P. multocida và S. suis phân lập đƣợc
3.3.2.1. Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được
Sau khi kiểm tra một số đặc tính sinh vật, hóa học đặc trưng chúng tôi đã tiến hành định serotype huyết thanh học của 48 chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae
phân lập được bằng phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch (AGID) với kháng huyết thanh chuẩn của 15 serotype khác nhau do Nhật Bản chế tạo. Các bước tiến hành phản ứng AGID như đã mô tả ở phần nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.10.
Bảng 3.10: Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn
A. pleuropneumoniae phân lập đƣợc bằng phản ứng AGID
Loại lợn
Số kiểm
tra
(chủng)
Serotype 2 Serotype 5a Serotype 5b
Số chủng (+) Tỷ lệ (%) Số chủng (+) Tỷ lệ (%) Số chủng (+) Tỷ lệ (%) Lợn con (≤ 1,5 tháng tuổi) 6 5 83,33 1 16,67 0 0
Lợn sau cai sữa
(>1,5-3 tháng tuổi) 20 14 70,00 5 25,00 1 5,00
Lợn thịt
(>3-6 tháng tuổi) 13 9 69,23 3 23,08 1 7,69
Lợn nái và hậu bị 9 7 77,78 1 11,11 1 11,11
Kết quả ở bảng 3.10 cho thấy: Trong tổng số 48 chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm của lợn nuôi tại các địa phương của tỉnh Bắc Giang có 35/48 chủng thuộc serotype 2, chiếm tỷ lệ 72,92%; 10/48 chủng thuộc serotype 5a, chiếm tỷ lệ 20,83% và 3/48 chủng thuộc serotype 5b, chiếm tỷ lệ 6,25%. Như vậy, có thể thấy serotype 2 của vi khuẩn A. pleuropneumoniae là serotype phổ biến lưu hành ở các đàn lợn nuôi tại các địa phương của tỉnh Bắc Giang, sau đó là serotype 5. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng tương đồng với kết quả của một số tác giả trong nước như Trịnh Quang Hiệp và cs (2004) [14] và Cù Hữu Phú và cs (2005) [27] cho thấy trong các serotype của vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được từ lợn mắc bệnh viêm đường hô hấp tại một số địa phương Miền Bắc Việt Nam thì serotype 2 luôn chiếm ưu thế; nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hằng (2010) [12] xác định serotype của 63 chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được ở lợn mắc bệnh viêm phổi - màng phổi ở một số tỉnh Miền Bắc có 54/63 chủng thuộc serotype 2 (85,71%) và 9/63 chủng thuộc serotype 5 (14,28%); nghiên cứu của Tiêu Quang An và Nguyễn Hữu Nam (2011) [1] cũng cho thấy trong 19 chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được ở lợn mắc PRRS tại huyện Văn Lâm, tỉnh Hưng Yên khi xác định serotype có 14/19 chủng thuộc serotype 2 (73,68%) và 5/63 chủng thuộc serotype 5 (26,32%).
Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae
phân lập được thể hiện ở hình 3.8.
20.83% 6.25%
72.92%
serotype 2 serotype 5a serotype 5b
Hình 3.8: Tỷ lệ lưu hành serotype của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được
3.3.2.2. Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được bằng phản ứng PCR
Chúng tôi sử dụng phản ứng PCR để xác định các serotype giáp mô A, B, D của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được theo quy trình đã được chuẩn hóa của bộ môn Vi trùng, Viện Thú y Quốc gia (Đỗ Ngọc Thúy và cs, 2007) [42]. Giáp mô là yếu tố độc lực và đóng vai trò quan trọng trong quá trình gây bệnh của vi khuẩn P. multocida. Vi khuẩn P. multocida được phân làm 5 serotype giáp mô là A, B, D, E và F tùy thuộc vào cấu trúc của Polysaccharide bề mặt. Trong đó các serotype gây bệnh ở lợn được xác định là A, B và D (Cù Hữu Phú, 2011) [28]. Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR để xác định serotype giáp mô vi khuẩn P. multocida là CAPA-F và CAPA-R dùng để xác định serotype A có kích cỡ sản phẩm là 1044 bp; CAPB-F và CAPB-R để xác định serotype B có sản phẩm là 760 bp; CAPD-F và CAPD-R để xác định serotype D có sản phẩm là 657 bp. Các bước tiến hành phản ứng PCR như đã mô tả ở phần nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu.
