2.3.3.1. Phương pháp thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm
* Nguyên tắc
Thử sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm được tiến hành theo phương pháp của Vander Berger và Vlietlinck [45], thực hiện trên các phiến vi lượng 96 giếng, theo 2 bước sau đây:
- Bước 1: Sàng lọc sơ bộ tìm chất có hoạt tính.
- Bước 2: Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất có hoạt tính.
• Kháng sinh đối chiếu
- Ampicillin đối với vi khuẩn Gram (+) - Tetracyclin đối với vi khuẩn Gram (-)
- Nystatin hoặc Amphotericin B đối với nấm mốc và nấm men.
• Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm
Vi khuẩn Gram (+): Bacillus subtillis (ATCC 27212)
Staphylococcus aureus (ATCC 12222) Vi khuẩn Gram (-): Escherichia coli (ATCC 25922)
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923) Nấm mốc: Aspergilus niger (493)
Fusarium oxysporum (M42) Nấm men: Candida albicans (ATCC 7754)
Sacharomyces cerevisiae (SH 20)
• Các bước tiến hành
+ Chuẩn bị vi sinh vật:
Nấm và vi khuẩn được nuôi dưỡng trong môi trường dinh dưỡng Sabouraud dextrose broth và Trypease soya broth (TBS).
+ Chuẩn bị mẫu thử:
Các chất thử được hòa tan trong dung môi DMSO nguyên chất với nồng độ 4mg/ml.
Từ dung dịch gốc pha loãng thành 4-10 thang nồng độ rồi nhỏ sang phiến vi lượng 96 giếng.
Nhỏ vào mỗi giếng đã có sẵn dung dịch VSV đã được hoạt hóa và được pha loãng bằng môi trường dinh dưỡng cho tới nồng độ tương đương 0,5 đơn vị McLand (khoảng 108
VSV/ml).
+ Chuẩn bị mẫu đối chứng dương: Dãy 1: Môi trường.
Dãy 2: Kháng sinh Ampicilin +vi khuẩn Gram (+). Kháng sinh Tetracyclin + vi khuẩn Gram (-). Kháng sinh Nystatin + vi khuẩn kiểm định. + Chuẩn bị mẫu đối chứng âm:
Chỉ có VSV kiểm định, không có kháng sinh hay chất thử. + Đọc kết quả:
Kết quả đọc sau khi ủ các phiến thí nghiệm trong tủ ấm 370C/24 giờ cho vi khuẩn và 300/ 48 giờ đối với nấm mốc và nấm men. Kết quả dương tính là ở nồng độ mà khi nhìn bằng mắt thường thấy trong suốt không thấy có vi sinh vật kiểm định phát triển giống như hình ảnh ở các chứng giếng dương. Khi nuôi cấy lại nồng độ này trên môi trường thạch đĩa để kiểm tra, có giá trị CFU < 5.
Mức dương ở bước 1 sẽ được tiếp tục thử ở bước 2 để tính giá trị MIC.
Các mẫu đã có hoạt tính được sàng lọc ở bước 1 được pha loãng theo các nồng độ thấp dần từ 5 – 10 thang nồng độ để tính giá trị tối thiểu mà ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn.
Mẫu chất tinh khiết có MIC ≤ 50 µg/ml là có hoạt tính.
2.3.3.2. Phương pháp thử tác dụng kháng tế bào ung thư người.
a. Phương pháp thử tác dụng kháng tế bào ung thư người đối với 4 chất Ia,
IIa, IIIa và IVa.
* Nguyên tắc:
Thử nghiệm hoạt tính kháng tế bào ung thư người được tiến hành theo phương pháp SRB của Likhiwitayawuid [32] hiện đang được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư Quốc gia Mỹ (NCI) và trường đại học Dược , đại học tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ.
* Dòng tế bào thử nghiệm:
Dòng Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma): Tế bào ung thư gan người từ Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương.
* Chất chuẩn chứng dương tính:
Dùng chất chuẩn có khả năng diệt tế bào: Ellipticin, Vinblastin hoặc Taxol pha trong DMSO.
