dài thực nghiệm.
- Indapamid: Dược chất
- HPMC: là tá dược kiểm soát giải phóng theo cơ chế trương nở tạo hàng rào gel và ăn mòn dần kiểm soát tốc độ giải phóng dược chất.
- Dicalci phosphat: là tá dược độn và kiểm soát giải phóng theo cơ chế tạo cốt trơ khuếch tán.
- Ethyl cellulose: tá dược sơ nước, làm chậm giải phóng dược chất. - Lactose: tá dược độn.
- Aerosil, magnesi stearat: Là tá dược trơn đóng vai trò điều hòa sự chảy, giảm ma sát và chống dính, làm viên bóng đẹp, có tính chất sơ nước có thể tham gia vào kiểm soát giải phóng dược chất.
- PVP K30: là tá dược dính, thân nước, có thể làm tăng mức độ hòa tan dược chất trong cốt.
- Ethanol 96%: Đóng vai trò là dung môi hòa tan PVP K30 tạo tá dược dính
2.2.2. Phƣơng pháp bào chế viên nén
- Rây các nguyên liệu: indapamid, HPMC K4M, HPMC E15 LV,HPMC E4M, EC, DCP, lactose qua rây số 180. Aerosil, magnesi stearat qua rây số 125.
- Cân theo công thức
- Nhào ẩm khối bột kép với dung dịch dược chất, PVP trong ethanol 96%.
- Xát hạt qua rây 1000, sấy 55-60oC tới khi đạt độ ẩm 5 %, sửa hạt qua rây 1000. - Dập viên với khối lượng trung bình 200 mg bằng chày Φ 8 hoặc 215 mg bằng chày Φ 9, lực dập 1,5 tấn.
Do hàm lượng dược chất trong viên nhỏ, để đảm bảo đồng đều hàm lượng trong viên, indapamid được phân tán trong dung dịch dính rồi mới phối hợp vào khối bột trước khi tiến hành xát hạt.
2.2.3. Phƣơng pháp đánh giá tiêu chuẩn chất lƣợng viên nén
* Hình thức: Xác định cảm quan: Viên bào chế có hình trụ lồi, màu trắng hoặc
trắng ngà, cứng chắc, bề mặt bóng đẹp không bị bong mặt sứt cạnh.
* Độ cứng
Xác dịnh bằng máy đo độ cứng ERWEKA, thử với 10 viên, lấy giá trị trung bình.
* Độ đồng đều khối lƣợng (DĐVN IV):
Đánh giá độ đồng đều khối lượng giữa các viên bằng cách cân khối lượng từng viên (thử với 20 viên bất kì), so sánh với khối lượng trung bình. Đối với viên thực nghiệm có khối lượng 250 mg, yêu cầu độ chênh lệch không vượt quá ± 7,5%.
Yêu cầu: Không quá 2 viên có khối lượng lệch quá khoảng giới hạn của khối lượng
trung bình và không có viên nào có chênh lệch quá gấp đôi độ lệch tính theo tỉ lệ %.
* Đánh giá độ ẩm của khối bột:
Xác định bằng cân đo hàm ẩm Precisa XM 60, thử với khối lượng bột trên 0,1 g.
* Đánh giá độ trơn chảy của khối bột:
Sử dụng máy đo độ trơn chảy của hạt/bột Granule tester GTL. Đo thời gian hạt chảy qua phễu có đường kính 10 mm.
* Định lƣợng: Phƣơng pháp đo quang vi sai bƣớc sóng
- Pha dung dịch thử: Cân 20 viên, xác định khối lượng trung bình viên. Nghiền thành bột mịn. Cân chính xác 1 lượng bột viên tương ứng với khoảng 1,5 mg inda- pamid cho vào bình định mức 25 ml. Thêm khoảng 15 ml ethanol, siêu âm 3 lần, mỗi lần 15 phút, mỗi lần cách nhau 10 phút .Bổ sung ethanol vừa đủ 25ml, để yên khoảng 5 giờ, đem ly tâm, dịch trong phía trên được lọc qua màng 0,45µm. Hút
chính xác 5 ml dịch lọc cho vào bình định mức 50 ml, bổ sung đệm pH 6,8 cho tới vạch, lắc đều được dung dịch có nồng độ chính xác khoảng 6 µg/ml.