Kết quả chúng tôi thu được trình bày ở bảng 3.11.
Bảng 3.11: Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn P. multocida
phân lập đƣợc bằng phản ứng PCR Loại lợn Số kiểm tra (chủng)
Serotype A Serotype B Serotype D
Số chủng (+) Tỷ lệ (%) Số chủng (+) Tỷ lệ (%) Số chủng (+) Tỷ lệ (%) Lợn con (≤ 1,5 tháng tuổi) 5 4 80,00 0 0 1 20,00
Lợn sau cai sữa
(>1,5-3 tháng tuổi) 17 11 64,71 0 0 6 35,29
Lợn thịt
(>3-6 tháng tuổi) 14 10 71,43 0 0 4 28,57
Lợn nái và hậu bị 6 6 100,0 0 0 0 0
Kết quả bảng 3.11 cho thấy: Trong 42 chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được có 31 chủng thuộc serotype A, chiếm tỷ lệ 73,81% và có 11 chủng thuộc serotype D, chiếm tỷ lệ 26,19%. Kết quả này cũng tương đồng với nghiên cứu của một số tác giả trong và ngoài nước như Kang-Hee O và cs (1990) [108] khi phân lập vi khuẩn ở 155 phổi của lợn thịt cho thấy các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được có 60,4% các chủng thuộc serotype A; 18,6% thuộc serotype D và 21,0% chưa xác định được serotype. Tại Nhật Bản, trong số 116 chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được từ phổi lợn có bệnh tích nhục hóa, áp xe phổi và viêm màng phổi có 81,9% thuộc serotype A; 18,1% thuộc serotype D (Iwanmatsu và Sawada, 1988) [96]. Ở Việt Nam, Cù Hữu Phú (2011) [28] xác định serotype của 35 chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được ở lợn mắc bệnh tại các ổ dịch PRRS, kết quả có 24 chủng thuộc serotype A, chiếm tỷ lệ 68,57% và 11 chủng thuộc serotype D, chiếm tỷ lệ 31,43%.
Như vậy, 42 chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được đều thuộc serotype A và serotype D, kết quả này cho thấy vai trò gây viêm phổi ở lợn dương tính với PRRSV của vi khuẩn P. multocida tại tỉnh Bắc Giang chủ yếu thuộc hai serotype A và serotype D, đặc biệt là serotype A.
Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn P. multocida được thể hiện ở hình 3.9 và ảnh hình 3.10.
26.19
7.81 Serotype A
Serotype D
Hình 3.9: Tỷ lệ lưu hành serotype của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được
- M: Thang chuẩn 1000 bp - Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 9, 11là P. multocida serotype A (sản phẩm 1044bp) - Giếng 7: Đ/C dương P. multocida serotype A - Giếng 10, 12, 13 là P. multocida serotype D (sản phẩm 760 bp) - Giếng 14: Đ/C dương P. multocida serotype D - Giếng 6, 8: Đ/C âm Hình 3.10: Kết quả phản ứng PCR xác định serotype của vi khuẩn P. multocida
3.3.2.3. Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được
Các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được chúng tôi xác định serotype gây bệnh thường gặp ở lợn (serotype 1, 2, 7, 9) bằng phản ứng PCR. Phản ứng này cho phép nhận ra sự khác nhau của 4 loại gen cps mã hoá sản sinh thành phần polysaccharide của giáp mô vi khuẩn, tương đương với các serotype 1; 2; 7 và 9. Trường hợp các chủng không thuộc 1 trong 4 serotype trên thì lại được tiếp tục xác định serotype với 30 loại kháng huyết thanh còn lại bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính.
Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được ở lợn dương tính với PRRSV tại Bắc Giangđược trình bày ở bảng 3.12.
