Sau khi tổng hợp các chất, chúng tôi tiến hành kiểm tra độ tinh khiết của các sản phẩm bằng SKLM trên bản mỏng silicagel F254:
Các chất 2a-2d được hòa tan trong ethanol để chấm sắc ký. Pha động để chạy sắc ký là hệ dung môi n-butanol: acid acetic: nước = 9:2:2,5. Các chất 3a-3d được hoà tan trong methanol. Pha động để chạy sắc ký
là hệ dung môi methanol: n-hexan = 7:3.
Sau khi chạy sắc ký, soi bản mỏng dưới đèn tử ngoại bước sóng 254 nm, các chất thử đều cho một vết gọn, rõ, không có vết phụ.
Đồng thời, chúng tôi tiến hành đo nhiệt độ nóng chảy của các chất tổng hợp được. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy cho thấy các chất đều có điểm chảy rõ ràng.
Bảng 3.3: Kết quả kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy STT Chất Rf T0 nc (0C) n-butanol: acid acetic: nước
(9:2:2,5) methanol: n-hexan (7:3) 1 2a 0,74 - 160-162 2 2b 0,73 - 168-170 3 2c 0,71 - 162-164 4 2d 0,75 - 166-170 5 3a - 0,6 170-174 6 3b - 0,47 167-170 7 3c - 0,54 176-178 8 3d - 0,63 180-185 3.3. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC
Chúng tôi đã tiến hành đo phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ proton (1H-NMR) để xác định cấu trúc các chất 3a-d.
3.3.1. Phổ hồng ngoại (IR)
Qua nghiên cứu phổ của các chất, chúng tôi nhận biết được các dải hấp thụ đặc trưng của các nhóm chức và liên kiết điển hình của các chất 3a-d
Phổ đồ IR được ghi ở phụ lục 1.1 – 1.4. Kết quả phân tích số liệu phổ hồng ngoại được ghi trong bảng 3.2.
Bảng 3.2: Số liệu phổ IR (cm-1) của các chất 3a-d
Tên chất
ⱱmax của các chất (cm-1)
ⱱO-H
phenol ⱱCH ⱱC=O amid ⱱC=O acid ⱱC-S
3a - 2930 1722 1633 618
3b 3464 2929 1714 1635 614
3c - 2976 1732 1638 605
3d - 2935 1731 1637 598
Các chất 3a - 3d đều có:
Dải hấp thụ nằm trong khoảng từ 2929 – 2976 cm-1 đặc trưng cho nhóm CH của các chất.
Dải hấp thụ nằm trong khoảng 1714 – 1732 cm-1 đặc trưng cho nhóm C=O của amid.
Dải hấp thụ nằm trong khoảng 1633 - 1638 cm-1 đặc trưng cho nhóm C=O của acid.
Dải hấp thụ nằm trong khoảng 594 – 618 cm-1 đặc trưng cho nhóm C-S Chất 3a có dải hấp phụ 3464 cm-1 đặc trưng cho nhóm –OH trong công thức phân tử.
a: R1 = R2 = H
b: R1 = OCH3, R2 = OH
c: R1 = H, R2 = Cl
3.3.2. Phổ khối lượng (MS)
Bảng 3.3: Số liệu phân tích phổ khối lượng của các chất 3a-d Chất Công thức phân tử Khối lượng phân tử m/z Chú thích 3a C15H19NO4S 309,38 332,0 [M+Na]+ 3b C17H23NO6S 355,41 354,0 [M-H]+ 3c C15H18ClNO4S 343,82 342,0 [M-H]+ 3d C16H21NO5S 339,41 338,0 [M-H]+
Trên phổ đồ của 4 chất đều xuất hiện pic phân tử [M-H]+ hoặc [M+Na]+
có số khối đúng bằng khối lượng phân tử M hoặc [M+Na] như dự kiến.
3.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR)
Các phổ đồ được ghi ở các phụ lục 3.1 – 3.4. Số liệu phân tích phổ 1H- NMR của các chất 3a-d được trình bày ở trong bảng 3.4.