* Chất thử:Ia, IIa, IIIa và IVa. * Tiến hành:
- Tế bào ung thư được duy trì ở điều kiện tiêu chuẩn. Sau khi tế bào được hoạt hóa phát triển đến phase log sẽ được sử dụng cho thử test với các chất thử đã chuẩn bị sẵn ở 4 - 10 thang nồng độ khác nhau, lặp lại ba lần trên phiến vi lượng 96 giếng.
- Mẫu thử nghiệm bao gồm: tế bào + môi trường nuôi cấy + mẫu thử được ủ trong tủ ấm CO2/370C để tế bào tiếp tục phát triển.
dịch chuẩn. Đọc kết quả trên máy Elisa ở bước sóng 495 - 515nm.
b. Phương pháp thử tác dụng kháng tế bào ung thư người đối với 4 chất Ib,
IIb, IIIb và IVb
* Nguyên vật liệu thí nghiệm:
Mẫu thử: 4 mẫu, bao gồm: Ib, IIb, IIIb và IVb
Tế bào: gồm 4 dòng tế bào:
- Dòng tế bào Hep-G2 (tế bào ung thư gan) - Dòng tế bào Hela (tế bào ung thư tử cung) - Dòng tế bào A549 (tế bào ung thư phổi)
- Dòng tế bào OVCAR-8 (tế bào ung thư buồng trứng)
Hóa chất:
- MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide), môi trường nuôi cấy DMEM, huyết thanh thai bò (fetal bovine serum) của hãng in vitrogen.
- Adriamycin của hãng Sigma - DMSO của hãng sigma - Và các hóa chất khác
Máy móc thiết bị: máy đọc ELISA của hãng Thermo Labsystems, kính hiển vi soi ngược, và các máy móc khác.
* Nguyên tắc:
Áp dụng phương pháp MTT được biên soạn bởi tác giả Mosmann (1983) để đánh giá độc tính trên tế bào [36]. Nguyên tắc của phương pháp như sau: MTT là thử nghiệm in vitro để đo sự tăng sinh và sống sót của tế bào. Tế bào được nuôi cấy trong một đĩa 96 giếng, đáy bằng. Hợp chất MTT 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, có màu vàng được thêm vào mỗi giếng và tế bào được ủ ở 37o
C, 5% CO2. Màu vàng này bị biến đổi thành formazan tím trong ty thể của những tế bào sống. Khả năng
hấp thụ của dung dịch có màu này có thể được định lượng bằng máy quang phổ kế ở bước sóng 540 – 600 nm. Sự biến đổi màu chỉ xảy ra khi enzyme reductase trong ty thể là hoạt động, và do đó sự chuyển đổi có thể liên quan trực tiếp đến số lượng tế bào sống sót. Chúng tôi sử dụng phương pháp này để nghiên cứu độc tính của thuốc đối với tế bào.
* Cách tiến hành:
- Nuôi cấy tế bào: Các dòng tế bào được lưu giữ trong nitơ lỏng, đánh thức và duy trì trong môi trường DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) có bổ sung huyết thanh bê tươi 10%, dung dịch kháng sinh và kháng nấm 1% (penicillin 50,000 units/L và streptomycin 50 mg/L). Tế bào được nuôi cấy cho phát triển tới mức khoảng 70%, thay môi trường sạch, tế bào này được dùng làm thí nghiệm.
- Mẫu thí nghiệm: Hòa mẫu thí nghiệm vào dung dịch DMSO 100% sao cho nồng độ gốc của các mẫu là 2 mg/ml. Tiếp theo pha thuốc nghiên cứu thành thang nồng độ gồm 5 nồng độ 100, 50, 25, 12.5, và 6.25 μg/ml. Nồng độ của thuốc thử được dùng theo tiêu chuẩn sàng lọc thuốc chống ung thư có nguồn gốc dược liệu của tác giả Teicher 1997 [24]. Adriamycin được sử dụng làm chứng dương và dung dịch DMSO 0,1% được sử dụng làm chứng âm.
- Quy trình nuôi cấy:
1. Pha loãng tế bào ở nồng độ khoảng 2x104tế bào/ml môi trường nuôi cấy. Thêm vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng 180μl huyền dịch tế bào. Để 3 giếng trống chứa môi trường nuôi cấy làm chứng trắng (blank control).
2. Các tế bào được nuôi trong môi trường ở 37o
C và 5% CO2 cho phép tế bào gắn vào đáy mỗi giếng của đĩa nuôi cấy. Giữ tế bào trong 24 giờ để tế bào ổn định.
