- Chuẩn bị mẫu thử: mẫu thử được pha vào dung môi thích hợp (dicloromethan) với nồng độ cho các mẫu như sau: QH-1: 200 µg/mL, QH-2: 210 µg/mL, QH-3: 180 µg/mL, curcumin: 170 µg/mL. Các khoanh giấy lọc vô trùng và đã được sấy khô được tẩm 3 lần với dung dịch mẫu thử, sau mỗi lần tẩm các khoanh giấy lọc có chứa mẫu thử đều được sấy ở nhiệt độ < 60oC đến khô hết dung môi.
- Chuẩn bị môi trường và cấy VSV kiểm định:
Vi khuẩn kiểm định được cấy vào môi trường canh thang, rồi nuôi cấy cho phát triển trong tủ ấm 37oC trong thời gian 18-24 giờ đến nồng độ 107 tế bào/mL (kiểm tra bằng pha loãng và dãy dịch chuẩn). Nấm mốc được nuôi trên môi trường Sabouraud thạch nghiêng ở 28°C trong 5 ngày, rổi sử dụng dung dịch xà phòng 0,2% vô trùng lấy đính bào tử với nồng độ 105 bào tử/mL. Môi trường thạch thường vô trùng (tiệt trùng 118oC/30 phút) được làm lạnh về 45-50oC và được cấy giống VSV kiểm định vào với tỷ lệ 2,5 mL/100 mL. Lắc tròn để VSV kiểm định phân tán đều trong môi trường thạch thường, rồi đổ vào đĩa petri vô trùng với thể tích 20 mL/đĩa và để cho thạch đông lại.
- Đặt mẫu thử và chứng: khoanh giấy lọc đã được tẩm chất thử cũng như các khoanh tẩm kháng sinh chứng và xử lý như trên được đặt lên bề mặt môi trường thạch thường (hoặc Sabouraud) chứa VSV kiểm định theo sơ đồ định sẵn.
- Ủ các đĩa petri có mẫu thử được đặt như trên trong tủ ấm ở 37°C trong 18- 24h, rồi sau đó lấy ra đọc kết quả, đo đường kính vòng vô khuẩn và vô nấm nếu có (thước kẹp Panmer độ chính xác 0,02mm).
3.3.2. Kết quả thực nghiệm
Kết quả thực nghiệm được trình bày trong Bảng 3.16
Bảng 3. 16. Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn, chống nấm Vi sinh vật QH1 QH2 QH3 Cur MC Gr(+) B. cereus D - - 12,03 8,62 16,2 s - - 0,74 0,53 0,15 B. subtilis D - - 11,85 - 15,87 s - - 0,90 - 0,81 B. pumilus D - - - - - s - - - - - S. aureus D - - 11,63 - 17,06 s - - 0,36 - 0,45 S. lutea D - - 12,2 - 11,64 s - - 0,60 - 0,53 Gr(-) E. coli D - - 11,73 7,32 12,38 s - - 0,83 0,19 0,17 P. mirabilis D - - 12,96 - 15,90 s - - 0,91 - 0,36 S. typhi D - 8,85 14,03 - 14 s - 1,25 0,49 - 0,65 S. flexneri D - - - - - s - - - - - Vi nấm Asp.1 D - - - - 13,22 s - - - - 0,19 Asp.2 D - - - - 13,10 s - - - - 0,3 Pae.3 D - - - - - s - - - - - Pen.1 D - - - - 13,72 s - - - - 0,95 3.4. BÀN LUẬN 3.4.1. Về tổng hợp hóa học
Trong quá trình thực hiện phản ứng gặp một số khó khăn là:
- Acid cloroacetic gây bỏng da, kích ứng vòm họng, cần có các biện pháp bảo hộ khi tiếp xúc. Mặt khác, acid cloroacetic rất dễ hút ẩm dẫn tới hiệu suất phản ứng, do đó các thao tác cần được thực hiện nhanh, giảm tối thiểu lượng ẩm đưa vào phản ứng.