Qua bảng 3.12 cho thấy: Trong 135 chủng vi khuẩn S. suis phân lập được đã xác định serotype số chủng thuộc serotype 2 là 76/135 chủng, chiếm tỷ lệ cao nhất (56,29%); tiếp đến là serotype 9 là 23/135 chủng (17,04%); serotype 7 là 7/135 chủng (5,18%); các serotype 21 và 29 có tỷ lệ tương đương là 3/135 chủng (2,22%) và 23 chủng (17,04%) chưa xác định được serotype.
1 2 3 4 5 6 7 M 8 9 10 11 12 13 14 M 1044 bp 1044 bp 657 bp 1000bp 1000bp
Bảng 3.12: Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập đƣợc Loại lợn Số chủng VK Serotype 2 7 9 15 21 22, 27a 25 28 29 30 29, 33b 31 30, 31, 32c 31, 33d 34 KXĐ Lợn con (≤ 1,5 tháng tuổi) 25 14 5 1 5
Lợn sau cai sữa
(>1,5-3 tháng tuổi) 46 29 2 9 6 Lợn thịt (>3-6 tháng tuổi) 43 21 4 7 2 1 8 Lợn nái và hậu bị 21 12 1 2 1 1 4 Cộng 135 76 7 23 0 3 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 23 Tỷ lệ (%) 56,29 5,18 17,04 2,22 2,22 17,04
Ghi chú : - *: a, b, c, d: có hiện tượng ngưng kết chéo giữa các nhóm huyết thanh - VK: Vi khuẩn
- KXĐ: Không xác định
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương đồng với kết quả của một số tác giả như Đỗ Ngọc Thúy và cs (2009) [43] khi xác định serotype trong 211 chủng vi khuẩn S. suis phân lập được từ lợn tại các tỉnh Miền Bắc Việt Nam, số chủng thuộc serotype 2 chiếm tỷ lệ cao nhất 14/211 chủng (6,64%); serotype 9 có 10/211 chủng (4,74%); các serotype 9, 31, 32 đều có 7/211 chủng (3,32); các serotype 7, serotype 17 và serotype 21 có tỷ lệ tương đương là 3/211; serotype 8 có 2/211. Cù Hữu Phú (2011) [28] khi xác định serotype của 12 chủng vi khuẩn
S. suis phân lập được ở lợn dương tính với PRRSV cho thấy số chủng thuộc serotype 2 chiếm chủ yếu 7/12 chủng (58,33%). Các chủng vi khuẩn S. suis
thuộc serotype 2 đã được xác định là serotype thường gặp nhất gây bệnh cho lợn và người ở hầu hết các nước trên thế giới (Vansconcelos và cs, 1994 [149]; Lun và cs, 2007 [116]). Ở Anh, bệnh do vi khuẩn S. suis serotype 2 gây ra ở lợn sau cai sữa với biểu hiện chủ yếu là bại huyết và viêm não (Windsor và Elliott, 1975) [157]. Ở Hà lan, vi khuẩn S. suis serotype 2 gây bệnh ở lợn với viêm phổi (42%), viêm não (18%), viêm nội tâm mạc (18%) và viêm đa thanh mạc (10%) (Vecht và cs, 1985) [150]. Như vậy, lợn mắc PRRS ở Bắc Giang có S. suis serotype 2 lưu hành với tỷ lệ khá cao. Người khi tiếp súc với lợn bệnh nghi mắc PRRS cần mang bảo hộ nghiêm ngặt, trong tiêu dùng không nên ăn thịt lợn nhiễm PRRS vì sẽ có nguy cơ mắc bệnh liên cầu khuẩn cao.
Kết quả xác định serotype được thể hiện ở hình 3.11 và hình 3.12.
serotype 2 serotype 7 serotype 9 serotype 21 serotype 29 Không xác định
Hình 3.11: Tỷ lệ lưu hành serotype của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được
- M: 100 bp marker
- Giếng 1 và 7: serotype 7 - Giếng 2, 3, 4: serotype 2 - Giếng 5, 6: serotype 9
Hình 3.12: Kết quả phản ứng PCR xác định serotype của vi khuẩn S. suis