3.2.2.1. Định tính dịch chiết MeOH bằng sắc ký lớp mỏng A. Chiết xuất
Cân khoảng 10g dược liệu cho vào bình nón 250ml. Thêm khoảng 50ml methanol. Ngâm lạnh trong 1 ngày. Sau đó lọc. Đem cô tới khi thu được dịch để chấm sắc ký.
B. Tiến hành và kết quả
Sử dụng dịch chấm sắc ký, tiến hành thăm dò trên nhiều hệ dung môi khác nhau. Hệ I: Toluen - Ethyl acetat - Acid formic (5:4:1)
Hệ II: Chloroform - Diethyl ether - Acid formic (7:3:0,5) Hệ III: Chloroform - Fomaldehyd (92:8)
Kết quả cho thấy, hệ I cho kết quả tách tốt nhất.
Kết quả hệ I: Toluen – Ethyl acetat – Acid formic (5:4:1)
Hình 3.4. Hình ảnh sắc ký đồ dịch chiết củ Khoai nưa trong MeOH triển khai hệ dung môi Toluen - Ethyl acetat - Acid formic (5:4:1)
Ia. Sắc ký đồ dịch chiết ở bước sóng 254nm Ib. Sắc ký đồ dịch chiết ở bước sóng 366nm Ic. Sắc ký đồ dịch chiết ở ánh sáng thường sau khi phun TT
3.2.2.2. Định tính dịch chiết CHCl3 bằng sắc ký lớp mỏng A. Chiết xuất
Cân khoảng 10g dược liệu cho vào bình nón dung tích 250ml. Thêm khoảng 50ml methanol. Ngâm lạnh trong 1 ngày. Sau đó lọc. Cho vào trong dịch lọc 20ml HCl 5%. Đun sôi cách thủy trong 3 giờ. Để nguội, lọc dịch qua giấy lọc. Dịch lọc cho vào bình gạn, chiết với chloroform 3 lần, mỗi lần 5ml. Gộp dịch chiết chloroform. Đem cô tới khi thu được dịch chloroform dùng để chấm sắc ký.
Sơ đồ chiết xuất:
DL khô
DC toàn phần
Dịch thủy phân
Dịch CHCl3
Dịch chấm sắc ký
Methanol, ngâm lạnh trong 1 ngày, lọc
HCl 5%, đun sôi cách thủy trong 3h
Để nguội, lọc chiết 3 lần, mỗi lần 5 ml CHCl3
B.Tiến hành và kết quả
Sử dụng dịch chấm sắc ký, tiến hành thăm dò ở nhiều hệ dung môi khác nhau Hệ I: Chloroform - Ethyl acetat - Methanol (6:4:0,7)
Hệ II: Toluen - Ethyl acetat - Acid formic (6:2:0,5) Hệ III: Toluen - Ethy acetat (7:3)
Hệ IV: Chloroform - Methanol (9:1) Hệ V: Chloroform - Aceton (9:1)
Kết quả cho thấy hệ II, III. IV, V cho kết quả tách tốt nhất.