3. Sau 24 giờ nuôi cấy, thêm 20 μl thuốc thử và thuốc chuẩn ở các nồng độ khác nhau vào mỗi giếng. Mỗi nồng độ được lặp lại ở 2 giếng. Lắc nhẹ đĩa
nuôi cấy để thuốc được tan hoàn toàn trong môi trường. 4. Ủ đĩa nuôi cấy từ 48 giờ (37o
C, 5% CO2)cho phép thuốc phát huy tác dụng. Quan sát tế bào hàng ngày bằng kính hiển vi.
5. Chuẩn bị dung dịch MTT nồng độ 5mg/ml.
6. Thêm 20 μl dung dịch MTT vào mỗi giếng của đĩa nuôi cấy. Lắc nhẹ cho MTT khuếch tán đều trong môi trường nuôi cấy.
7. Ủ 37oC trong 3 giờ để MTT được chuyển hóa.
8. Loại bỏ môi trường trong các giếng của đĩa nuôi cấy.
9. Hoàn trả formazan (sản phẩm chuyển hóa MTT) bằng 100 μl DMSO. Lắc kỹ để formazan có thể tan hoàn toàn.
10. Đọc mật độ quang ở bước sóng 540 nm. Mật độ quang sẽ phản ánh số lượng tế bào sống sót.
- % tế bào sống sau khi đã xử lý thuốc so với chứng trắng được tính theo công thức như sau:
% tế bào sống = [OD540 của tế bào được xử lý] / [OD540 của tế bào không được xử lý thuốc] x 100%
- Cách tính giá trị IC50: Giá trị IC50 được tính bằng phân tích hồi quy không tuyến tính của đường cong đáp ứng liều tương ứng, sử dụng phần mềm Exell.
, hồi lưu
Chương 3
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 TỔNG HỢP HÓA HỌC
3.1.1. Sơ đồ tổng hợp hóa học
Trong khóa luận này, chúng tôi tiến hành các phản ứng tổng hợp theo sơ đồ sau: R1 CHO R2 N H S O X R1 CH R2 N H S O X R1 CH R2 N S O X CH2 + AcONa, AcOH -H2O CH2Cl K2CO3, MW Trong đó: 3.1.2. Tổng hợp 5-arylidenrhodanin và 5-arylidenthiazolidin-2,4-dion.
Dựa vào khả năng phản ứng của nhóm methylen (>CH2) ở vị trí 5 trong phân tử rhodanin và thiazolidin-2,4-dion, chúng tôi tiến hành phản ứng ngưng tụ của các aldehyd thơm (p-fluorobenzaldehyd và 2,4-diclorobenzaldehyd) vào vị trí số 5 của nhân rhodanin và thiazolidin-2,4-dion trong môi trường AcOH bằng với xúc tác base là AcONa.
3.1.2.1. Tổng hợp 5-(p-fluorobenzyliden)rhodanin (Ia) Sơ đồ phản ứng: Chất X R1 R2 Ia, Ib S F H IIa, IIb S Cl Cl IIIa, IIIb O F H IVa, IVb O Cl Cl (Ia-IVa) (Ib-IVb)
* Dụng cụ:
Bình cầu 3 cổ dung tích 250ml, sinh hàn hồi lưu, khuấy từ, nhiệt kế.
* Tiến hành:
Cho vào bình cầu 3 cổ 1,06g (0,008 mol) rhodanin, 0,99g (0,008 mol)
p-fluorobenzaldehyd, 1,97g (0,024 mol) natri acetat khan, 25ml acid acetic băng. Khuấy bằng khuấy từ cho tan, đồng thời tăng nhiệt độ từ từ. Hỗn hợp sôi và hồi lưu ở 117 – 1210C thì bắt đầu tính giờ. Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi CHCl3 : (CH3)2CHOH (40 : 1).
Xác định thời gian phản ứng thích hợp là 5 giờ. Kết thúc phản ứng, đổ hỗn hợp phản ứng ra cốc, để yên ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, tạo tủa. Lọc hút, rửa tủa cho đến hết acid, sấy khô thu được tủa thô.
Kết tinh lại trong dung môi EtOH thu được 1,13g sản phẩm màu vàng nhạt, hơi bông.