- Pha dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 30,0 mg indapamid chuẩn cho vào bình định mức 50ml, thêm 30ml ethanol, siêu âm cho tan hết, bổ sung ethanol vừa đủ. Hút chính xác 1ml cho vào bình định mức 100 ml, bổ sung đệm phosphat pH 6,8 vừa đủ, lắc đều được dung dịch chuẩn có nồng độ 6 µg/ml.
- Mẫu trắng: đệm phosphat pH 6,8.
- Đo quang 2 mẫu tại 2 bước sóng 240 nm và 275nm và tính kết quả.
* Định lƣợng dƣợc chất bằng phƣơng pháp HPLC
-Pha động: Dung dịch A : methanol (50 : 50)
+ Dung dịch A: hút chính xác 0,4 mL dd HClO4 đặc, pha loãng để tạo thành 1L dung dịch A.
- Dung dịch chuẩn gốc: Pha dung dịch chuẩn gốc indapamid có nồng độ 180 µg/mL: Cân chính xác khoảng 18,0 mg indapamid chuẩn, cho vào bình định mức 100 mL. Thêm 70 mL pha động. Siêu âm 5 phút cho tan hoàn toàn, bổ sung pha động cho đến thể tích vừa đủ 100 mL.
- Dung dịch chuẩn: Lấy chính xác 5 ml dung dịch chuẩn gốc, chuyển vào bình định mức 100 ml, rồi bổ sung pha động tới thể tích vừa đủ thu được dung dịch chuẩn có nồng độ chính xác khoảng 9,0 µg/mL.
- Dung dịch thử: Nghiền, đồng nhất hóa viên (20 viên) phân tán một lượng bột tương đương 18,0 mg indapamid, bằng 70 ml pha động trong bình định mức 100 mL, siêu âm trong 20 phút, pha loãng bằng pha động tới vạch 100 mL. Ly tâm 1 phần dung dịch với tốc độ 2000 v/p/15p. Chuyển 5 mL phần dịch trong vào bình định mức 100mL, bổ sung pha động vừa đủ đến vạch. Dung dịch thử thu được có nồng độ khoảng 9,0 µg/ml.
- Hệ thống sắc kí:
+ Detector: UV 254 nm.
+ Cột: C18, phenomenex (25 cm x 4,6 mm, 5 µm). + Tốc độ dòng: 1,0 mL/min.
+ Thể tích tiêm: 20 µL.
* Phƣơng pháp đánh giá độ hòa tan từ viên nén indapamid giải phóng kéo dài Điều kiện:
- Thiết bị sử dụng: cánh khuấy.
- Môi trường: 500 ml môi trường đệm phosphat pH 6,8.
- Nhiệt độ: 37± 0,5 oC.
- Tốc độ khuấy: 100 vòng ± 1 v/p.
- Thời điểm lấy mẫu: 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ,16 giờ.
Tiến hành:
- Pha đệm phosphat pH 6,8: Cân chính xác khoảng 6,805g KH2PO4 và 0,896g NaOH cho vào bình định mức dung tích 1000 ml. Thêm 100 ml nước để hòa tan hoàn toàn. Bổ sung nước vừa đủ 1000 ml. Điều chỉnh bằng dung dịch NaOH 0,1N hoặc dung dịch HCl 0,1N nếu cần.
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Cân chính xác 50,0 mg indapamid chuẩn cho vào bình định mức 50 ml. Thêm 25 ml methanol, siêu âm cho tan hoàn toàn. Bổ sung methanol vừa đủ 50 ml. Lắc đều thu được dung dịch chuẩn gốc 0 trong methanol.