- Phản ứng tổng hợp methyl cloroacetat và ethyl cloroacetat là những phản ứng ester hóa với xúc tác là acid sulfuric đặc. Đây là phản ứng thuận nghịch, để cải thiện hiệu suất phản ứng, có thể áp dụng một số biện pháp dưới đây:
Sử dụng dư lượng alcol và cất loại liên tục nước khỏi khối phản ứng.
Thêm toluen để tạo hỗn hợp sôi đẳng phí ba cấu tử (nước-alcol-toluen) có nhiệt độ sôi thấp để cất loại nước khỏi khối phản ứng. ngưng tụ hỗn hợp hơi, tách loại pha nước, pha hữu cơ chứa một phần alcol được dẫn trở lại khối phản ứng.
b. Phản ứng alkyl hóa curcumin
Các phản ứng alkyl hóa curcumin đều không chọn lọc. Quan sát trên SKLM thấy sản phẩm tạo ra có thể là curcumin gắn thêm từ 1 đến 4 nhóm alkyl ở các vị trí: -OH và C-4. Điều này tạo ra khó khăn trong quá trình alkyl hóa chọn lọc ở vị trí xác định cũng như quá trình tinh chế sản phẩm và nâng cao hiệu suất phản ứng. Việc tinh chế tốn nhiều loại dung môi hữu cơ đắt tiền và độc hại.
Về phản ứng tổng hợp dẫn chất methoxycarbonylmethyl-curcumin và dẫn chất ethoxycarbonylmethyl-curcumin
- Phản ứng được tiến hành ở điều kiện tương tự với tài liệu [10]. Theo tài liệu, các tác giả sử dụng tác nhân là methyl cloroacetat thu được sản phẩm là mono - và di-O-methoxycarbonylmethyl-curcumin trong khi chúng tôi thu được duy nhất sản phẩm và sản phẩm này có thêm 2 nhóm methoxycarbonylmethyl (ethoxycarbonylmethyl) ở vị trí C-4. Điều này là do C-4 thuộc cấu trúc ß-diceton nên hai hydro ở vị trí này trở lên linh động và dễ dàng bị alkyl hóa trong môi trường có base xúc tác. Quan sát trên SKLM có thể thấy phản ứng xảy ra ở vị trí –OH phenol trước. Chính vì thế, tỉ lệ mol các chất phản ứng, tốc độ đưa tác nhân alkyl
hóa, lượng base (kali carbonat), thời gian phản ứng là các yếu tố quan trọng, quyết định sản phẩm alkyl hóa được tạo ra. Để thu được duy nhất sản phẩm 4,4- dimethoxycarbonylmethyl-O,O’-dimethoxycarbonylmethyl-curcumin (hoặc 4,4- diethoxycarbonylmethyl-O,O’-diethoxycarbonylmethyl-curcumin), chúng tôi tiến hành phản ứng tỉ lệ mol tác nhân alkyl cloroacetat : curcumin là 45-50 : 1, thời gian phản ứng là 14h.
- Phản ứng sử dụng các alkyl cloroacetat là những chất độc hại, có thể gây ăn mòn da, tổn thương mắt và tích lũy trong cơ thể. Do đó khi thực hiện phản ứng cần chú ý vấn đề an toàn và xử lý lượng còn dư sau phản ứng.
Về phản ứng tổng hợp dẫn chất (2-hydroxyethyl)-curcumin
- Phản ứng được thực hiện theo tài liệu [12]. Dựa trên SKLM có thể thấy sản phẩm của phản ứng bao gồm mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin và di-O-(2- hydroxyethyl)-curcumin giống như tài liệu đã công bố. Hiệu suất của phản ứng là 16,98%, không cao so với tài liệu [12] (32%) . Tuy nhiên so với tài liệu, chúng tôi đã cải thiện được:
Phương pháp tinh chế: tinh chế bằng dung môi thay cho sắc kí cột.
Tác nhân phản ứng: thay bằng 2-cloroethanol rẻ tiền, dễ kiếm hơn 2-bromoethanol.
