Định tính sơ bộ các nhóm chất hóa học trong cắn phân đoạn ethylacetat bằng phản ứng hóa học [2], [3], [11].
Định tính cắn ethylacetat bằng SKLM [11]. Sử dụng bản mỏng tráng sẵn Silicagel GF254 (Merck), khai triển với nhiều hệ dung môi khác nhau. Quan sát dưới ánh sáng thường (AST), dưới đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 365nm khi chưa phun TT và ở AST sau khi phun TT hiện màu là dung dịch vanillin/H2SO4 10% lên bản mỏng, sấy ở 1100C.
2.2.2. Chiết xuất
Chiết xuất bằng phương pháp chiết nóng với máy chiết liên tục (Shoxlet) [11].
- Chiết xuất:
Bột dược liệu (đã xác định độ ẩm) được chiết liên tục bằng Shoxlet lần lượt với từng dung môi n-hexan, chloroform, ethylacetat. Sau mỗi lần chiết với một loại dung môi, bã dược liệu được làm khô rồi tiếp tục chiết với loại dung môi tiếp theo. Mỗi phân đoạn chiết, cất thu hồi dung môi đến khối lượng không đổi. Cân cắn và tính hiệu suất chiết của từng phân đoạn.
- Hàm lượng % của cắn so với khối lượng bột dược liệu được tính theo công thức sau:
X% = ) 1 ( % 100 . x M a Trong đó: X: hàm lượng (%)
M: khối lượng dược liệu đem chiết (g) x: độ ẩm dược liệu (%)
a: khối lượng cắn (g)
2.2.3. Phân lập các chất
Sử dụng phương pháp sắc ký cột thông dụng để phân lập các chất [11].
2.2.3.1. Tiến hành phân lập các chất
- Chuẩn bị cột:
Cột rửa sạch, sấy khô, lắp thẳng đứng trên một giá cố định.
Dùng đũa thủy tinh dài để lót một lớp bông (loại bông thấm nước) lên trên ống thoát dịch của cột.
Cân một lượng silicagel cần dùng vào cốc có mỏ. Thêm dung môi rửa giải vào, dùng đũa thủy tinh khuấy đều cho tới khi hết bọt khí.
Mở vòi, rót hỗn dịch trên vào cột, cho dung môi chảy và để silicagel lắng tự nhiên xuống đáy cột. Khi dung môi chảy gần hết trong cột, tiếp tục rót hỗn dịch trên vào cột. Chú ý không để khô dung môi ở cột. Tiếp tục dùng dung môi hứng được rót lên cột và cho chảy liên tục 1 thời gian. Ổn định cột trong 12 giờ.
- Nạp mẫu vào cột:
Trộn đều một lượng bột silicagel với dung dịch cắn ethylacetat, để dung môi bay hơi rồi đưa mẫu lên cột, rải thành một lớp đều đặn trên mặt silicagel.
- Rửa giải:
+ Sử dụng hệ dung môi thích hợp. + Kiểm soát tốc độ dòng chảy.
+ Kiểm tra các phân đoạn thu được bằng SKLM, các phân đoạn cho sắc ký đồ giống nhau thì gộp thành một phân đoạn.
2.2.3.2. Tinh chế các chất phân lập
Sử dụng phương pháp kết tinh lại hoặc rửa nhiều lần bằng dung môi ít hòa tan chất phân lập.
2.2.3.3. Kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập
Độ tinh khiết của chất phân lập được kiểm tra bằng SKLM. Mỗi chất phân lập được kiểm tra bằng nhiều hệ dung môi khác nhau.
2.2.4. Nhận dạng chất phân lập
Các chất phân lập được ở dạng tinh khiết được khảo sát các đặc trưng vật lý: màu sắc, dạng thù hình, điểm nóng chảy, độ tan. Khi các chất đủ sạch, tiến hành ghi các phổ: phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), carbon 13 (13C-NMR), phổ DEPT. Các dữ liệu phổ thu được dùng để xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập.
