Phản ứng N-alkyl hóa là phản ứng thay thế một hoặc nhiều nguyên tử hydro gắn với nitơ của hợp chất hữu cơ bẳng một hay nhiều nhóm alkyl. [2]
* Sơ đồ phản ứng:
R = Aryl; X = O, S; R’: Alkyl, arakyl; X’ = Cl, F, Br, I
* Cơ chế
Phản ứng N-alkyl hóa các dẫn chất 5-arylidenrhodanin và 5-aryldien thiazolidin-2,4-dion diễn ra theo cơ chế thế ái nhân SN2 với tác nhân alkyl hóa [1]. Trong khóa luận này chúng tôi sử dụng tác nhân phản ứng là benzylclorid.
1.4. Tổng quan về vi sóng và ứng dụng kỹ thuật vi sóng trong tổng hợp hữu cơ
Vi sóng (micro-onde, microwave) là sóng cực ngắn hay còn gọi là sóng siêu tầng, sóng UHF (Ultra High Frequence wave). Trong phổ điện tử (electromagnetic spectrum), vi sóng nằm ở khoảng giữa phổ, từ tần số 0,3 GHz đến 300 GHz, tương ứng với độ dài của sóng trong khoảng 100 cm đến 1 cm, do đó vi sóng còn gọi là sóng cm.
Năng lượng của vi sóng là năng lượng điện từ. Năng lượng photon của vi sóng rất thấp. Tại 2450 MHz, năng lượng photon của vi sóng khoảng 0,0016eV (0,037 kcal/mol), trong khi năng lượng của một lien kết hóa học là 80 – 120 kcal/mol (H-OH là 4,8 eV, H3C-CH3 là 3,61 eV, nối hydrogen là 0,04-0,44 eV). Do đó vi sóng không ảnh hưởng đến cấu trúc phân tử hợp chất hữu cơ. Sự kích thích phân tử của vi sóng thuần túy về động học.
Nguyên tắc làm nóng vật chất của vi sóng: Sự tăng nhiệt cục bộ tức thời của vật chất trong vi sóng là do sự quay lưỡng cực (dipole rotation) và sự
dẫn truyền ion (ionic conduction). Nhiệt sinh ra do sự dẫn truyền ion là kết quả của sự tăng trở kháng của môi trường chống lại sự dịch chuyển của các ion trong trường điện từ. Còn cơ chế quay lưỡng cực là quá trình đổi hưởng của một phân tử phân cực theo chiều của điện trường. Dưới tác động của điện trường, các phân tử lưỡng cực có khuynh hướng sắp xếp theo chiều điện trường. Do đó trong điện trường xoay chiều tần số rất cao (MHz) sẽ gây ra sự xáo trộn ma sát với vận tốc rất lớn giữa các phân tử, đó chính là nguồn gốc sự nóng lên của vật chất. Ưu điểm của sự đun nóng bằng vi sóng: Không có quán tính nhiệt; năng lượng sạch, dễ chế tạo và dễ kiểm soát; nhanh chóng, có tác dụng đặc biệt với các phân tử có cực vì vậy sự đun nóng bằng vi sóng chọn lọc, trực tiếp và nhanh chóng. Những hợp chất càng phân cực càng mau nóng dưới sự chiếu vi sóng. Vi sóng kích hoạt những phân tử phân cực, đặc biệt là nước. Nước bị đun nóng bới sự hấp thụ vi sóng và bốc hơi, tạo ra áp suất cao tại nơi tác dụng, làm cho nước di chuyển từ tâm vật chất và bề mặt của nó. Nguyên tắc này được ứng dụng trong sự sấy chiếu bằng vi sóng.
Ứng dụng của vi sóng: Tổng hợp hữu cơ (kích hoạt phản ứng); hỗ trợ ly trích; hỗ trợ công việc phòng thí nghiệm như: sấy khô các vật dụng thủy tinh, tăng hoạt sắc ký bản mỏng, hoạt hóa tái tạo chất hấp thu sắc ký, chất hút ẩm, rây phân tử, chất mang rắn.
Kĩ thuật vi sóng là một kỹ thuật mới trong tổng hợp hữu cơ với những tính năng vượt trội: giảm thời gian phản ứng, giảm phản ứng phụ, tăng hiệu suất, tăng độ chọn lọc. Đặc biệt trong các phản ứng cấp nhiệt, các phản ứng giữa các pha dị thể. Vi sóng còn có tác dụng tăng cường khuấy trộn, tăng tiếp xúc pha làm tăng hiệu suất phản ứng.
Với những ưu điểm như đã trình bày ở trên, trong khóa luận này chúng tôi ứng dụng kỹ thuật vi sóng để tổng hợp các dẫn chất N-alkyl hóa của 5- arylidenrhodanin và 5-arylidenthiazolidin-2,4-dion.