- Hiệu suất phản ứng O-alkyl hóa curcumin với 2-cloroethanol không cao. Một số nghiên cứu cho thấy hiệu suất của phản ứng này được cải thiện đáng kể khi ở trong môi trường kiềm và có sự trợ giúp của vi sóng, đến 76,4% [29].
3.4.2. Về xác định cấu trúc
3.4.2.1. Về cấu trúc của QH-1
Phổ hồng ngoại (IR): trên phổ hồng ngoại của sản phẩm xuất hiện các dải
hấp thụ đặc trưng cho từng nhóm chức, cụ thể như sau:
- Dải hấp thụ đặc trưng cho các liên kết C-H (không no) xuất hiện với số sóng là 3010 cm-1.
- Dải hấp thụ đặc trưng các liên kết C-H (no) xuất hiện với số sóng 2951 và 2866 cm-1.
- Dải hấp thụ đặc trưng cho chức C=O ester xuất hiện với số sóng 1741 cm-1. - Dải hấp thụ đặc trưng cho chức C=O ceton xuất hiện với số sóng là 1665 cm-1. - Dải hấp thụ đặc trưng liên kết C=C alken xuất hiện với số sóng là 1587 và 1509 cm-1.
- Dải hấp thụ đặc trưng cho liên kết –C–O xuất hiện với số sóng là 1259 và 1189 cm-1.
Phổ khối lượng (ESI-MS, MeOH) cho pic phân tử [M+Na]+ (m/z = 679,2);
[M+2H2O+Na]+ (m/z = 715,2) và [M-H]- (m/z = 655,2), phù hợp với khối lượng phân tử QH-1 (M = 656,64), ứng với CTPT C33H36O14.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) của QH-1 trong aceton-d6
có các tín hiệu cho phép nhận biết số lượng proton và vị trí của chúng trên phân tử, cụ thể như sau:
- Tín hiệu singlet tại δ = 3,42 ppm đặc trưng cho 4 hydro của 2 nhóm methylen (H- 11’, H-11’’).
- Tín hiệu singlet tại δ = 3,58 và 3,72 ppm đặc trưng cho 12 hydro của 4 nhóm methyl ester lần lượt tại các vị trí (H-13’, H-13’’) và (H-9’, H-9’’).
- Tín hiệu singlet tại δ = 3,84 ppm đặc trưng cho 6 proton của 2 nhóm methoxy gắn với nhân thơm (H-10’, H-10’’).
- Tín hiệu singlet tại δ = 4,78 ppm đặc trưng cho 4 proton của 2 nhóm methylen (H- 7’, H-7’’).
- Tại vùng tín hiệu của nhân thơm quan sát thấy tương tác spin-spin meta và ortho
của các proton trên mỗi nhân thơm. Chẳng hạn, H-5’ tương tác ortho với H-6’ nên cho tín hiệu doublet (d) với hằng số J = 8,0 Hz. Trong khi đó, H-6’ có thêm tương tác meta với H-2’ ngoài tương tác ortho với H-5’ nên có tín hiệu dd với J1=2,0 Hz,
J2= 8,0. H-2’ có tương tác meta với hằng số J = 1,5 Hz.
- Các hydro-alken trong phân tử QH-1 tồn tại ở dạng trans. Điều này thể hiện ở hằng số tương tác spin-spin giữa các cặp: H-1 và H-2; H-6 và H-7 là 15,5 Hz.
Kết luận: các kết quả phân tích phổ IR, MS, 1H-NMR phù hợp với công thức cấu tạo đã dự kiến, cho phép chúng tôi khẳng định sản phẩm QH-1 là phẩm 4,4- dimethoxycarbonylmethyl-O,O’-dimethoxycarbonylmethyl-curcumin.