Chương 3
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. ĐỊNH TÍNH MỘT SỐ NHÓM CHẤT TRONG DƯỢC LIỆU BẰNG PHẢN ỨNG HÓA HỌC PHẢN ỨNG HÓA HỌC
Tiến hành định tính mẫu nghiên cứu các nhóm chất thường gặp trong phân đoạn ethylacetat của dược liệu bằng phản ứng hóa học, kết quả được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả định tính một số nhóm chất trong mẫu nghiên cứu
TT Nhóm chất P/ư định tính Kết quả Kết luận
1 Flavonoid
P/ư Cyanidin +
Có
P/ư với dd NaOH 10% +++
P/ư với dd FeCl3 5% ++
P/ư với NH3 đặc ++
2 Tanin
P/ư với dd FeCl3 5% ++
Có P/ư với dd chì acetat 10% ++
P/ư với dd gelatin 1% +++
P/ư với dd đồng acetat 10% + 3 Coumarin P/ư mở, đóng vòng lacton +++
Có
P/ư huỳnh quang +
Ghi chú: (-): phản ứng âm tính
(+): phản ứng dương tính (++): phản ứng dương tính rõ (+++): phản ứng dương tính rất rõ
Nhận xét: Bằng các phản ứng hóa học thường quy, kết quả cho thấy trong cắn phân đoạn ethylacetat của rễ Ngưu bàng có chứa các nhóm chất: flavonoid, tannin, coumarin.
3.2. CHIẾT XUẤT, ĐỊNH TÍNH CẮN ETHYLACETAT BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG LỚP MỎNG
3.2.1. Độ ẩm của bột dược liệu
Lấy khoảng 2g bột dược liệu để xác định độ ẩm. Bật máy đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 1300C. Trải đều dược liệu lên đĩa cân, đậy đĩa cân và đợi máy tự động hiện kết quả.
Độ ẩm dược liệu là 8,62%.
3.2.2. Chiết xuất
Cân chính xác khoảng 500g bột dược liệu, chiết bằng phương pháp chiết nóng với máy chiết liên tục (Shoxlet), lần lượt với từng dung môi n- hexan, chloroform, ethylacetat. Sau mỗi lần chiết với một loại dung môi, bã dược liệu được làm khô rồi chiết tiếp với dung môi tiếp theo. Cất thu hồi dung môi của mỗi phân đoạn chiết đến cắn (khối lượng không đổi) và ký hiệu lần lượt là cắn H, cắn C, cắn E.
Sơ đồ chiết xuất được mô tả như ở hình 3.1.
Bảng 3.2. Hàm lượng cắn các phân đoạn chiết xuất từ rễ Ngưu bàng
STT Phân đoạn Khối lượng dược liệu (g) Khối lượng cắn (g) % so với nguyên liệu khô 1 n-hexan 500,05 8,0621 1,76 2 chloroform 500,05 16,1029 3,52 3 ethylacetat 500,05 24,9302 5,46
Hình 3.1: Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ rễ ngưu bàng
Bột rễ Ngưu bàng
Dịch chiết n-hexan Bã dược liệu
Cắn H
Dịch chiết chloroform Bã dược liệu
Cắn C
Dịch chiết ethylacetat
Cắn E
n-hexan
n-hexan thu hồi chloroform
choloroform thu hồi ethylacetat
ethylacetat thu hồi
3.2.3. Định tính cắn ethylacetat bằng SKLM
- Mẫu thử: cắn ethylacetat được hòa tan trong methanol. - Bản mỏng silicagel tráng sẵn, hoạt hóa ở 1100C trong 1h. Tiến hành thăm dò trên nhiều hệ dung môi khai triển.
Hệ I : Toluen – Aceton – Methanol (6:1:1) Hệ II : Ethylacetat – Methanol – Nước (8:1:1) Hệ III: Chloroform – Methanol – Nước (4:3:3)
Hệ IV: Toluen – Ethylacetat – Acid formic (5,5:4:0,5)
Hệ V : Chloroform – Methanol – Acid acetic – Nước (2:1:1:2) - Thuốc thử hiện màu: dd vanillin/H2SO410%.
- Tiến hành: chấm dịch chấm sắc ký lên bản mỏng, sấy nhẹ cho bay hết dung môi, đặt vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi. Sau khi khai triển, lấy bản mỏng ra, sấy khô, quan sát dưới AST, UV365nm, UV254nm. Sau đó phun thuốc thử, sấy ở 1100C, quan sát tiếp dưới AST.
Sau nhiều lần khai triển sắc ký thấy hệ IV cho kết quả tách tốt nhất. Kết quả được thể hiện trên hình 3.2 và bảng 3.3.