* Kết quả:
- Hiệu suất: 59,03%.
- Nhiệt độ nóng chảy: 224 – 2260
C.
- Khả năng hòa tan trong các dung môi: Dễ tan trong DMF, tan trong aceton, khó tan trong EtOH, MeOH, CHCl3, rất khó tan trong nước.
- Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM với hệ dung môi CHCl3 : (CH3)2CHOH (40 : 1) thấy vết gọn, rõ dưới ánh sáng đèn tử ngoại, Rf = 0,66.
3.1.2.2. Tổng hợp 5-(2,4-diclorobenzyliden)rhodanin (IIa) Sơ đồ phản ứng: + F CHO S S F CH S S CHO Cl Cl + S NH O S Cl CH S NH O S Cl
* Dụng cụ:
Tương tự chất Ia
* Tiến hành:
Tương tự như với chất Ia nhưng thay 0,99g (0,008 mol) p-fluoro benzaldehyd bằng 1,4g (0,008 mol) 2,4-diclorobenzaldehyd. Xác định thời gian phản ứng thích hợp là 6 giờ. Kết tinh lại trong dung môi EtOH thu được 1,59g sản phẩm màu vàng nhạt.
* Kết quả:
- Hiệu suất: 68,49%.
- Nhiệt độ nóng chảy: 237-2390
C.
- Khả năng hòa tan trong các dung môi: dễ tan trong DMF, aceton, khó tan trong EtOH, MeOH, CHCl3, rất khó tan trong nước.
- Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM với hệ dung môi CHCl3 : (CH3)2CHOH (40:1) thấy vết gọn, rõ dưới ánh sáng đèn tử ngoại, Rf= 0,62.
3.1.2.3. Tổng hợp 5-(p-fluorobenzyliden)thiazolidin-2,4-dion (IIIa) Sơ đồ phản ứng: CHO F + S NH O O F CH S NH O O
Dụng cụ: Bình cầu ba cổ đáy tròn dung tích 500ml, sinh hàn hồi lưu, bản SKLM, nhiệt kế có nút mài, máy khuấy từ gia nhiệt.
Tiến hành: Cho vào bình cầu ba cổ dung tích 500 ml 12,4g (0,1 mol)
p-fluorobenzaldehyd; 100ml AcOH băng, khuấy đều ở nhiệt độ phòng. Thêm 13,3g (0,1 mol) AcONa và 11,7g (0,1 mol) thiazolidin-2,4-dion rồi khuấy cho tan hoàn toàn ở nhiệt độ phòng, sau đó nâng nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng đến sôi thì bắt đầu tính giờ, duy trì nhiệt độ là 118 – 1230C. Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với dung môi khai triển là CHCl3:CH3OH (30:1).
Xác định thời gian phản ứng thích hợp là 5 giờ. Tủa tạo thành, thêm 20 ml nước cất, khuấy ở nhiệt độ phòng 10 phút. Lọc hút qua phễu chân không, rửa tủa nhiều lần bằng nước cất sau đó rửa tiếp bằng ethanol. Sấy khô ở nhiệt độ 700C thu được 17,84g tủa thô hình kim màu trắng ngà.
Tinh chế sản phẩm bằng phương pháp kết tinh lại với dung môi ethanol thu được 15,83g tinh thể hình kim màu trắng.
-Kết quả:
* Hiệu suất: 70,98%
* Nhiệt độ nóng chảy: 222 – 2240
C.
* Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết: Bằng SKLM với hệ dung môi khai triển CHCl3 : CH3OH (30:1) cho một vết rõ, gọn dưới ánh sáng đèn tử ngoại, Rf=0,57.
* Khả năng hòa tan trong một số dung môi: Dễ tan trong aceton, DMF, EtOH nóng; tan một phần trong cloroform, isopropanol, EtOH ở nhiệt độ phòng; khó tan trong n-hexan; không tan trong nước, EtOH lạnh.
3.1.2.4. Tổng hợp 5-(2,4-diclorobenzyliden)thiazolidin-2,4-dion (IVa) Sơ đồ phản ứng: CHO Cl Cl + S NH O O Cl CH S NH O O Cl - Dụng cụ:Tương tự chất IIIa.
