2.3.1. Phƣơng pháp nghiên cứu dịch tễ
Sử dụng phương pháp nghiên cứu dịch tễ học mô tả (Descriptive study), dịch tế học phân tích (Analytic study) và dịch tễ học thực nghiệm của Nguyễn Như Thanh (2011) [37], Nguyễn Văn Thiện (1997) [41].
Phương pháp nghiên cứu cắt ngang tìm căn nguyên của bệnh, so sánh tần suất bệnh giữa các nhóm khác nhau. Các cá thể trong cùng nhóm cũng như các yếu tố nguy cơ và các thông tin khác đều được tiến hành trong cùng một thời gian, thời điểm nghiên cứu.
2.3.1.1. Chọn mẫu điều tra
- Chọn mẫu theo phương pháp ngẫu nhiên, mẫu chùm nhiều bậc: số bậc trong mẫu chùm, phụ thuộc vào số bậc đơn vị mẫu trung gian;
- Trực tiếp quan sát để phát hiện lợn mắc PRRS. Những lợn có triệu chứng điển hình mắc PRRS được mổ khám mà chưa sử dụng thuốc kháng sinh điều trị thì được sử dụng lấy mẫu để phân lập vi khuẩn và virus gây bệnh;
2.3.1.2. Phương pháp xác định nguy cơ tương đối (Relative Risk - RR)
Để so sánh nguy cơ lợn bị mắc PRRS theo lứa tuổi và mùa vụ chúng tôi dùng chỉ tiêu nguy cơ tương đối (RR) theo Nguyễn Như Thanh (2011) [37].
(chi tiết được trình bày ở phụ lục I)
2.3.1.3. Các tỷ lệ đo lường trong dịch tễ, công thức tính hiệu lực tiêm phòng
của vaccine và công thức tínhkhi bình phương (2
).
(chi tiết được trình bày ở phụ lục I)
2.3.2. Phƣơng pháp lấy mẫu
Dùng dao mổ cắt phần phổi có bệnh tích viêm phổi và cuống họng của những lợn có triệu chứng điển hình mắc PRRS được mổ khám; các lợn dùng để lấy mẫu đều chưa được sử dụng thuốc kháng sinh điều trị. Các mẫu bệnh phẩm được bảo quản trong túi nylon vô trùng ở điều kiện 4o
C và nhanh chóng được đưa về phòng thí nghiệm, Viện Thú y Quốc gia.
2.3.3. Phƣơng pháp xác định mẫu bệnh phẩm lợn dƣơng tính với PRRSV và phân lậpvi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida, S.suis
Quy trình phân lập A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis trình bày ở hình 1, hình 2 và hình 3 trong phụ lục II; xác định mẫu bệnh phẩm lợn dương tính với PRRSV được thực hiện tại Bộ môn Virus, Viện Thú y Quốc gia (chi tiết trình bày ở phụ lục III); quy trình phân lập vi khuẩn ở mẫu bệnh phẩm lợn dương tính với PRRSV được chuẩn hóa theo quy trình nghiên cứu thường qui của Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y Quốc gia.
2.3.4. Phƣơng pháp xác định đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis
Xác định một số đặc tính sinh vật, hóa học của A. pleuropneumoniae, P. multocida và S.suis được thực hiện theo các quy trình thường qui trong phòng thí nghiệm của Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y Quốc gia (Cù Hữu Phú, 2011) [28].
2.3.5. Phƣơng pháp xác định serotype của vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis
Xác định serotype của vi khuẩn A. pleuropneumoniae bằng phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch (AGID); P. multocida và S. suis được thực hiện bằng các phản ứng ngưng kết và phản ứng PCR đã được chuẩn hóa của Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y Quốc gia (Cù Hữu Phú, 2011) [28].