3.4.2.2. Về cấu trúc của QH-2
Phổ hồng ngoại (IR): trên phổ hồng ngoại của sản phẩm xuất hiện các dải
hấp thụ đặc trưng cho từng nhóm chức hoàn toàn tương tự như của sản phẩm QH-1
Phổ khối lượng (ESI-MS, MeOH) cho pic phân tử [M+Na]+ (m/z = 735,17),
phù hợp với khối lượng phân tử QH-2 (M = 712,75), ứng với CTPT C37H44O14.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) của QH-2 trong CDCl3 có
các tín hiệu cho phép nhận biết số lượng và vị trí proton, cụ thể như sau:
- Tín hiệu triplet tại δ = 1,14 ppm đặc trưng cho 6 hydro của 2 nhóm methyl (H-15’, H-15’’) và tại δ = 1,20 ppm đặc trưng cho 6 proton của 2 nhóm methyl (H-10’, H- 10’’).
- Các nhóm methylen cho tín hiệu singlet tại δ = 3,33 ppm đặc trưng cho 4 proton của 2 nhóm methylen (H-12’, H-12’’) và
- Tín hiệu singlet tại δ = 3,83 ppm đặc trưng cho 6 proton của 2 nhóm methoxy gắn với nhân thơm (H-11’, H-11’’).
- Tín hiệu quartet tại δ = 4,04 ppm đặc trưng cho 4 proton của 2 nhóm methylen (H- 14’, H-14’’) và tại δ = 4,17 ppm đặc trưng cho 4 proton của 2 nhóm methylen (H- 9’, H-9’’).
- Tín hiệu tại vùng thơm cho thấy có 6H trên 2 nhân thơm, trong đó H-5’ tương tác
ortho với H-6’ nên cho tín hiệu doublet (d) với hằng số J = 8,0 Hz tại 6,67 ppm. H- 6’ chỉ tương tác ortho với H-5’, hầu như không có tương tác meta với H-2’ nên có tín hiệu d với hằng số tương tác J = 8,5 Hz. Đồng thời cũng không quan sát thấy tương tác meta của H-2’ với H-6’ nên cho tín hiệu singlet tại 6,95 ppm.
- Các hydro-alken trong phân tử QH-2 tồn tại ở dạng trans. Điều này thể hiện ở hằng số tương tác spin-spin giữa các cặp: H-1 và H-2; H-6 và H-7 là 15,5 Hz.
Kết luận: các kết quả phân tích phổ IR, MS, 1H-NMR phù hợp với công thức cấu tạo đã dự kiến, cho phép chúng tôi khẳng định sản phẩm QH-2 là phẩm 4,4- diethoxycarbonylmethyl-O,O’-diethoxycarbonylmethyl-curcumin.
3.4.2.3. Về cấu trúc của QH-3
Phổ hồng ngoại (IR): trên phổ hồng ngoại của sản phẩm xuất hiện các dải
hấp thụ đặc trưng cho từng nhóm chức, tương tự như QH-1 và có thêm các dải hấp thụ sau:
- Dải hấp thụ đặc trưng cho nhóm -OH alcol xuất hiện với cường độ tương đối mạnh, với số sóng là 3455 cm-1.
- Dải hấp thụ đặc trưng cho nhóm chức β-diceton (O=C-CH2-C=O) xuất hiện với số sóng là 1624 cm-1. Số sóng của các nhóm chức –C=O này giảm mạnh so với nhóm ceton thông thường (có ῡmax = 1715 cm-1) là do phân tử QH-3 tồn tại ở dạng hỗ biến ceton-enol, tạo ra liên kết hydro nội phân tử (xem Hình 3.1)
R 3 4 O 5 R' O H R 3 4 O 5 R' O H R 3 4 O 5 R' O H
ceton enol enol
Hình 3. 1. Dạng hỗ biến ceton - enol của di-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin
- Các liên kết C=C alken cho các dải hấp thụ đặc trưng tại số sóng 1584 và 1512 cm-1.
- Các liên kết C-O cho các dải hấp thụ đặc trưng tại số sóng 1264, 1130 cm-1.