1 2 3 4
Hình 3.2. Sắc ký đồ của cắn ethylacetat với hệ dung môi IV
1) không phun TT, AST 3) không phun TT,UV254nm 2) không phun TT, UV365nm 4) phun TT, AST
Bảng 3.3. Màu sắc và giá trị Rf của cắn ethylacetat trên SKLM với hệ dung môi khai triển IV
STT Không có thuốc thử Có thuốc thử
Rf x100 AST UV365nm UV254nm AST 1 Đen ++++ 5,45 2 XD + 10,90 3 Đen ++++ 12,73 4 Hồng + 20,00 5 XD + Đen + 22,73 6 Hồng + 29,09 7 XD +++ Đen + 30,91 8 Hồng + 36,36 9 XD ++++ 38,18 10 Đen + 43,64 11 XD ++++ Hồng + 44,55 12 XD ++++ Đen ++++ 49,09 13 XD + 52,73 14 Đen ++ Vàng +++ 54,55 15 XD +++ 56,36 16 XLM +++ 62,27 17 Đen ++++ Hồng ++++ 63,64 18 Đen +++ 69,09 19 XD ++++ 72,73 20 XLM +++ 87,27 Chú thích: +: rất mờ ++: mờ +++: rõ ++++: rất rõ 3.3. PHÂN LẬP 3.3.1. Phân lập
Cắn ethylacetat (24,30g) được phân lập trên cột silicagel, rửa giải với hệ dung môi n-hexan : ethylacetat (5:1) thu được 2 phân đoạn E1 và E2. Kiểm tra các phân đoạn thu được bằng SKLM.
Phân đoạn E1 được phân lập tiếp trên cột silicagel, rửa giải với hệ dung môi n-hexan : aceton (6:1). Kiểm tra thành phần của dịch rửa giải bằng
SKLM để dồn các ống có cùng thành phần, thu được 5 phân đoạn. Phân đoạn số 2 (ký hiệu là E11) được phân lập bằng dung dịch chloroform. Tiến hành chạy cột silicagel phân đoạn số 3 (E111) trong 7 phân đoạn thu được ở trên với hệ dung môi rửa giải n-hexan : aceton (15:1). Sau khi dồn ống (kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng), thu được 10 phân đoạn. Tiếp tục đưa phân đoạn 4 (trong 10 phân đoạn trên, E1111) lên cột silicagel và tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan : aceton (12:1), thu được 55 phân đoạn. Sau khi để cho bay hơi tự nhiên, thấy xuất hiện kết tinh ở phân đoạn 3 (ống 21-35), ký hiệu là TA08. Tinh chế TA08 bằng phương pháp kết tinh lại. Cô đến cắn có khối lượng không đổi, xác định khối lượng của TA08 là 12mg.
Phân đoạn E2 được phân lập tiếp trên cột silicagel, với hệ dung môi methanol : nước (1:2) thu được 34 phân đoạn. Phân đoạn 12 được đưa lên cột silicagel rửa giải bằng hệ dung môi chloroform : aceton (1:1,5) thu được 5 phân đoạn. Sau khi để bay hơi tự nhiên có 1 phân đoạn xuất hiện kết tinh trong ống nghiệm, ký hiệu là TA09 (ống 45-54). Tinh chế TA09 bằng phương pháp kết tinh lại. Sau khi cô đến cắn, khối lượng của TA09 là 20mg.
n-hexan:ethylacetat (5:1) n-hexan:aceton (6:1) methanol:nước (1:2) 100% chloroform chloroform:aceton (1:1,5) n-hexan:aceton (15:1) n-hexan:aceton (12:1)
Hình 3.3. Sơ đồ phân lập các thành phần từ phân đoạn ethylacetat chiết xuất từ rễ Ngưu bàng. Cắn ethylacetat (cắn E) Cắn E1 Cắn E2 Cắn E11 Cắn E21 Cắn E1111 TA08 Cắn E111 TA09
3.3.2. Kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập
3.3.2.1. Kiểm tra độ tinh khiết của chất TA08
TA08 được khai triển với 3 hệ dung môi: Hệ I: n-Hexan - Aceton (8:2) Hệ II: Toluen - Ethylacetat (7:2)
Hệ III: Toluen - Ethylacetat - Acid formic (7:2:0,5)
Kết quả: TA08 chỉ xuất hiện 1 vết màu vàng nâu sau khi phun thuốc thử (vanillin/H2SO4 10%) ở AST với cả 3 hệ dung môi (hình 3.3).
Vì vậy sơ bộ kết luận TA08 là một chất tinh khiết.