2.3.5.1. Phương pháp xác định serotype của vi khuẩnA. pleuropneumoniae
Phương pháp xác định serotype của A. pleuropneumoniae được thực hiện tại Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y bằng phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch (Agargel Immuno Diffuse - AGID) như sau:
- Chuẩn bị kháng nguyên: Vi khuẩn nuôi cấy qua đêm trên môi trường thạch TSA (1 - 3% YE). Rửa mặt thạch bằng 1ml PBS 0.3% formalin. Xử lý nhiệt canh trùng thu được và ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Lấy phần nước trong giữ ở nhiệt độ 4o
C.
- Chuẩn bị thạch: Noble agar: 0,5 g
PBS - Sodium azide: 50 ml
Trộn đều và tiệt trùng bằng vi sóng. Cho 7 ml thạch vào mỗi đĩa có đường kính 5 cm. Sau khi thạch đông, tiến hành đục lỗ bằng dụng cụ đục lỗ (gồm 1 lỗ trung tâm và 6 lỗ xung quanh). Đường kính mỗi lỗ theo tiêu chuẩn đạt 4 mm, khoảng cách giữa các lỗ và với lỗ trung tâm cách nhau 6 mm.
- Cách tiến hành: Cho 8µl kháng nguyên cần xác định vào lỗ giữa của đĩa thạch và 8µl kháng huyết thanh không pha loãng vào các lỗ xung quanh. Đĩa thạch kiểm tra giữ ở điều kiện nhiệt độ phòng và đọc kết quả sau 24 - 48 giờ. Kết quả được ghi nhận khi xuất hiện vạch ngưng kết ở khoảng cách giữa hai lỗ kháng nguyên và kháng thể.
2.3.5.2. Phản ứng PCR xác định serotype của vi khuẩn P. multocida
Giáp mô là yếu tố độc lực và đóng vai trò quan trọng trong quá trình gây bệnh của P. multocida. Vi khuẩn P. multocida được phân làm 5 serotype giáp mô là A, B, D, E và F tùy thuộc vào cấu trúc của polysaccharide bề mặt. Trong đó các serotype gây bệnh ở lợn được xác định là A, B và D (Cù Hữu Phú, 2011) [28]. Các serotype giáp mô A, B, D của vi khuẩn P. multocida được xác định dựa trên phản ứng PCR phức hợp (Multiplex PCR), tức là sử dụng nhiều loại mồi khác nhau trong cùng một phản ứng, gồm các cặp mồi: CAPA-F và CAPA- R để xác định serotype A, CAPB-F và CAPB-R để xác định serotype B, CAPD- F và CAPD-R để xác định serotype D. Trình tự các cặp mồi và kích cỡ sản phẩm được trình bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1: Trình tự các cặp mồi dùng để xác định serotype A, B, D của vi khuẩn P. multocida
Serotype Ký hiệu
mồi Trình tự mồi
Sản phẩm
(bp) A CAPA-F 5’-TGC CAA AAT CGC AGT GAG-3’
1044 CAPA-R 5’-TTC CCA TCA TTG TCA GTG-3’
B CAPB-F 5’-CAT TTA TCC AAG CTC CAC C-3’
760 CAPB-R 5’-GCC CGA GAG TTT CAA TCC-3’
D CAPD-F 5’-TTA CAA AAG AAA GAC TAG GAG CCC-3’ 657 CAPD-R 5’-CAT CTA CCC ACT CAA CCA TAT CAG-3’
Quy trình thực hiện phản ứng PCR như sau:
- Các chủng vi khuẩn P. multocida chuẩn serotype A, serotype B và serotype D dùng làm đối chứng dương do Viện Thú y Quốc gia, Viện Thú y Nhật Bản (Tsukuba) cung cấp.
- Các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được ở lợn dương tính với virus gây PRRS tại tỉnh Bắc Giang.
- ADN mẫu của chủng vi khuẩn P. multocida cần xác định được lấy trực tiếp từ khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn đã được nuôi cấy trên môi trường thạch máu ở điều kiện 37oC/24 giờ.