Phổ khối lượng (MS)
Trên phổ đồ xuất hiện pic phân tử [M+Na]+ (m/z = 479,29), phù hợp với khối lượng phân tử QH-3 (M= 456,49), ứng với CTPT C25H28O8.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR)
Phổ đồ của sản phẩm QH-3 có các tín hiệu cho phép nhận biết số lượng proton và vị trí của chúng trong phân tử, cụ thể như sau:
- Tín hiệu triplet tại δ = 3,90 ppm thuộc về 4 hydro ở vị trí H-8’, H-8’’. Không tính được hằng số J của tín hiệu do tín hiệu này xen phủ với tín hiệu của H-10’, H-10’’, H-4.
- Tín hiệu tại δ = 3,91 ppm gồm 2 singlet xen phủ khít, thuộc về 6 hydro của 2 nhóm methoxy (H-10’, H-10’’) và 2 hydro tại vị trí H-4.
- Tín hiệu triplet tại δ = 4,10 ppm đặc trưng cho 4 proton ở vị trí H-7’, H-7’’. - Tín hiệu doublet tại δ = 7,00 ppm đặc trưng cho 2 proton ở vị trí C5’, C5’’ của nhân thơm. Tín hiệu multilet tại δ = 7,22 ppm đặc trưng cho 4 proton trên nhân thơm ở các vị trí C2’, C2’’, C6’, C6’’.
- Các hydro-alken trong phân tử QH-3 tồn tại ở dạng trans. Điều này thể hiện ở hằng số tương tác spin-spin giữa các cặp: H-1 và H-2; H-6 và H-7 là 15,0 Hz. - Không quan sát thấy tín hiệu của 2 proton alcol (H-9’, H-9’’) trên phổ là do quá trình trao đổi hydro của chất với dung môi (MeOD). Tín hiệu của MeOH xuất hiện tại 3,30 ppm.
Kết luận: các kết quả phân tích phổ IR, MS, 1H-NMR phù hợp với công thức cấu tạo đã dự kiến, cho phép chúng tôi khẳng định sản phẩm QH-3 là di-O-(2- hydroxyethyl)-curcumin.
3.4.3. Về thử hoạt tính sinh học
- Mẫu QH-1 ở nồng độ thử không có tác dụng đối với các vi khuẩn kiểm định. - Mẫu QH-2 ở nồng độ thử chỉ có tác dụng đối với 1/9 vi kiểm định.
- Mẫu QH-3 ở nồng độ thử có tác dụng đối với 7/9 vi khuẩn kiểm định. - Curcumin ở nồng độ thử có tác dụng đối với 2/9 vi khuẩn kiểm định.
Như vậy trong 3 chất tổng hợp được từ curcumin, thì QH-1 không có hoạt tính kháng khuẩn ở nồng độ 200 µg/mL, QH-2 ở nồng độ 210 µg/mL có hoạt tính kháng khuẩn yếu hơn curcumin nguyên liệu ở nồng độ 170 µg/mL. Đặc biệt QH-3 có hoạt tính kháng khuẩn khá tốt (có tác dụng với 7/9 vi khuẩn kiểm định ở nồng độ 180 µg/mL), tốt hơn so với curcumin ở nồng độ 170 µg/mL.
Cả 3 sản phẩm tổng hợp QH-1, QH-2, QH-3 và curcumin đều không có tác dụng chống nấm trên nồng độ được thử.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
- Đã tổng hợp được 3 dẫn chất alkyl hóa của curcumin bao gồm: 4,4- dimethoxycarbonylmethyl-O,O’-dimethoxycarbonylmethyl-curcumin, 4,4- diethoxycarbonylmethyl-O,O’-diethoxycarbonylmethyl-curcumin và di-O- (2-hydroxyethyl)-curcumin. Xác định cấu trúc của các sản phẩm bằng phương pháp phân tích các phổ IR, MS, 1H-NMR.
- Đã thử tác dụng kháng khuẩn, chống nấm của cả 3 sản phẩm tổng hợp được trong đó di-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin có tác dụng kháng khuẩn tốt (có tác dụng với 7/9 vi khuẩn kiểm định).
2. Kiến nghị
Từ kết quả nghiên cứu bán tổng hợp các dẫn chất alkyl curcumin đã thực hiện,