- Tiến hành: Tương tự như đối với chất IIIa nhưng thay 12,4g (0,1 mol) p-fluorobenzaldehyd bằng 17,50g (0,1 mol) 2,4-diclorobenzaldehyd; Thời gian phản ứng thích hợp là 4 giờ. Để yên 24h. Tủa tạo thành, thêm 15 ml nước cất, khuấy ở nhiệt độ phòng 10 phút. Lọc hút qua phễu chân không, rửa tủa nhiều lần bằng nước cất sau đó rửa tiếp bằng ethanol. Sấy khô ở nhiệt độ 700C thu được 20,03g tủa thô hình kim màu trắng ngà.
- Kết quả:
* Hiệu suất: 73,06%
* Nhiệt độ nóng chảy: 216 – 2180
C.
* Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết: Bằng SKLM với hệ dung môi khai triển CHCl3 : CH3OH (30:1) cho một vết rõ, gọn dưới ánh sáng đèn tử ngoại, Rf=0,75.
* Khả năng hòa tan trong một số dung môi: Dễ tan trong aceton, DMF cloroform. Tan được trong methanol ở nhiệt độ phòng. Không tan trong nước, EtOH lạnh.
3.1.3. Tổng hợp một số dẫn chất N-alkyl hóa của 5-arylidenrhodanin và 5-arylidenthiazolidin-2,4-dion. 5-arylidenthiazolidin-2,4-dion.
Chúng tôi dựa trên phương pháp của María Sol Shmidt và cộng sự [35] sử dụng kỹ thuật vi sóng để tổng hợp theo sơ đồ:
R1 CH R2 N H S O X R1 CH R2 N S O X CH2 K2CO3, MW C6H5-CH2-Cl R1, R2 = F, H ; Cl, Cl X= O; S
Dụng cụ: Bình cầu thủy tinh Pyrex dung tích 100ml, lò vi sóng. Tiến hành:
3.1.3.1. Tổng hợp 3-benzyl-5-(p-fluorobenzyliden)rhodanin (Ib)
Cho vào bình cầu 7,18g (0,03 mol) 5-(p-fluorobenzyliden)rhodanin, 3,5 ml (0,03 mol) benzyl clorid, 3g (0,03 mol) K2CO3 và 15 ml DMF. Đậy bình cầu bằng nút nhựa và đặt trong lò vi sóng công suất 180W trong 5’. Sau khi phản ứng kết thúc, đổ hỗn hợp ra cốc có mỏ dung tích 100ml. Để nguội cho kết tinh, sau đó đem lọc hút chân không, rửa tủa bằng nước lạnh. Kết tinh lại trong EtOH. Sấy khô thu được 8,39g sản phẩm là tinh thể hình kim màu vàng.
Nhiệt độ nóng chảy: 92 – 940
C.
Độ tinh khiết: Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi cloroform : isobutanol (50:1), dung môi hòa tan là aceton. Soi đèn tử ngoại thấy một vết gọn, rõ có Rf= 0,55.
Khả năng hòa tan: sản phẩm tan trong aceton, DMF. Tan được trong EtOH nóng, ít tan trong EtOH lạnh, không tan trong nước.
3.1.3.2. Tổng hợp 3-benzyl-5-(2,4-diclorobenyliden)rhodanin (IIb)
Tiến hành tương tự như tổng hợp chất (Ib). Thay 7,18g 5-(p-fluoro benzyliden)rhodanine bằng 8,71g (0,03 mol) 5-(2,4-diclorobenzyliden) rhodanin. MW trong 2 phút. Để nguội, lọc hút chân không, kết tinh lại trong EtOH. Sấy khô thu được 9,36g tinh thể hình kim màu đỏ, có nhiệt độ nóng chảy 86 – 880C, hiệu suất 82,04%.
Độ tinh khiết: Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi cloroform : isobutanol (50:1), dung môi hòa tan là aceton. Soi đèn tử ngoại thấy một vết gọn, rõ có Rf= 0,56.
Khả năng hòa tan: sản phẩm tan trong aceton, DMF. Tan được trong EtOH nóng, ít tan trong EtOH lạnh, không tan trong nước.
3.1.3.3. Tổng hợp 3-benzyl-5-(p-fluorobenzyliden)thiazolidin-2,4-dion (IIIb)