- Pha mẫu chuẩn gốc 1 trong đệm phosphat: Hút chính xác 10 ml dung dịch chuẩn gốc 0 vào bình định mức dung tích 100 ml. Pha loãng bằng dung dịch đệm phosphat pH 6,8 vừa đủ được chuẩn gốc 1 (100μg/ml).
- Pha mẫu chuẩn 2: Hút chính xác 2ml dung dịch chuẩn gốc 1 cho vào bình định mức dung tích 100 ml. Bổ sung dung dịch đệm phosphat pH 6,8 vừa đủ được mẫu chuẩn 2 (2μg/ml).
- Pha mẫu chuẩn 3 (chuẩn thêm): Hút chính xác 30 ml dung dịch chuẩn gốc 1 cho vào bình định mức dung tích 100 ml. Bổ sung dung dịch đệm phosphat pH 6,8 vừa đủ được mẫu chuẩn thêm (30μg/ml).
- Chuẩn bị dung dịch thử: Sau 1 giờ, hút chính xác 10ml dịch hòa tan. Ly tâm với tốc độ 3500 v/p/10p. Dịch nổi ly tâm đem lọc qua màng 0,45μm. Hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn thêm có nồng độ 30 μg/ml vào bình định mức 10 ml. Bổ sung
bằng dịch thử hòa tan sau lọc cho vừa đủ đến vạch thu được dung dịch thử. Bổ sung 10 ml môi trường hòa tan vào cốc và tiếp tục thử.
Tiến hành tương tự với các mẫu khác tại các thời điểm sau.
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn đo: Hút chính xác 1ml dung dịch chuẩn thêm có nồng độ 30 μg/ml cho vào bình định mức 10, bổ sung dung dịch chuẩn có nồng độ 2 μg/ml vừa đủ đến vạch.
Đo độ hấp thụ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn đo ở bước sóng 240 nm và 275 nm. Mẫu trắng là dung dịch đệm phosphat pH 6,8.
Yêu cầu % giải phóng dƣợc chất tại các thời điểm [22]:
Sau 4h : 17-27 % Sau 8h : 35-55% Sau 16h : 75 %.
* Phƣơng pháp đánh giá động học giải phóng dƣợc chất từ viên nén
Các mô hình động học được áp dụng để đánh giá quá trình giải phóng dược chất từ viên nén thực nghiệm: mô hình động học bậc 0, Higuchi.
* Đánh giá động học theo mô hình giải phóng Higuchi:
Phương trình giải phóng dược chất của động học Higuchi có dạng : C(t) =
o
W
100
x KH x t (%)
Trong đó: C(t) là % dược chất giải phóng thời điểm t; Wo là tổng lượng dược chất có trong mẫu; KH là hằng số Higuchi.
Để đánh giá động học theo mô hình Higuchi, dùng phần mềm Excel 2010 xây dựng đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa % indapamid giải phóng với căn bậc hai thời gian, xác định hệ số tương quan R2
.
* Đánh giá động học theo mô hình giải phóng bậc 0:
Phương trình giải phóng dược chất của động học bậc 0 có dạng : C(t) =
o
W
100
Trong đó: C(t) là % dược chất giải phóng thời điểm t; Wo là tổng lượng dược chất có trong mẫu; Ko là hằng số giải phóng bậc 0. Đây là mô hình lí tưởng cho quá trình giải phóng thuốc từ dạng thuốc kéo dài.
Để đánh giá động học theo mô hình động học bậc 0, dùng phần mềm Excel 2010 xây dựng đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa % indapamid giải phóng với thời gian, xác định hệ số tương quan R2.
* Đánh giá sự tƣơng đồng đƣờng cong hòa tan giữa viên nghiên cứu và viên đối
chiếu. Hệ số tương quan (f2): f2 = 50 x Log ( ) .100 1 1 5 . 0 1 2 n t t t T R n
Trong đó: n : số thời điểm lấy mẫu.