Hệ I Hệ II Hệ III
Hình 3.4. Hình ảnh SKLM của TA08 với 3 hệ dung môi sau khi phun TT quan sát ở AST
Bảng 3.4. Kết quả SKLM của TA08 với 3 hệ dung môi sau khi phun TT quan sát ở AST
Hệ dung môi I II III
Rf × 100 17,91 36,23 70,59
Sắc ký so sánh TA08 với cắn ethylacetat trên cùng một bản mỏng, dung môi khai triển là hệ chloroform : methanol (6:1). Kết quả thể hiện trên hình 3.5.
Hình 3.5. Sắc ký so sánh TA08 với cắn ethyl acetat sau khi phun TT quan sát ở AST
3.3.2.2. Kiểm tra độ tinh khiết của chất TA09
TA09 được kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM triển khai với 3 hệ dung môi:
Hệ I: Toluen – Ethylacetat – Acid formic (5:3:1) Hệ II: Chloroform – Methanol (9:1)
Hệ III: Toluene – Aceton – Acid formic (6:2:1)
Kết quả: TA09 chỉ xuất hiện 1 vết màu tím sau khi phun thuốc thử (vanillin/H2SO4 10%) ở AST ở cả 3 hệ dung môi (hình 3.5). Trước khi phun thuốc thử, quan sát ở AST, UV254, UV365 đều không xuất hiện vết nào ở cả 3 hệ dung môi.
Hệ I Hệ II Hệ III
Hình 3.6. Hình ảnh SKLM của TA09 với 3 hệ dung môi sau khi phun TT quan sát ở AST
Bảng 3.5. Kết quả SKLM của TA09 với 3 hệ dung môi sau khi phun TT quan sát ở AST
Hệ dung môi I II III
Rf × 100 54,54 42,37 50,85
Màu sắc Tím Tím Tím
Sắc ký so sánh TA09 với cắn ethylacetat trên cùng một bản mỏng với hệ dung môi khai triển là hệ chloroform : methanol (6:1). Kết quả được thể hiện trên hình 3.7.
Hình 3.7. Sắc ký so sánh TA09 với cắn ethylacetat sau khi phun TT quan sát ở AST
3.4. NHẬN DẠNG CÁC CHẤT PHÂN LẬP
3.4.1. Hợp chất TA08
- Tính chất: TA08 là chất kết tinh ở dạng tinh thể hình kim màu trắng (hình 3.8), nhiệt độ nóng chảy là 188-189oC. Tan trong cloroform, ethylacetat, không tan trong nước.
Hình 3.8. Ảnh tinh thể của TA08 dưới KHV vật kính 40
- Phổ khối lượng ESI-MS m/z = 427 [M+H]+. Công thức phân tử C30H50O, M=426.
- Phổ NMR (bảng 3.6) chỉ ra rằng chất này là triterpenoid có khung lup-20(29)-en.
Phổ 1H-NMR của TA08 cho thấy tín hiệu của 7 nhóm methyl (-CH3) cộng hưởng trong vùng trường mạnh, trong đó có 6 nhóm methyl bậc ba tại các giá trị δH 0,97 (3H, s, H-23); 0,76 (3H, s, H-24); 0,83 (3H, s, H-25); 1,03 (3H, s, H-26); 0,94 (3H, s, H-27); 0,79 (3H, s, H-28) và một tín hiệu CH3 tại δH 1,68 (3H, br, s, H-30) thuộc nhánh isopropenyl. Tín hiệu 2 proton thuộc nhánh isopropenyl xuất hiện tại δH 4,68 (1H, d, J=1,0Hz) và δH 4,56 (1H, d, J=1,0Hz). Ngoài ra, tín hiệu tại δH 3,19 (1H, dd J=11,5, 5,0 Hz, H-3) khẳng định sự có mặt của một nhóm oximethin (CH-O).
So sánh số liệu phổ NMR của chất TA08 với số liệu của hợp chất triterpen khung lup-20(29)-en đã biết là lupeol (3β-hydroxylup-20(29)-en)
[45] nhận được sự phù hợp hoàn toàn ở tất cả các vị trí tương ứng (bảng 3.7). Nhận định này được khẳng định thêm khi xem xét đến hằng số tương tác J của proton H-3. Proton H-3 cộng hưởng tại δ 3,19 (dd, J=11,5, 5,0 Hz), tín hiệu doublet này cho thấy hằng số tương tác J lớn, vì vậy H-3 ở vị trí axial (a) hay alpha (α) dẫn tới OH tại C-3 là equatorial (e) [45]. Từ các phân tích nêu trên hợp chất TA08 được xác định là 3β-hydroxylup-20(29)-en hay lupeol.
