3.2.1. Định tính sơ bộ các nhóm chất có trong củ Khoai nưa bằng phản ứng hóa học hóa học
3.2.1.1. Định tính Glycosid tim
Cân 5g bột dược liệu cho vào một bình nón dung tích 250ml. Thêm 100ml ethanol 25% rồi ngâm trong 24 giờ. Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ dung tích 100ml. Thêm vài ml chì acetat 30%, khuấy đều. Để lắng, lọc dịch vào một cốc
có mỏ dung tích 100ml. Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào một ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat. Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm tiếp chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat.
Chuyển dịch lọc vào một bình gạn dung tích 100ml. Lắc dịch chiết với hỗn hợp chloroform – ethanol (4 : 1), lắc 2 lần, mỗi lần 8ml. Gạn lớp dịch chiết chloroform trong ethanol vào một cốc có mỏ đã được sấy khô. Gộp các dịch chiết chloroform và loại nước bằng natrisulfat khan.
Chia đều dịch chiết vào 4 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô. Đem cô cách thủy đến khô. Cắn thu được đem tiến hành làm các phản ứng định tính.
Phản ứng của khung steroid: Phản ứng Liebermann – Burchardt
- Tiến hành: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn. Nghiêng ống 450. Thêm từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống.
- Kết quả:
Ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng không xuất hiện một vòng màu tím đỏ (Phản ứng âm tính).
Phản ứng của vòng lacton 5 cạnh
• Phản ứng Baljet
- Tiến hành: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha (1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%). So sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn glycosid tim.
- Kết quả:
• Phản ứng Legal
- Tiến hành: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ 1 giọt thuốc thử Natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%. Lắc đều sẽ xuất hiện màu đỏ cam. So sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn glycosid tim.
- Kết quả:
Ống thử có màu đỏ cam không đậm hơn ống chứng (Phản ứng âm tính). Phản ứng của phần đường 2,6 – desoxy: Phản ứng Keller – Kiliani
- Tiến hành: Cho vào ống nghiệm chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong acid acetic. Lắc đều. Nghiêng ống 450. Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống.
- Kết quả:
Ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng không xuất hiện vòng màu đỏ tím (Phản ứng âm tính).
Kết luận sơ bộ:Trong củ Khoai nưa không chứa Glycosid tim.
3.2.1.2. Định tính Saponin
Quan sát hiện tượng tạo bọt
- Tiến hành: Cho 1g bột dược liệu vào một ống nghiệm lớn. Thêm 10ml nước. Lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 5 phút. Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt.
- Kết quả:
Cột bọt bền sau khi ngừng lắc 15 phút (Phản ứng dương tính). Phản ứng Salkowski
- Tiến hành: Cho 2g bột dược liệu vào ống nghiệm lớn. Thêm vào 20ml ethanol 90%. Đun sôi cách thủy. Lọc lấy dịch lọc cho vào một ống nghiệm khác,
để nghiêng ống nghiệm 450, cho từ từ theo thành ống nghiệm 1 – 2 giọt acid sulfuric đặc.
- Kết quả:
Xuất hiện vòng màu nâu đỏ ở mặt phân cách giữa 2 lớp chất lỏng (Phản ứng dương tính).
Kết luận sơ bộ:Trong củ Khoai nưa có chứa Saponin.
3.2.1.3. Định tính Anthranoid
Phản ứng Borntraeger
• Định tính Anthranoid dạng tự do
- Tiến hành: Cho 2g bột dược liệu vào ống nghiệm lớn (10ml). Thêm 5ml nước cất. Đun trực tiếp với nguồn nhiệt cho đến sôi. Lọc dịch chiết còn nóng qua một lớp bông mỏng vào bình gạn dung tích 50ml. Để nguội dịch lọc. Thêm 5ml cloroform. Lắc nhẹ. Gạn bỏ lớp nước. Giữ lớp cloroform để làm phản ứng.
Lấy 1ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ.
- Kết quả:
Lớp nước không có màu đỏ sim (Phản ứng âm tính). • Định tính Anthranoid dạng toàn phần
- Tiến hành: Cho 2g bột dược liệu vào ống nghiệm lớn. Thêm 5ml dung dịch acid sulfuric 1N. Đun trực tiếp trên nguồn nhiệt đến sôi. Tiếp tục lọc và chiết như ở trên.
Lấy 1ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1ml dung dịch NaOH 10%. Lắc nhẹ. Phản ứng dương tính nếu lớp nước có màu đỏ sim.
- Kết quả:
Vi thăng hoa
- Tiến hành: Trải bột dược liệu thành lớp mỏng trong một nắp chai bằng nhôm, đốt nhẹ trên đèn cồn để loại nước. Sau đó đậy lên nắp nhôm một miếng lam kính, bên trên có miếng bông đã thấm nước, tiếp tục đun nóng trong khoảng 5 - 10 phút. Lấy lam kính ra để nguội, soi kính hiển vi.
- Kết quả:
Không xuất hiện tinh thể trên lam kính (Phản ứng âm tính).
Kết luận sơ bộ: Trong củ Khoai nưa không chứa Anthranoid.