Rt, Tt: % dược chất giải phóng trong viên đối chiếu và viên thử tại thời điểm t
Ý nghĩa: Hai đồ thị được coi là tương tự nhau nếu f2 nằm trong khoảng 50-100. Giá trị f2 càng lớn, hai đồ thị càng giống nhau.
Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kiểm tra lại một số chỉ tiêu trong các phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng viên indapamid giải phóng kéo dài
3.1.1. Phƣơng pháp định lƣợng dƣợc chất trong viên bằng phƣơng pháp đo độ hấp thụ UV
* Quét phổ tìm bƣớc sóng hấp thụ cực đại
Tiến hành quét phổ UV-VIS dung dịch indapamid gốc có nồng độ 2 µg/ml trong môi trường đệm phosphat pH 6,8 từ bước sóng 200 nm đến 400 nm xác định được bước sóng hấp thụ cực đại là max= 240 nm. Từ kết quả trên và tham khảo dược điển Anh [12] chọn 2 bước sóng 240 nm và 275 nm để tiến hành đo quang vi sai.
* Xây dựng đƣờng chuẩn biểu thị sự phụ thuộc giữa nồng độ dung dịch
indapamid trong đệm phosphat pH 6,8 với hiệu mật độ quang
Trong môi trường đệm phosphat pH 6,8 pha dãy dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 µg/ml. Tiến hành đo quang vi sai ở 2 bước sóng 240 nm và 275 nm. Kết quả thu được thể hiện trong bảng và hình sau:
Bảng 3.1: Hiệu mật độ quang dung dịch indapamid trong môi trường đệm phosphat
Nồng độ
(µg/ml) 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Hiệu mật độ
quang (ΔA) 0,091 0,148 0,195 0,246 0,292 0,339 0,393 0,44 0,499
y = 0,05x - 0,006 R2 = 0,9993 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0 2 4 6 8 10 12 C (µg/ml) ΔA
Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ dung dịch
indapamid và hiệu mật độ quang
Nhận xét: Hệ số tương quan r2= 0,9993 (~ 1) cho thấy sự phụ thuộc giữa nồng độ dung dịch indapamid với hiệu mật độ quang trong môi trường đệm phosphat pH 6,8 ở bước sóng khảo sát 240nm và 275 nm là tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát từ 2-10 µg/ml. Vì vậy đảm bảo tính chính xác khi định lượng dược chất trong viên khi pha mẫu thử có nồng độ 6 µg/ml.
3.1.2. Phƣơng pháp định lƣợng dƣợc chất trong dịch hòa tan bằng phƣơng pháp thêm chuẩn
* Xây dựng đƣờng chuẩn biểu thị sự phụ thuộc giữa nồng độ dung dịch
indapamid trong đệm phosphat pH 6,8 với hiệu mật độ quang
Trong môi trường đệm phosphat pH 6,8 pha dãy dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt 0,5, 1, 2, 3, 4, 5 µg/ml. Pha dung dịch chuẩn thêm có nồng độ 30 µg/ml. Tiến hành thêm chuẩn như đã trình bày ở mục 2.2.3 và đo quang vi sai ở 2 bước sóng 240 nm và 275 nm. Kết quả thu được thể hiện trong bảng và hình sau:
Bảng 3.2: Hiệu mật độ quang dung dịch indapamid trong môi trường đệm phosphat C (µg/ml) 0,5 1 2 3 4 5 ΔA 0,099 0,144 0,195 0,246 0,297 0,352 y = 0,0543x + 0,0819 R2 = 0,9958 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0 1 2 3 4 5 6 C (µg/ml) ΔA
Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ dung dịch
indapamid và hiệu mật độ quang
Nhận xét: hệ số tương quan r2
= 0,9958 (~ 1) chứng tỏ trong môi trường đệm phosphat pH 6,8 sự phụ thuộc giữa nồng độ dung dịch indapamid với hiệu mật độ quang ở bước sóng khảo sát 240nm và 275 nm là tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát từ 0,5-8 µg/ml. Vì vậy đảm bảo tính chính xác khi định lượng bằng phương pháp thêm chuẩn có nồng độ 3 µg/ml vào dung dịch cần đo.