Bảng 3.4: Số liệu phân tích phổ 1H-NMR của các chất 3a-d Chất Công thức cấu tạo 1H-NMR (DMSO-d6) , δ(ppm)
3a δ 1,07-1,36 (9H, s, 3CH3); 3,16 (1H, d, C5-Ha); 3,44 (1H, d, C5-Hb); 4,56 (1H, d, C4-H); 5,94 (1H, s, C2-H); 7,25-7,32 (3H, m, C3’-H + C4’-H + C5’-H); 7,62 (2H, s, C2’-H + C6’-H ) ppm 3b δ 1,05-1,35 (3H, s, 3CH3); 3,09-3,17 (1H, dd, C5-Ha); 3,38-3,44 (1H, dd, C5-Hb); 3,72 (3H, s, O-CH3); 4,53-4,69 (1H, d, C4-H); 5,86-6,03 (1H, s, C2-H); 6,66 (1H, d, C5’-H); 6,9 (1H, s, C2’-H);7,38-7,46 (1H, d, C6’-H); 8,88 (1H,s, OH) ppm
Chất Công thức cấu tạo 1H-NMR (DMSO-d6) , δ(ppm) 3c δ 1,07-1,35 (9H, s, 3CH3); 3,07-3,17 (2H, m, C5-2H); 4,57-4,71 (1H, d, C4-H); 5,96- 6,11 (1H, s, C2-H); 7,35 (1H, d, C2’-H); 7,39 (1H, d, C6’-H); 7,65 (2H, s, C3’-H + C5’-H) ppm 3d δ 1,08-1,35 (9H, s, 3CH3); 3,06-3,17 (2H, d, C5-H2); 3,45 (3H, s, OCH3); 4,56 (1H, d, C4-H); 5,96 (1H,s, C2-H); 7,38 (2H, d, C3’-H + C5’-H); 7,66 (2H, s, C2’-H + C5’- H) ppm
Ghi chú: δ: Độ dịch chuyển hóa học được lấy theo giá trị trung bình (ppm); s: singlet; d: doublet; dd: doublet doublet, m: multiplet.
Nhận xét:
Phổ đồ của 4 chất đều có các pic cho phép nhận dạng proton và số lượng proton thông qua các số liệu về độ dịch chuyển hóa học δ và cường độ của các pic, cụ thể như sau:
δ = 1,05 - 1,36 ppm đặc trưng cho 9 proton của -C(CH3)3 của 4 chất 3a-3d. δ = 3,06 - 3,44 ppm đặc trưng cho 2 proton ở vị trí C5 của 4 chất 3a-3d. δ = 3,45 - 3,75 ppm đặc trưng cho 3 proton của nhóm O-CH3 của các chất
3b, 3d.
δ = 4,53 - 4,71 ppm đặc trưng cho 1 proton ở vị trí C4 của 4 chất 3a-3d. δ = 5,86 - 6,11 ppm đặc trưng cho 1 proton ở vị trí C2 của 4 chất 3a-3d. δ = 6,66 – 7,66 ppm đặc trưng cho các proton ở vòng benzen của các chất
3a-3d.
Như vậy, với các kết quả phân tích phổ IR, MS và 1H-NMR như đã trình bày ở trên, có thể kết luận là các chất 3a-d tổng hợp được có cấu trúc phù hợp với cấu trúc dự kiến.
3.4. HOẠT TÍNH SINH HỌC 3.4.1. Hoạt tính kháng khuẩn 3.4.1. Hoạt tính kháng khuẩn
a. Các chủng vi sinh vật kiểm định do bộ môn Vi sinh - Sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp.
Vi khuẩn Gram(-)
Escherichia coli ATCC 25922 (EC)
Proteus mirabilis BV 108 (Pro)
Shigella flexneri DT 102 (Shi)
Salmonella typhi DT 220 (Sal)
Pseudomonas aeruginosa VM 201 (P.A) Vi khuẩn Gram(+)
Staphylococus aureus ATCC 1128 (Sta)
Bacillus pumilus ATCC 10242 (Bp)
Bacillus subtilisATCC 6633 (Bs)
Bacillus cereus ATCC 9946 (Bc)
Sarcina lutea ATCC 9341 (SL)
Kháng sinh đối chứng: Streptomycin: 14µg/ml Penicillin: 27 UI/ml b. Môi trường thử nghiệm
Môi trường canh thang nuôi cấy VK kiểm định:
NaCl 0,5% ; pepton 0,5% ; cao thịt 0,3 % ; nước vđ 100ml. Môi trường thạch thường :
c. Phương pháp thử (Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán).