Kết quả hệ II: Toluen – Ethyl acetat – Acid formic (6:2:0,5)
Kết quả hệ III: Toluen – Ethyl acetat (7:3)
Hình 3.5. Hình ảnh sắc ký đồ dịch chiết củ Khoai nưa trong CHCl 3 triển khai hệ dung môi Toluen - Ethyl acetat - Acid formic (6:2:0,5)
IIa. Sắc ký đồ dịch chiết ở bước sóng 254nm
IIb. Sắc ký đồ dịch chiết ở bước sóng 366nm
IIc. Sắc ký đồ dịch chiết ở ánh sáng thường sau khi phun TT
Hình 3.6. Hình ảnh sắc ký đồ dịch chiết củ Khoai nưa trong CHCl 3 triển khai hệ dung môi Toluen - Ethyl acetat (7:3) IIIa. Sắc ký đồ dịch chiết ở bước sóng 254nm
IIIb. Sắc ký đồ dịch chiết ở bước sóng 366nm
IIIc. Sắc ký đồ dịch chiết ở ánh sáng thường sau khi phun TT
Kết quả hệ IV: Chloroform – Methanol (9:1)
Kết quả hệ V: Chloroform - Aceton (9:1)
Hình 3.7 Hình ảnh sắc ký đồ dịch chiết củ Khoai nưa trong CHCl 3
triển khai hệ dung môi Chloroform- Methanol (9:1) IVa. Sắc ký đồ dịch chiết ở bước sóng 254nm
IVb. Sắc ký đồ dịch chiết ở bước sóng 366nm
IVc. Sắc ký đồ dịch chiết ở ánh sáng thường sau khi phun TT
Hình 3.8. Hình ảnh sắc ký đồ dịch chiết củ Khoai nưa trong CHCl 3
triển khai hệ dung môi Chloroform - Aceton (9:1)
IVa. Sắc ký đồ dịch chiết ở bước sóng 254nm
IVb. Sắc ký đồ dịch chiết ở bước sóng 366nm
IVc. Sắc ký đồ dịch chiết ở ánh sáng thường sau khi phun TT
Hình ảnh sắc ký đồ được xử lý bởi phần mềm WinCATS có định dạng .cna được chuyển sang phần mềm VideoScan dưới định dạng .cpf, xử lý và phân tích thu được đồ thị, bảng biểu diễn kết quả sắc ký đồ. Kết quả được thể hiện ở hình dưới đây:
Hình 3.9. Hình ảnh sắc ký đồ dịch chiết củ Khoai nưa trong MeOH triển khai hệ Toluen - Ethy acetat - Acid formic (5:4:1) ở bước sóng 254 nm
Hình 3.10. Hình ảnh sắc ký đồ dịch chiết củ Khoai nưa trong MeOH khi triển khai ở hệ dung môi Toluen - Ethyl acetat - Acid formic (5:4:1) ở bước sóng 366 nm
Hình 3.11. Hình ảnh sắc ký đồ dịch chiết củ Khoai nưa trong MeOH khi triển khai ở hệ dung môi Toluen - Ethyl acetat - Acid formic (5:4:1) ở ánh sáng thường sau khi phun TT
Hình 3.12. Hình ảnh sắc ký đồ dịch chiết củ Khoai nưa trong CHCl3 khi triển khai ở hệ dung môi Toluen - Ethyl acetat (7:3) ở bước sóng 254
Hình 3.13. Hình ảnh sắc ký đồ dịch chiết củ Khoai nưa trong CHCl3 khi triển khai ở hệ dung môi Toluen - Ethyl acetat (7:3) ở bước sóng 366nm
Hình 3.14. Hình ảnh sắc ký đồ dịch chiết củ Khoai nưa trong CHCl3 khi triển khai ở hệ dung môi Toluen - Ethyl acetat ( 7:3) ở ánh sáng thường sau khi phun TT
BÀN LUẬN Về đặc điểm thực vật:
Ở Việt Nam có rất nhiều loài Khoai nưa, có loài thường mọc hoang nhưng có loài lại được trồng rất nhiều. Qua quan sát tại thực địa và so sánh với các tài liệu tham khảo về thực vật, sơ bộ xác định được cây Khoai nưa ở Hương Sơn, Hà Tĩnh là một trong những loài đó, nhưng do tại thời điểm nghiên cứu cây chưa ra hoa nên không thu được mẫu hoa, do đó chưa xác định được tên khoa học chính xác của loài nghiên cứu.
Các loài khác nhau có đặc điểm hình thái tương đối giống nhau nhưng giá trị sử dụng khác nhau. Các tài liệu hiện có chưa chỉ ra được rõ giá trị sử dụng của các loài đó. Trong nghiên cứu này, mặc dù tiến hành trong thời gian tương đối ngắn nhưng có thể kết luận loài nghiên cứu rất có tiềm năng. Giống trồng ngắn ngày, cho năng suất cao, có giá trị trong sử dụng như làm thực phẩm, làm thuốc. Vì vậy loài này cần được nhân giống để phát triển.
Củ Khoai nưa được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian có hiệu quả chữa bệnh cao với nhiều bệnh nhưng chưa được nghiên cứu nhiều, do đó những kết quả của đề tài này là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam về đặc điểm vi học của bột củ. Trong đó có những đặc điểm nổi bật như: có tinh bột đơn hay kép,các mảnh mô mềm mang tinh bột. Có nhiều tinh thể canxi oxalat hình kim đứng riêng lẻ hay tập trung thành đám. Sợi và các mảnh mạch rất dễ nhận biết.