3.1.3. Định lƣợng dƣợc chất bằng phƣơng pháp HPLC * Xác định độ đặc hiệu của phƣơng pháp định lƣợng.
- Chuẩn bị mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử theo phương pháp ghi ở mục 2.2.3. - Tiến hành chạy HPLC mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử. Kết quả thu được thể hiện ở bảng dưới đây:
Bảng 3.3: Thời gian lưu và diện tích pic đáp ứng
Mẫu Thời gian lưu (ph) Diện tích pic
Mẫu trắng - -
Mẫu chuẩn 5,81 320005
Mẫu thử 5,80 280216
Nhận xét: Không xuất hiện pic indapamid trên sắc kí đồ của mẫu trắng. Mẫu chuẩn
và mẫu thử cho pic với thời gian lưu tương ứng giống nhau. Phương pháp định lượng indapamid bằng kỹ thuật HPLC đạt yêu cầu về độ đặc hiệu.
* Xác định khoảng tuyến tính.
Tiến hành pha dãy dung dịch chuẩn có nồng độ 0,15; 0,30; 0,75; 1,50; 2,25; 3,00; 3,75; 4,50; 6; 9; 12 µg/mL.Tiêm lần lượt các mẫu chuẩn theo thứ tự. Xác định thời gian lưu và diện tích pic. Kết quả thu được thể hiện ở bảng và hình dưới đây:
Bảng 3.4: Thời gian lưu và diện tích pic đáp ứng
Bảng 3.4: Thời gian lưu và diện tích pic đáp ứng (tiếp)
Nồng độ dung dịch
indapamid 0,15 0,30 0,75 1,50 2,25 3,00
Thời gian lưu
(phút) 5,81 5,80 5,82 5,77 5,81 5,80
Diện tích pic
(mAU) 5422 8239 26433 51304 73124 104520
Nồng độ dung dịch
indapamid 3,75 4,50 6 9 12
Thời gian lưu
(phút) 5,81 5,79 5,79 5,78 5,80
Diện tích pic
y = 36424x - 3865,9 R2 = 0,9994 0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 450000 500000 0 2 4 6 8 10 12 14 C(µg/ml) S pi c( m A u)
Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic
và nồng độ dung dịch indapamid
Nhận xét: Hệ số tương quan r2= 0,9994 (~ 1). Phương pháp định lượng indapamid cho khoảng tuyến tính từ nồng độ 0,15 µg/ml tới 12 µg/ml. Do vậy đảm bảo tính chính xác khi định lượng dược chất trong dịch hòa tan và định lượng dược chất trong viên bằng phương pháp HPLC.
* Xác định độ chính xác (precision)
Lấy mẫu chuẩn với nồng độ 0,15; 3,00 µg/ml và 9,00 µg/ml, tiêm 6 lần, xác định thời gian lưu, diện tích pic, tính RSD của các mẫu. Kết quả thể hiện qua bảng sau:
Bảng 3.5: Thời gian lưu, diện tích pic đáp ứng
Lần đo Nồng độ 0,15 µg/ml Nồng độ 3,00 µg/ml Nồng độ 9,00 µg/ml Thời gian lưu Diện tích pic Thời gian lưu Diện tích pic Thời gian lưu Diện tích pic 1 5,81 5422 5,79 104647 5,81 324301 2 5,84 4538 5,79 104875 5,78 325369 3 5,79 5000 5,78 106466 5,81 320005 4 5,76 4604 5,78 106745 5,78 328954 5 5,81 4999 5,80 104257 5,77 325164 6 5,81 5037 5,81 104520 5,79 321487
Giá trị
trung bình 5,80 10445 5,79 105252 5,78