- Phản ứng PCR được thực hiện với tổng thể tích là 25 µl, bao gồm các thành phần: 1 µl của mỗi loại mồi (3,2 µM/µl); 5 µl PCR buffer 5x [(750 mM Tris-HCl (pH 8,8); 200 mM (NH4)2SO4; 0,1% (v/v) Tween 20) (ABgene); 2 mM MgCl2; 200 µM của mỗi loại dNTP]; 0,05 µl Taq DNA Polymerase (5 units/ µl) (ABgene) và nước cất vừa đủ 25 µl.
- Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR gồm các giai đoạn: Tiền biến tính ở 94oC/3 phút và 30 chu kỳ nhiệt (biến tính ở 94oC/1 phút, ủ bắt cặp mồi ở 55o
C/1 phút, tổng hợp ở 72oC/1 phút) và kéo dài cuối cùng ở 72o
C/7 phút.
- Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di trên thạch agarose 2% trong dung dịch 1xTAE với hiệu điện thế 100V/30 phút, sau đó nhuộm với Ethidium bromide trong 15 - 20 phút.
- Đọc kết quả bằng hệ thống Gel Doc 2000. Các vạch ADN được đánh giá bằng cách so sánh với ADN ladder chuẩn và mẫu đối chứng dương.
2.3.5.3. Phản ứng PCR xác định serotype của vi khuẩn S. suis
Phản ứng PCR dùng để xác định vi khuẩn S. suis và một số serotype gây bệnh thông thường của chúng được thực hiện theo quy trình đã được chuẩn hoá của Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y Quốc gia. Có thể tóm tắt phản ứng như sau:
- ADN đích: Là một lượng nhỏ khuẩn lạc của chủng vi khuẩn cần xác định đã được nuôi cấy trên đĩa thạch máu cừu, để tủ ấm 37o
C (5% CO2) sau 24 giờ và được xác định các đặc tính sinh hoá thông thường.
- Mồi của phản ứng: Các cặp mồi dùng xác định các serotype 1; 2; 7 và 9 của vi khuẩn S. suis được lựa chọn dựa vào chuỗi gen mã hoá quá trình sinh tổng hợp thành phần polysaccharide của giáp mô (cps); gồm 4 cặp mồi là cps 1J-F và cps 1J-R để xác định serotype 1; cps 2J-F và cps 2J-R để xác định serotype 2; cps 7H-F và cps 7H-R để xác định serotype 7; cps 9H-F và cps 9H-R để xác định serotype 9. Trình tự các cặp mồi và kích cỡ sản phẩm tương ứng của phản ứng PCR tạo ra được trình bày tại bảng 2.2.
Bảng 2.2: Trình tự các mồi dùng để xác định các gen mã hoá các cps Gen
đích Ký hiệu primers Chuỗi primers (5 ’ - 3 ’) Kích cỡ sản phẩm (bp)
cps 1 cps1J-F cps1J-R
5'-TGG CTC TGT AGA TGA TTC TGC T -3'
5'-TGA TAC GTC AAA ATC CTC ACC A-3' 637 bp cps 2 cps2J-F
cps2J-R
5'-TTT GTC GGG AGG GTT ACT TG-3'
5'-TTT GGA AGC GAT TCA TCT CC -3' 498 bp cps 7 cps7H-F
cps7H-R
5'-AAT GCC CTC GTG GAA TAC AG-3'
5'-TCC TGA CAC CAG GAC ACG TA-3' 379 bp cps 9 cps9H-F
cps9H-R
5'-GGG ATG ATT GCT CGA CAG AT-3'
5'-CCG AAG TAT CTG GGC TAC TGA-3' 303 bp
- Thành phần các chất và chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR dùng để xác định serotype của vi khuẩn S. suis giống như trong phản ứng dùng để xác định các gen mã hoá các yếu tố độc lực của vi khuẩn này.
- Thành phần các chất trong phản ứng: Phản ứng MP-PCR được thực hiện với tổng thể tích là 25 µl và được trình bày chi tiết trong bảng 2.3.