Việc phân tích chỉ ra các đặc điểm hình thái, đặc điểm bột củ tạo cơ sở bước đầu cho việc định hướng, nhận biết, phân biệt các loài trong chi
Amorphophalus, từ đó tránh nhấm lẫn trong việc thu hái và sử dụng dược liệu.Vì vậy các kết quả nghiên cứu này có thể sử dụng được trong việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm củ cây Khoai nưa.
Về thành phần hóa học
Đã tiến hành xác định sơ bộ sự có mặt của các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học đặc trưng, cùng với những kết quả định tính bằng sắc ký lớp mỏng tạo cơ sở để định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo về thành phần hóa học.
Kết quả định tính cho thấy:
Trong củ Khoai nưa có chứa saponin, tanin, đường khử, polysaccharid, acid amin, acid hữu cơ, flavonoid, alcaloid, chất béo, steroid.
Củ cây Khoai nưa còn cho kết quả dương tính với các phản ứng FeCl3, NaOH, điều này cho thấy sự có mặt của các hợp chất chứa nhóm - OH phenol.
Sau khi tiến hành sắc ký lớp mỏng đã lựa chọn ra hệ dung môi tách rõ
• Với dịch chiết củ Khoai nưa trong methanol: Toluen – Ethyl acetat – Acid formic (5:4:1)
Kết quả phân tích cho thấy: Trước khi phun thuốc thử
Dưới ánh sáng tử ngoại (UV 254nm): quan sát được 14 vết, vết đậm nhất có Rf = 0,691.
Dưới ánh sáng tử ngoại (UV 366nm): quan sát được 12 vết, vết đậm nhất có Rf = 0,751.
Sau khi phun thuốc thử
Dưới ánh sáng thường: quan sát được 17 vết, vết đậm nhất có Rf = 0,760.
• Với dịch chiết củ Khoai nưa trong chloroform: Toluen – Ethyl acetat (7:3) Kết quả phân tích cho thấy:
Trước khi phun thuốc thử
Dưới ánh sáng tử ngoại (UV 254nm): quan sát được 12 vết, vết đậm nhất có Rf = 0,890.
Dưới ánh sáng tử ngoại (UV 366nm): quan sát được 9 vết, vết đậm nhất có Rf = 0,827.
Sau khi phun thuốc thử
Dưới ánh sáng thường: quan sát được 11 vết, vết đậm nhất có Rf= 0,673.
Dựa vào độ đậm nhạt, màu sắc, Rf của mỗi vết trên sắc ký đồ có thể định hướng cho việc phân lập các chất có hoạt tính sinh học.
Đề tài nghiên cứu về dược liệu củ Khoai nưa là một trong những đề tài mới, kết quả của đề tài chỉ là bước đầu, định hướng cho nhiều nghiên cứu sâu hơn về các loài thuộc chi Amorphophalus, cũng như phục vụ cho lĩnh vực kiểm nghiệm sau này.
Chương IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1. KẾT LUẬN
Về đặc điểm thực vật và hóa học
Đã mô tả được đặc điểm hình thái và đặc điểm vi học bột củ cây Khoai nưa.
Bằng các phản ứng định tính sơ bộ đã xác định trong củ Khoai nưa nghiên cứu có chứa saponin, tanin, đường khử, polysaccharid, acid amin, acid hữu cơ, flavonoid, alcaloid, chất béo, steroid.
Phân tích dịch chiết bằng sắc ký lớp mỏng trên nhiều hệ dung môi cho kết quả tách tốt ở các hệ:
Với dịch chiết methanol
Hệ I: Toluen - Ethyl acetat - Acid formic (5:4:1) Với dịch chiết chloroform:
Hệ II: Toluen - Ethyl acetat - Acid formic (6:2:0,5) Hệ III: Toluen - Ethyl acetat (7:3)
Hệ IV: Chloroform - Methanol (9:1) Hệ V: Chloroform - Aceton (9:1)
4.2. ĐỀ XUẤT
Từ những kết quả đạt được, đề tài có một số đề xuất sau:
- Trồng và thu hái mẫu cây có hoa để xác định chính xác tên khoa học của loài nghiên cứu.