3.2.1.4. Định tính Tanin
- Tiến hành: Cho 2g bột dược liệu vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nước cất. Đun sôi trực tiếp 5 phút. Lọc qua giấy lọc gấp nếp. Lấy dịch lọc chia làm 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml, đem làm các phản ứng định tính.
Phản ứng với protein
Ống 1: Thêm vào 1 giọt dung dịch gelatin 1% mới pha.
- Kết quả:
Ống nghiệm xuất hiện kết tủa bông trắng (Phản ứng dương tính). Phản ứng với ion kim loại nặng
Ống 2: Thêm vào vài giọt FeCl3 5%. - Kết quả:
Ống nghiệm xuất hiện kết tủa xanh đen (Phản ứng dương tính).
Ống 3: Thêm vào vài giọt chì acetat 10%. - Kết quả:
Ống nghiệm xuất hiện kết tủa bông (Phản ứng dương tính).
Kết luận sơ bộ: Trong củ Khoai nưa có chứa Tanin.
3.2.1.5. Định tính đường khử
- Tiến hành: Cân khoảng 2g bột dược liệu cho vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nước cất, đun sôi vài phút. Lọc qua giấy lọc vào 1 ống nghiệm khác. Thêm 1ml
dung dịch thuốc thử Felling A và 1ml dung dịch Felling B. Đun cách thủy sôi vài phút.
- Kết quả:
Ống nghiệm xuất hiện kết tủa đỏ gạch (Phản ứng dương tính).
Kết luận sơ bộ: Trong củ Khoai nưa có chứa đường khử
3.2.1.6. Định tính Polysaccharid
- Tiến hành: Lấy 2g bột dược liệu cho vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nước cất. Đun sôi cách thủy vài phút. Lọc lấy dịch. Cho vào 2 ống nghiệm:
Ống 1: 4ml dịch chiết + 5 giọt thuốc thử Lugol Ống 2: 4ml nước cất + 5 giọt thuốc thử Lugol - Kết quả:
Màu ống 1 đậm hơn màu ống 2 (Phản ứng dương tính).
Kết luận sơ bộ: Trong củ Khoai nưa có chứa Polysaccharid.
3.2.1.7. Định tính Acid amin
- Tiến hành: Lấy 2g bột dược liệu cho vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nước cất, đun sôi vài phút. Lọc qua giấy lọc vào 1 ống nghiệm khác. Thêm vài giọt thuốc thử Ninhydrin 3%. Đun cách thủy sôi vài phút.
- Kết quả: Ống nghiệm xuất hiện màu xanh (Phản ứng dương tính).
Kết luận sơ bộ:Trong củ Khoai nưa có Acid amin
3.2.1.8. Định tính Acid hữu cơ
- Tiến hành: Cho 2g bột dược liệu vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nước cất. Đun sôi trực tiếp vài phút trên ngọn lửa đèn cồn. Để nguội và lọc. Thêm vào dịch lọc một ít bột Na2CO3.
- Kết quả:
Ống nghiệm xuất hiện bọt khí CO2bay lên (Phản ứng dương tính).
3.2.1.9. Định tính Flavonoid
Lấy 2g bột dược liệu rồi cho vào bình nón dung tích 50ml. Thêm 20ml ethanol 90%. Đun cách thủy sôi trong vài phút. Lọc nóng. Dịch lọc đem tiến hành các phản ứng định tính.
Phản ứng Cyanidin (Phản ứng Shinoda)
- Tiến hành: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết. Thêm một ít bột magnesi kim loại (khoảng 10mg). Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3 - 5 giọt). Để yên một vài phút.
- Kết quả:
Dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ (Phản ứng dương tính). Phản ứng với kiềm
• Bước 1: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ. Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% sẽ xuất hiện tủa vàng. Thêm 1ml nước cất.
- Kết quả:
Xuất hiện tủa vàng (Phản ứng dương tính).
• Bước 2: Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc. Hơ khô rồi để lên miệng lọ amoniac đặc đã được mở nút. Nhỏ một giọt khác lên giấy lọc để so sánh. - Kết quả:
Màu vàng của vết dịch chiết tăng lên (Phản ứng dương tính). Phản ứng với FeCl3
- Tiến hành: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ. Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%.
- Kết quả:
Xuất hiện kết tủa xanh đậm (Phản ứng dương tính). Phản ứng diazo hóa
- Tiến hành: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch kiềm (dung dịch NaOH, Na2CO3), thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha,
lắc đều, đun nóng trên nồi cách thủy trong vài phút. - Kết quả:
Xuất hiện màu đỏ (Phản ứng dương tính).
Kết luận sơ bộ: Trong củ Khoai nưa có chứa Flavonoid.
3.2.1.10. Định tính Coumarin
Lấy 2g bột dược liệu rồi cho vào bình nón dung tích 50ml. Thêm 20ml ethanol 90%. Đun cách thủy sôi trong vài phút. Lọc nóng. Dịch lọc đem tiến hành các phản ứng định tính.
Phản ứng mở đóng vòng lacton
Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết: Ống 1 thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%. Ống 2 để nguyên.
- Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi. Để nguội rồi quan sát: Ống 1 có tủa vàng. Ống 2 trong.
- Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2ml nước cất. Lắc đều rồi quan sát: Ống 1 trong. Ống 2 đục.
- Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, quan sát: Ống 1 đục. Ống 2 trong. (Phản ứng dương tính). Phản ứng diazo hóa
- Tiến hành: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ. Thêm vào 2ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thủy đến sôi rồi để nguội. Nhỏ vào giọt thuốc thử diazo.
- Kết quả:
Xuất hiện màu đỏ (Phản ứng dương tính).
Quan sát huỳnh quang của các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoại khi tác dụng với dung dịch kiềm (Phản ứng chuyển từ đồng phân cis sang đồng phân trans dưới tác dụng của tia tử ngoại)
- Tiến hành: Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy thấm. Nhỏ tiếp vài giọt dung dịch NaOH 5%. Sấy nhẹ. Che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng một miếng kim loại (chìa khóa, đồng xu,…) rồi chiếu tia tử ngoại trong một vài phút. Bỏ miếng kim loại ra, quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại.
- Kết quả:
Phần không bị che có huỳnh quang không sáng hơn phần bị che (Phản ứng âm tính).
Kết luận sơ bộ: Trong củ Khoai nưa không chứa Coumarin.
3.2.1.11. Định tính Alcaloid
Cân 5g bột dược liệu, cho vào bình nón dung tích 50ml,thấm ẩm bằng dung dịch ammoniac đặc. Đậy kín để khoảng 30 phút. Cho 15ml chloroform lắc đều trong 1h. Lọc lấy dịch chiết cho vào bình gạn. Sau đó lắc kỹ 2 lần, mỗi lần với 10ml dung dịch H2SO4 1N.Để phân lớp,gạn lấy dịch chiết acid,chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1ml. Nhỏ vào từng ống nghiệm 2-3 giọt lần lượt các thuốc thử sau:
Ống 1: thuốc thử Mayer. - Kết quả:
Xuất hiện kết tủa trắng (Phản ứng dương tính). Ống 2: thuốc thử Bouchardat.
- Kết quả:
Xuất hiện kết tủa nâu (Phản ứng dương tính). Ống 3: thuốc thử Dragendorff.
- Kết quả:
Xuất hiện kết tủa đỏ cam (Phản ứng dương tính).
3.2.1.12. Định tính chất béo, Steroid, Caroten
Lấy 5g bột dược liệu vào bình nón dung tích 50ml, đổ ngập ether dầu hỏa, bọc kín, ngâm 24 giờ. Lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc. Chia dịch lọc làm 3 phần để tiến hành định tính:
Định tính chất béo
- Tiến hành: Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên mảnh giấy trắng, sấy nhẹ cho bay hết hơi dung môi.
- Kết quả:
Có để lại vết mờ trên giấy (Phản ứng dương tính). Định tính Steroid
- Tiến hành: Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, cô cách thủy đến cắn. Thêm vào ống nghiệm khoảng 1ml anhydride acetic, lắc kỹ cho tan hết cắn. Để nghiêm ống nghiệm 450, thêm từ từ H2SO4đặc theo thành ống nghiệm.
- Kết quả:
Mặt phân cách giữa 2 lớp chất lỏng có vòng tím đỏ, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá (Phản ứng dương tính).
Định tính Caroten
- Tiến hành: Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, cô cách thủy đến cắn, nhỏ vài giọt H2SO4đặc vào cắn.
- Kết quả:
Không xuất hiện màu xanh lá (Phản ứng âm tính).
Kết luận sơ bộ: Trong củ Khoai nưa có chứa chất béo và Steroid, không chứa Caroten.
BẢNG KẾT QUẢ PHẢN ỨNG ĐỊNH TÍNH
Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất trong củ Khoai nưa
STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận 1 Glycosid tim P. Ư Liebermann P. Ư Legal P. Ư Baljet + - - Không có 2 Saponin H.T tạo bọt P.Ư Salkowski ++ ++ Có 3 Anthranoid P. Ư Borntrager Vi thăng hoa - - Không có 4 Tanin P. Ư với Gelatin 1% P. Ư với Chì acetat 10% P. Ư với FeCl3 5% ++ + + Có
5 Đường khử P. Ư với TT Fehling A,B + Có
6 Polysaccharid P. Ư với TT Lugol ++ Có
7 Acid amin P. Ư với TT Ninhydrin 3% Có
8 Acid hữu cơ Na2CO3 + Có
9 Flavonoid P. Ư Cyanidin P. Ư với kiềm P. Ư với FeCl3 P. Ư với TT Diazo ++ + ++ + Có 10 Coumarin P. Ư đóng mở vòng Lacton P. Ư với TT Diazo Huỳnh quang + + - Không có 11 Alcaloid P. Ư với TT Mayer P. Ư với TT Dragendorff P. Ư với TT Bouchardat + + + + Có 12 Chất béo Giấy lọc + Có 13 Steroid P. Ư Liebermann + Có
Chú thích: (-): Phản ứng âm tính, (+): Phản ứng dương tính, (++): Phản ứng dương tính rõ