad Sholichin et al. (1980), “13C nuclear magnetic resonace of lupane-type triterpenes, lupeol, betulin and betulinic acid”, Chem. Pharm. Bull., 28(3), 1006-1008.
46. Pari L., Prasath A. (2008), “Efficacy of caffeic acid in preventing nickel induced oxidative damage in liver of rats”, Chem. Biol. Interact., 173(2), 77-83.
47. Park S.Y. et al. (2007), “Lignans from Arctium lappa and their