- Nghiên cứu hình thức sử dụng của dược liệu củ Khoai nưa.
- Nghiên cứu tác dụng của quá trình chế biến với tính ngứa ở củ Khoai nưa.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt
1. Bộ môn Dược liệu (2007), Thực tập dược liệu phần kiểm nghiệm bằng phương pháp hiển vi, trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội.
2. Bộ môn Dược liệu (2007), Thực tập dược liệu phần kiểm nghiệm bằng phương pháp hóa học, trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội.
3. Bộ môn Thực vật (2004), Thực tập Thực vật và nhận biết cây thuốc, trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội.
4. Bộ Y tế (2007), Dược liệu học, Nxb Y học, tập I. 5. Bộ Y tế (2007), Dược liệu học, Nxb Y học, tập II. 6. Bộ Y tế (2007), Thực vật học, Nxb Y học, tr. 358, 359.
7. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nxb Y học, tr. 617. 8. Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, Nxb Khoa học và Kỹ
thuật, tập I, tr. 272.
9. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, Nxb Y học, Tp. Hồ Chí Minh.
10.Phạm Hoàng Hộ (200), Cây cỏ Việt Nam, Nxb Trẻ, quyển III, tr. 359. 11. Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học,
tr. 136.
12.Nguyễn Viết Thân (2013), Cây thuốc Việt Nam và những bài thuốc thường dùng, Nxb Thế giới, tập 3, tr. 46,48.
13.Nguyễn Viết Thân (2003), Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi, Nxb Khoa học và Kỹ thuật.
14. Ngô Văn Thu (1990), Hóa học Saponin, khoa Dược, trường Đại học Y
Dược thành phố Hồ Chí Minh.
15.Viện Dược liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, tập II, tr. 78.
Tài liệu tiếng anh
16. Chapman and Hall (1984) Harborne JB, Phytochemical methods, 3 rd ed. London 7.
17. Debsankar Das et al. (2009), “Isolation and characterization of a heteropolysaccharide from the corm of Amorphophalus campanulatus, Carbonhydrate Research”, 344, pp. 2581 – 2585.
18. Jayaraman Angayarkanni et al. (2010), “Antioxidant potential of
Amorphophalus paeoniifolius in realation to their phenolic content”,
Bharathiar University, 48, pp. 659 – 665.
19. Joshi SG (2000), Medicinal plants, Oxford and IHB Publishing, pp. 33. 20. Khan A, Rahman M, Islam MS (2008), “Anibacterial, antifungal and
cytotoxic activities of amblyone isolated from Amorphophalus
campanulatus”, Indian J Pharmarcol, 40, pp. 41- 4.
21. Li Heng, Zhu Guanghua, Peter C. Boyce, Niels Jacobsen (2010), Flora of
China, 23, pp. 1, 3, 80.
22. Malini Sen et al. (2009), “Effects of petroleum ether extract of
Amorphophalus paeoniifolius tuber on central nervous system in mice”,
Indian J Pharm Sci, 71, pp. 651- 5.
23. Pramod J Hurkadale et al. (2012), “Hepatoprotective activity of
Amorphophalus paeoniifolius tubers against paracetamol – induced liver
damage in rats”, Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, pp. 238. 24.Prathibha S, Nambisan B, Leelamma S (1995), Plant foods for Human
Nutrition, 48, pp. 247.
25. Puthuparampil Nazarudeen Ansil et al. (2011), “Prptective effect of induced oxidative stress in rats”, Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, pp. 870 -8.
26.Vu Ngoc Linh et al. (2007), Ethnobotany Research & Applications, 5, pp. 259 – 272.
27.Yadu Nandan Dey et al. (2011), “Synergistic depressant activity of
Amorphophalus paeoniifolius in Swiss albino mice”, J Pharmacol
Pharmacother, 2, pp. 121 – 3.
28.Yusuf M, Chowdhury JU, Yahab MA, Begum J (1994), Medical plants
of Bangladesh, Bangladesh 7 BCSIR Laboratories, pp. 20.
Tài liệu internet
29.http://vi.wikipedia.org/wiki/H%E1%BB%8D_R%C3%A1y
30.http://www.aroid.org/genera/speciespage.php?genus=amorphophallus&sp ecies=paeoniifolius