Bảng 2.3: Thành phần các chất trong phản ứng PCR dùng để xác định serotype và một số gen mã hoá các yếu tố độc lực của vi khuẩn S. suis
Thành phần Thể tích (µl) Nồng độ
Mồi xuôi 1+1+1+1 3,2 µM/ µl
Mồi ngược 1+1+1+1 3,2 µM/ µl
Dung dich đệm AMP x 5 gồm:
+ 750 mM Tris - HCl (pH=8) + 200 mM (NH4)2SO4 + 0,1% (v/v) Tween 20 + dNTPs + 2 mM MgCl2 5 - Taq - polymerase 0,05 500 UI Nước khử ion 12 - Tổng cộng 25 -
- Các chu kỳ nhiệt của phản ứng được thể hiện ở bảng 2.4.
Bảng 2.4: Các chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR dùng để xác định serotype và một số gen mã hoá các yếu tố độc lực của vi khuẩn S. suis
Các giai đoạn của phản ứng Nhiệt độ
(oC)
Thời gian
(phút)
Số chu kỳ nhiệt
Giai đoạn tiền biến tính 94 5 1
Giai đoạn biến tính Giai đoạn bắt cặp Giai đoạn tổng hợp 94 53 72 1 1 1,5 35
Giai đoạn kéo dài 72 7 1
- Đọc kết quả của phản ứng:
+ Sản phẩm thu được là 637 bp: Vi khuẩn S. suis serotype 1. + Sản phẩm thu được là 498 bp: Vi khuẩn S. suis serotype 2. + Sản phẩm thu được là 379 bp: Vi khuẩn S.suis serotype 7. + Sản phẩm thu được là 303 bp: Vi khuẩn S.suis serotype 9.
2.3.6. Phƣơng pháp tính LD50 củavi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và
S. suis trên chuột bạch
Cách tiến hành: Canh trùng A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis
bồi dưỡng ở 37oC trong 24 giờ và được pha loãng hệ số 10, mỗi nồng độ tiêm cho 5 chuột bạch với liều 0,5 ml canh trùng/con, tính số chuột sống và số chuột chết theo phương pháp cộng dồn.
Công thức tính LD50 theo Reed & Muench (1938):
50
a-50
LgLD =LgA+ ×d
a-b
Trong đó: A: Nồng độ pha loãng gây chết sát trên 50% chuột. a: Tỷ lệ chuột chết do liều A gây ra (%).
b: Tỷ lệ chuột chết do liều B gây ra (%) (cộng dồn) với B là nồng độ pha loãng gây chết sát dưới 50% chuột.
2.3.7. Phƣơng pháp xác định số lƣợng vi khuẩn
Mẫu canh khuẩn cần xác định được lấy vô trùng, sau đó pha loãng canh khuẩn với nước muối sinh lý vô trùng thành các độ pha loãng khác nhau từ 10-1 đến 10-8. Dùng 3 độ pha loãng 10-6
, 10-7, 10-8 mỗi độ pha loãng cấy trên 3 đĩa thạch TSA (1-3% YE), mỗi đĩa nhỏ 0,1ml, dàn đều trên mặt thạch. Sau 18 giờ nuôi cấy ở tủ ấm 37oC có 5% CO2, tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc mọc ở các đĩa thạch.
Số lượng vi khuẩn trong 1ml canh khuẩn được tính theo công thức dưới đây với đơn vị tính là CFU: X = a x N x 10
Trong đó:
X: Số lượng tế bào vi khuẩn trung bình trong 1ml canh khuẩn. N: Hệ số pha loãng.
a: Số khuẩn lạc trung bình có trong 0,1ml canh khuẩn pha loãng.
2.3.8. Phƣơng pháp xác định độc lực trên động vật thí nghiệm
Xác định độc lực của các chủng A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis phân lập được trên động vật thí nghiệm theo phương pháp thường qui của Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y Quốc gia (Cù Hữu Phú, 2011) [28].