Nguyên tắc: mẫu thử (có chứa hoạt chất thử) được đặt lên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm định, hoạt chất từ mẫu khuếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn. Tiến hành:
Các khoanh giấy lọc vô trùng và đã được sấy khô được tẩm với 3 lần mới dung dịch mẫu thử, sau mỗi lần tẩm các khoanh giấy lọc có chứa mẫu thử đều được sấy < 600C đến khô hết dung môi.
Chuẩn bị môi trường và cấy VSV kiểm định: VSV kiểm định được cấy vào môi trường canh thang, rồi nuôi cấy cho phát triển trong tủ ấm 370C trong thời gian 18-24h đến nồng độ 107 tế bào/ml (kiểm tra bằng pha loãng và dãy dịch chuẩn). Môi trường thạch thường vô trùng (tiệt trùng 1180C/30 phút) được làm lạnh về 45-500C và được cấy giống VSV kiểm định vào với tỷ lệ 2,5 ml/100 ml. Lắc tròn để VSV kiểm định phân tán đều trong MT thạch thường, rồi đổ vào đĩa petri vô trùng với thể tích 20 ml/đĩa và để cho thạch đông lại.
Đặt khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc đã được tẩm chất thử và xử lý như trên được đặt lên bề mặt môi trường thạch thường chứa VSV kiểm định theo sơ đồ định sẵn.
Ủ: các đĩa petri có mẫu thử được đặt như trên trong tủ ấm ở t0C = 370C trong 18-24h, rồi sau đó lấy ra đọc kết quả, đo đường kính vòng vô khuẩn nếu có (thước kẹp Panmer độ chính xác 0,02mm).
Đánh giá dựa trên đường kính vòng vô khuẩn và được đánh giá theo công thức. 2 1 1 ( ) 1 n n i i i i D D D D s n n
D: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn (mm)
i
D: Đường kính vòng vô khuẩn thứ i (mm) s : Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh n : số thí nghiệm làm song song (n = 3) d. Kết quả thực nghiệm
Bảng 3.5:Đường kính vóng vô khuẩn của 3a-3d (D mm).
Chất VSV 3a 3b 3c 3d Peni Strep Bc - - - - 19,38 0,37 21,50 0,66 Bs - - 8,53 0,61 - 20,47 0,7 20,16 1,21 Bp 8,40 0,67 - 8,63 0,43 - - - SL - - - - 12,91 0,47 12,73 0,41 Sal - - - 13,73 1,5 EC - - - 13,2 1,05 Shi - - - 12,07 0,89 Pro 8,45 0,39 - 9,42 0,41 - - 15,53 0,81 P.A - - - 17,37 0,67 Sta 9,00 1,22 - 8,47 0,83 - 11,42 0,67 17,37 0,12
Chú thích: Peni: Penicillin, Strep: Streptomycin e. Kết luận
Chất 3a tác dụng trên 3 vi khuẩn thử gồm: Bacillus pumilis (D = 8,40 ±
0,67 mm), Proteus mirabilis (D = 8,45 ± 0,39 mm), Staphylococus aureus
(9,00 ± 1,22 mm).
Chất 3c tác dụng trên 4 vi khuẩn thử gồm: Bacillus subtilis (8,53 ± 0,61 mm), Bacillus pumilis (8,63 ± 0,43 mm), Proteus mirabilis (9,42 ± 0,41 mm), Staphylococus aureus (8,47 ± 0,83).
3.4.2. Hoạt tính kháng nấm
a. Các chủng VSV kiểm định do bộ môn Vi sinh – Sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp
Vi Nấm
Candida albicans (Ca)
Saccharomyces cerevisiae (Sa)
Aspergillus niger (As)
Penicilium sp. (Pe)
Chất đối chiếu: Itraconazol 50 µg/ml b. Môi trường kiểm nghiệm
Môi trường Sabouraud lỏng nuối cấy C. albicans: Pepton 1,0% ; glucose 2,0 %; nước vđ 100ml
Môi trường thử nghiệm Sabouraud:
Pepton 1,0% ; glucose 2,0 %; thạch 1,6%; nước vđ 100ml
c. Phương pháp thử (Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp
khuếch tán)
Nguyên tắc: mẫu thử (khoanh giấy lọc được tẩm hoạt chất thử) được đặt lên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm định, hoạt chất từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô nấm.