Bảng 3.6. Dữ liệu phổ NMR của TA08
C #C
[45]
C a,b DEPT Ha,c
1 38,7 38,76 CH2 2 27,5 27,46 CH2 3 79,0 79,03 CH 3,19 dd (11,5; 5,0) 4 38,9 38,89 - 5 55,3 55,36 CH 6 18,3 18,35 CH2 7 34,3 34,34 CH2 8 40,9 40,88 - 9 50,5 50,50 CH 10 37,2 37,21 - 11 21,0 20,97 CH2 12 25,2 25,21 CH2 13 38,1 38,11 CH 14 42,9 42,87 - 15 27,5 27,49 CH2 16 35,6 35,62 CH2 17 43,0 43,03 -
18 48,0 48, 01 CH 19 48,3 48, 36 CH 2,38 dd (11,0; 11,0; 6,0) 20 150,9 150,96 - 21 29,9 29,90 CH2 22 40,0 40,03 CH2 23 28,0 28,01 CH3 0,97s 24 15,3 15,38 CH3 0,76s 25 16,1 16,13 CH3 0,83s 26 16,0 16,01 CH3 1,03s 27 14,6 14,58 CH3 0,94s 28 18,0 18,03 CH3 0,79s 29 109,3 109,33 CH2 4,68s/4,56s 30 19,3 19,33 CH3 1,68s
#C của lupeol đo trong CDCl3 ở 25,25 MHz (13C) [45], a Đo trong CDCl3, b125 MHz,
c500 MHz. HO H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 24 23 25 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 26 27 28 29 30
3.4.2. Hợp chất TA09
- Tính chất: TA09 là dạng tinh thể màu vàng (hình 3.8). Nhiệt độ nóng chảy là 213oC. Tan trong methanol, ethylacetat. Công thức phân tử C18H16O7, M = 344.
Hình 3.10. Ảnh tinh thể TA09 dưới KHV vật kính 40
Phổ 1H-NMR của TA09 chỉ ra các tín hiệu đặc trưng của flavon. Trên phổ có xuất hiện tín hiệu đơn của 3 nhóm methoxy tại δ 3,93 (s, 3H, O-Me-6), 3,90 (s, 3H, O-Me-7) và 3,73 (s, 3H, O-Me-3’). Ngoài ra còn xuất hiện tín hiệu của 5 olefinlic proton tại các vị trí cộng hưởng δ 6,93-6,95 (m, 3H, H -3, H-8 và H-5’) và δ 7,59-7,61(m, 2H, H -2’ và H-6’).
Trên phổ 13C-NMR của TA09 xuất hiện 18 tín hiệu carbon đặc trưng cho hợp chất flavon gồm 3 tín hiệu của nhóm methoxy, 5 tín hiệu carbon methyl và 10 tín hiệu carbon bậc bốn. Tín hiệu của nhóm carbonyl vòng C được xác định tại vị trí cộng hưởng δ 182,22 (C-4). Năm tín hiệu carbon bậc 4 gắn nguyên tử oxy được xác định tại các vị trí cộng hưởng 152,03(C-5), 131,87(C-6), 152,61(C-7), 148,04 (C-3’) và 150,87(C-4’). Bên cạnh đó còn xuất hiện tín hiệu của nối đôi vòng C tại các tín hiệu cộng hưởng 163,97(C- 2)/102,99(C-3).
So sánh với dữ liệu phổ của hợp chất cirsilineol (5, 4’-dihydroxy-6,7,3’- trimethoxyflavon) [30] thấy hoàn toàn phù hợp tại các vị trí tương ứng. Do
đó, có thể kết luận hợp chất TA09 là cirsilineol (5,4’-dihydroxy-6,7,3’- trimethoxyflavon).
Bảng 3.7. Dữ liệu phổ NMR của TA09
C #C [30] C a,b Ha,c 2 163,87 163,97 - 3 102,96 102,99 6,93-6,95 4 182,13 182,22 - 5 151,98 152,03 - 6 131,67 131,87 - 7 152,53 152,61 - 8 91,55 91,59 6,93-6,95 9 158,53 158,58 - 10 105,02 105,06 - 1’ 121,34 121,39 - 2’ 110,18 110,26 7,59-7,61