Canh trùng A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis được chuẩn bị bằng cách nuôi các vi khuẩn này vào môi trường TYE, bồi dưỡng ở 37oC trong 24 giờ (5% CO2). Canh trùng nuôi cấy mỗi chủng A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis được tiêm cho 2 chuột bạch, mỗi chuột thí nghiệm được tiêm 0,5 ml canh trùng vào xoang phúc mạc. Theo dõi số chuột sống và chết trong thời gian 7 ngày. Chuột chết tiến hành mổ khám kiểm tra bệnh tích, lấy máu tim, nuôi cấy và phân lập lại vi khuẩn.
2.3.9. Phƣơng pháp xác định mức độ mẫn cảm với một số kháng sinh của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae,P. multocida và S. suis phân lập đƣợc
Cách tiến hành:
- Chuẩn bị môi trường thạch đĩa Muller Hiton;
- Vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis nuôi cấy trong môi trường thạch TSA qua đêm. Các khuẩn lạc của các vi khuẩn được tạo huyền phù
trong nước muối sinh lý 0,9% để được độ đục tương đương ống McFarland 1 (3 x 108 CFU/ml). Dùng tăm bông vô trùng, tẩm dung dịch đã pha loãng và dàn đều lên thạch đĩa Muller Hinton;
- Dùng máy tự động đặt các khoanh giấy tẩm kháng sinh của hãng Oxioid (Anh) lên mặt đĩa thạch;
- Bồi dưỡng đĩa thạch ở 37o
C/18 - 24 giờ (5% CO2). Đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn và so sánh với bảng chuẩn để đánh giá mức độ mẫn cảm hay kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn kiểm tra (bảng 2.5).
Bảng 2.5: Bảng đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại kháng sinh (NCCLS - 2002) [125]
TT Loại
kháng sinh Hàm lƣợng Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm)
Mạnh Trung bình Kháng thuốc 1 Ceftiofur 30 µg ≥ 21 18 - 20 17 2 Ampicillin 10 µg ≥ 22 19 - 21 ≤ 18 3 Amoxicillin 20 µg ≥ 20 - ≤ 19 4 Neomycin 30 µg ≥ 17 13 - 16 ≤ 12 5 Amikacin 30 µg ≥ 17 15 - 16 ≤ 14 6 Gentamicin 10 µg ≥ 19 - ≤ 15 7 Lincomycin 15 µg ≥ 15 13 - 14 ≤ 12 8 Colistin 10 µg ≥ 15 13 - 14 ≤ 12 9 Tetracyclin 30 µg ≥ 29 26 - 28 ≤ 25 10 Erythromycin 15 µg ≥ 21 16 - 20 ≤ 15 11 Florfenicol 30 µg ≥ 23 - ≤ 20
2.3.10. Xây dựng phác đồ điều trị lợn nghi mắc viêm phổi và PRRS
Căn cứ vào kết quả xác định tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis phân lập được, chúng tôi lựa chọn 3 loại thuốc kháng sinh mẫn cảm cao, đang được phép lưu hành tại Việt Nam. Kết hợp với các loại thuốc điều trị triệu chứng, trợ sức, trợ lực, xây dựng lấy 3 phác đồ và tiến hành thử nghiệm điều trị. Để đánh giá được hiệu quả một cách khách quan, các phác đồ được thực hiện có sự đồng đều tương đối về các tiêu chí cơ bản sau:
- Số lợn mắc bệnh ở cùng một địa phương được phân ra ngẫu nhiên làm 3 lô tương ứng với 3 phác đồ điều trị;
- Số lần và số ngày điều trị được dùng đồng đều trong các phác đồ;
- Đánh giá hiệu quả của các phác đồ điều trị căn cứ vào sự ổn định dần về hiện tượng ho, thở, tình trạng ăn, uống … sau 10 ngày kể từ khi dùng thuốc.
2.3.11. Phƣơng pháp chế tạo Autovaccine thử nghiệm từ các chủng vi khuẩn
A. pleuropneumoniae,P. multocida và S. suis phân lập đƣợc
Công nghệ chế tạo vaccine vô hoạt được sử dụng để chế Autovaccine thử nghiệm là công nghệ nuôi cấy tĩnh có bổ trợ keo phèn. Chế Autovaccine thử