Mẫu thử được pha vào dung môi thích hợp (ethanol) với nồng độ 500 µg/ml, 5,0 µg/ml, và 10,0 µg/ml. Các khoanh giấy lọc vô trùng và đã được sấy khô được tẩm 3 lần với dung dịch mẫu thử, sau mỗi lần tẩm các khoanh giấy lọc có chứa mẫu thử đều được sấy < 600C đến khô hết dung môi.
Chuẩn bị môi trường và cấy VSV kiểm định:
Nấm kiểm định (C. albicans) được cấy vào môi trường Sabouraud lỏng, rồi nuôi cấy cho phát triển trong tủ ấm 28-300C trong thời gian 18-24h đến nồng độ 107 tế bào/ml (kiểm tra bằng pha loãng và dãy dịch chuẩn), (đối với Aspergillus niger thì sử dụng huyền conidi trong dung dịch Tween 80
0,2% vô trùng). Môi trường Sabouraud đặc vô trùng (tiệt trùng 1180C/30 phút) được làm lạnh về 45-500C và được cấy giống vi nấm kiểm định vào với tỷ lệ 2,5 ml/ 100ml. Lắc tròn để vi nấm kiểm định phân tán trong môi trường thạch, rồi đổ đĩa petri vô trùng với thể thích 20ml/đĩa và để cho thạch đông lại.
Đặt khoanh giấy lọc: khoanh giấy lọc đã được tẩm chất thử và xử lý như trên được đặt lên bề mặt môi trường thạch thường chứa VSV kiểm định theo sơ đồ định sẵn (4 thực nghiệm song song).
Ủ các đĩa petri có mẫu thử được đặt trên trong tủ ấm ở t0C = 28-300C trong 24-48h, rồi sau đó lấy ra đọc kết quả, đo đường kính vòng vô nấm nếu có (thước kẹp Panmer độ chính xác 0,02 mm).
Đánh giá kết quả: Dựa vào đường kính vòng vô nấm và được đánh giá theo công thức: 2 1 1 ( ) 1 n n i i i i D D D D s n n
D: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn (mm)
i
s : Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh n : số thí nghiệm làm song song (n = 4) d. Kết quả thực nghiệm
Bảng 3.6: Đường kính vòng vô nấm của 3a-3d(D mm).
Chất VSV 3a 3b 3c 3d Intra Ca 9,35 1,18 - 9,17 0,53 9,23 0,31 16,33 2,01 As - - - 9,62 1,03 15,26 0,41 Sa 9,42 0,97 8,16 1,16 - 9,08 0,59 9,73 0,43 Pe - 8,07 1,14 - - 12,39 0,75 Chú thích: Intra : Itraconazol
e. Kết luận: các mẫu thử có khả năng kháng nấm
Chất 3a tác dụng trên 2 vi nấm: Candida albicans (D = 9,35 ± 1,18 mm),
Saccharomyces cerevisiae (D = 9,42 ± 0,97 mm).
Chất 3b tác dụng trên Saccharomyces cerevisiae (D = 8,16 ± 1,16 mm) và
Penicilium sp. (D = 8,07 ± 1,14 mm).
Chất 3c chỉ tác dụng trên Candida albicans (D = 9,17 ± 0,53 mm).
Chất 3d có tác dụng trên 3 vi nấm: Candida albicans (D = 9,23 ± 0,31 mm), Aspergillus niger (D = 9,62 ± 1,03 mm), Saccharomyces cerevisiae
3.5. BÀN LUẬN
3.5.1. Về tổng hợp hóa học
3.5.1.1. Tổng hợp acid 2-phenylthiazolidin-4-carboxylic và dẫn chất
Phản ứng tổng hợp 2a-d có hiệu suất tương đối thấp là do trong phản ứng đóng vòng tạo thiazolidin từ L-cystein hydroclorid monohydrat thì phải thêm xúc tác base NaHCO3 để chuyển dạng muối L-cystetin hydroclorid về dạng L-cystein base (dạng tự do). Khi đó L-cystein rất dễ bị oxy hóa tạo thành cystin vì vậy ảnh hưởng rất nhiều tới hiệu suất phản ứng. Do đó trong quá trình phản ứng phải sục khí N2 để loại hết khí O2 trong môi trường phản ứng để tăng hiệu suất phản ứng.
Việc kết tinh lại các chất 2a-d trong ethanol hoặc hỗn hợp aceton/nước (1:1) cũng làm mất một phần sản phẩm.
3.5.1.2. Tổng hợp acid N-tert-butoxycarbonylthiazolidin-4-carboxylic và dẫn chất
Hiệu suất tổng hợp 3a-d thấp, điều này có thể giải thích như sau:
Thứ nhất là các chất 2a-d rất không bền trong môi trường kiềm, khi nhỏ NaOH 1N vào hỗn hợp chứa 2a-d và THF có thể làm cho phân hủy 2a-d.
Để giảm sự phân hủy các chất 2a-d thì nên nhỏ từ từ NaOH đến khi tan hết
2a-d thì dừng lại.
Thứ 2 là trong quá trình tinh chế sản phẩm bằng cách kết tinh lại trong hỗn hợp dung môi diethyl ether/n-hexan (1/1) cũng làm mất một phần sản phẩm.
3.5.2. Về hoạt tính sinh học
Kết quả cho thấy các chất 3b và 3d không có hoạt tính kháng khuẩn đối với các VSV kiểm định, tuy nhiên 3b và 3d lại cho có tác dụng kháng nấm rất tốt. Chất 3b kháng được cả Saccharomyces cerevisiae và Penicilium sp.. Điều đặc biệt là chỉ duy nhất 3b kháng được với vi nấm Penicilium sp.. Chất 3d có tác dụng chống nấm đối với 3 vi nấm là C. albicans, S. ceravisiae, A. niger.
Chất 3a và 3c có tác dụng kháng khuẩn khá tốt, đều ức chế B. pumilus,
P. mirabilis, S. aureus, và chất 3c còn ức chế vi khuẩn B. subtilis. Tuy nhiên khả năng kháng nấm của 3a và 3c tương đối yếu . Chất 3a có tác dụng ức chế
A. albicans, S. ceravitiae. Chất 3c chỉ có tác dụng trên A. albicans.
Kết quả cho thấy khi gắn thêm nhóm thế -Cl vào nhân thơm thì hoạt tính kháng khuẩn tăng lên rất nhiều. Tuy nhiên khi gắn thêm –OCH3 thì không còn hoạt tính kháng khuẩn nhưng ảnh hướng rất nhiều tới hoạt tính kháng nấm. Đặc biệt hợp chất 3d kháng lại 3/4 vi nấm là C. albicans, S. ceravitiae, A. niger và chỉ có duy nhất chất 3b kháng lại Penicillium sp..
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. KẾT LUẬN
Từ những kết quả nghiên cứu đã trình bày ở trên, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1) Đã tổng hợp được các dẫn chất: Acid 3-tert-butoxycarbonyl-2-phenylthiazolidin-4-carboxylic (3a) Acid 3-tert-butoxycarbonyl-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)thiazolidin-4- carboxylic (3b) Acid 3-tert-butoxycarbonyl-2-(4-clorophenyl)thiazolidin-4carboxylic (3c) Acid 3-tert-butoxycarbonyl-2-(4-methoxyphenyl)thiazolidin-4-carboxylic (3d)
2) Đã thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của các chất 3a-3d.
Hoạt tính kháng khuẩn: chỉ có 3a và 3c có tác dụng kháng khuẩn, trong đó chất 3c có hoạt tính tốt nhất, kháng lại 4/10 chủng VSV kiểm định đó là
Bacillus subtilis, Bacills pumilus, Proteus mirabili, Staphylococcus aureus.
Hoạt tính kháng nấm: cả 4 chất đều có khả năng kháng nấm với VSV kiểm định, hợp chất 3d có tác dụng với 3/4 VSV kiểm định gồm Candida albicans, Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae. Điều đặc biệt là chỉ
2. KIẾN NGHỊ