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
2.1.1 Nguyên liệu
Hóa chất sử dụng trong thực nghiệm là các hóa chất thí nghiệm thông thường, bao gồm một số hóa chất sau:
- Aceton (Trung Quốc) - Rhodanin (Merk)
- Methanol (Trung Quốc) - Thiazolidin-2,4-dion (Merk) - Cồn tuyệt đối (Trung Quốc) - p-Fluorobenzaldehyd (Merk) - Benzylclorid (Merk) - 2,4-Diclorobenzaldehyd (Merk) - Dimethylformamid (Merk) - Acid acetic băng (Trung Quốc) - Isobutanol (Merk) - Natri acetat (Trung Quốc) - Kali carbonat (Trung Quốc) - Isopropanol (Trung Quốc) - Cloroform (Trung Quốc)
2.1.2 Thiết bị
- Bình cầu đáy tròn dung tính 500ml, 200ml, 100ml; bình cầu ba cổ dung tích 500 ml, 250ml, 100ml; sinh hàn hồi lưu; nhiệt kế cổ mài; máy khuấy từ gia nhiệt (IKA-Đức); bếp đun; phễu lọc hút chân không Buchner; tủ sấy (Memmert-Đức; Shellab-Mỹ); cân điện tử; ống đong; cốc có mỏ; đũa thủy tinh; đĩa petri; ống nghiệm; pipet định mức; giấy lọc; cát.
- Lò vi sóng SHARP microwave oven model R-218L (s), 220V, 216H, dung tích 275 cm3.
- Bản mỏng silicagel 60 F254 (Merk)
- Máy đo nhiệt độ nóng chảy Electrothermal Digital, tại Bộ môn Hóa hữu cơ, Trường Đại học Dược Hà Nội.
- Phổ hồng ngoại (IR) ghi trên máy GX - Perkin Elmer - USA tại Phòng phân tích cấu trúc - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam và phòng Thí
nghiệm Hóa vật liệu - Khoa Hóa học - Trường ĐH Khoa học tự nhiên - Đại học quốc gia Hà Nội.
- Phổ khối (MS) ghi trên máy LC - MSD - Trap - SL tại Phòng khối phổ - Viện Hóa học và máy AutoSpec Premier - USA tại phòng Thí nghiệm Hóa vật liệu - Khoa Hóa học - Trường ĐH Khoa học tự nhiên - Đại học quốc gia Hà Nội.
- Phổ cộng hưởng từ proton 1
H-NMR và cộng hưởng từ hạt nhân 13
C- NMR ghi trên máy Bruker-AV500 tại Phòng phân tích cấu trúc - Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Tổng hợp các dẫn chất ngưng tụ của p-fluorobenzaldehyd và 2,4- diclorobenzaldehyd với rhodanin và thiazolidin-2,4-dion.
2.2.2. Tổng hợp một số dẫn chất N-alkyl hóa của 5-arylidenrhodanin và 5-arylidenthiazolidin-2,4-dion.
2.2.3. Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được.
2.2.4. Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm và kháng tế bào ung thư của chất tổng hợp được.
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Phương pháp tổng hợp các sản phẩm dự kiến.
- Áp dụng các phương pháp thực nghiệm trong hóa học hữu cơ để tổng hợp các sản phẩm dự kiến.
- Dùng phương pháp kết tinh lại để tinh chế sản phẩm thu được.
- Dùng SKLM để theo dõi quá trình tiến triển của phản ứng. Soi đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm để nhận biết vết sắc ký.
- Kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy.
2.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc
Xác định cấu trúc hóa học của các chất tổng hợp được dựa trên kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ proton (1H-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13
C (13C-NMR).
2.3.3. Phương pháp thử tác dụng sinh học
2.3.3.1. Phương pháp thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm
* Nguyên tắc
Thử sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm được tiến hành theo phương pháp của Vander Berger và Vlietlinck [45], thực hiện trên các phiến vi lượng 96 giếng, theo 2 bước sau đây:
- Bước 1: Sàng lọc sơ bộ tìm chất có hoạt tính.
- Bước 2: Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất có hoạt tính.
• Kháng sinh đối chiếu
- Ampicillin đối với vi khuẩn Gram (+) - Tetracyclin đối với vi khuẩn Gram (-)
- Nystatin hoặc Amphotericin B đối với nấm mốc và nấm men.
• Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm
Vi khuẩn Gram (+): Bacillus subtillis (ATCC 27212)
Staphylococcus aureus (ATCC 12222) Vi khuẩn Gram (-): Escherichia coli (ATCC 25922)
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923) Nấm mốc: Aspergilus niger (493)
Fusarium oxysporum (M42) Nấm men: Candida albicans (ATCC 7754)
Sacharomyces cerevisiae (SH 20)
• Các bước tiến hành
+ Chuẩn bị vi sinh vật:
Nấm và vi khuẩn được nuôi dưỡng trong môi trường dinh dưỡng Sabouraud dextrose broth và Trypease soya broth (TBS).
+ Chuẩn bị mẫu thử:
Các chất thử được hòa tan trong dung môi DMSO nguyên chất với nồng độ 4mg/ml.
Từ dung dịch gốc pha loãng thành 4-10 thang nồng độ rồi nhỏ sang phiến vi lượng 96 giếng.
Nhỏ vào mỗi giếng đã có sẵn dung dịch VSV đã được hoạt hóa và được pha loãng bằng môi trường dinh dưỡng cho tới nồng độ tương đương 0,5 đơn vị McLand (khoảng 108
VSV/ml).
+ Chuẩn bị mẫu đối chứng dương: Dãy 1: Môi trường.
Dãy 2: Kháng sinh Ampicilin +vi khuẩn Gram (+). Kháng sinh Tetracyclin + vi khuẩn Gram (-). Kháng sinh Nystatin + vi khuẩn kiểm định. + Chuẩn bị mẫu đối chứng âm:
Chỉ có VSV kiểm định, không có kháng sinh hay chất thử. + Đọc kết quả:
Kết quả đọc sau khi ủ các phiến thí nghiệm trong tủ ấm 370C/24 giờ cho vi khuẩn và 300/ 48 giờ đối với nấm mốc và nấm men. Kết quả dương tính là ở nồng độ mà khi nhìn bằng mắt thường thấy trong suốt không thấy có vi sinh vật kiểm định phát triển giống như hình ảnh ở các chứng giếng dương. Khi nuôi cấy lại nồng độ này trên môi trường thạch đĩa để kiểm tra, có giá trị CFU < 5.
Mức dương ở bước 1 sẽ được tiếp tục thử ở bước 2 để tính giá trị MIC.
Các mẫu đã có hoạt tính được sàng lọc ở bước 1 được pha loãng theo các nồng độ thấp dần từ 5 – 10 thang nồng độ để tính giá trị tối thiểu mà ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn.
Mẫu chất tinh khiết có MIC ≤ 50 µg/ml là có hoạt tính.
2.3.3.2. Phương pháp thử tác dụng kháng tế bào ung thư người.
a. Phương pháp thử tác dụng kháng tế bào ung thư người đối với 4 chất Ia,
IIa, IIIa và IVa.
* Nguyên tắc:
Thử nghiệm hoạt tính kháng tế bào ung thư người được tiến hành theo phương pháp SRB của Likhiwitayawuid [32] hiện đang được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư Quốc gia Mỹ (NCI) và trường đại học Dược , đại học tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ.
* Dòng tế bào thử nghiệm:
Dòng Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma): Tế bào ung thư gan người từ Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương.
* Chất chuẩn chứng dương tính:
Dùng chất chuẩn có khả năng diệt tế bào: Ellipticin, Vinblastin hoặc Taxol pha trong DMSO.
* Chất thử:Ia, IIa, IIIa và IVa. * Tiến hành:
- Tế bào ung thư được duy trì ở điều kiện tiêu chuẩn. Sau khi tế bào được hoạt hóa phát triển đến phase log sẽ được sử dụng cho thử test với các chất thử đã chuẩn bị sẵn ở 4 - 10 thang nồng độ khác nhau, lặp lại ba lần trên phiến vi lượng 96 giếng.
- Mẫu thử nghiệm bao gồm: tế bào + môi trường nuôi cấy + mẫu thử được ủ trong tủ ấm CO2/370C để tế bào tiếp tục phát triển.
dịch chuẩn. Đọc kết quả trên máy Elisa ở bước sóng 495 - 515nm.
b. Phương pháp thử tác dụng kháng tế bào ung thư người đối với 4 chất Ib,
IIb, IIIb và IVb
* Nguyên vật liệu thí nghiệm:
Mẫu thử: 4 mẫu, bao gồm: Ib, IIb, IIIb và IVb
Tế bào: gồm 4 dòng tế bào:
- Dòng tế bào Hep-G2 (tế bào ung thư gan) - Dòng tế bào Hela (tế bào ung thư tử cung) - Dòng tế bào A549 (tế bào ung thư phổi)
- Dòng tế bào OVCAR-8 (tế bào ung thư buồng trứng)
Hóa chất:
- MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide), môi trường nuôi cấy DMEM, huyết thanh thai bò (fetal bovine serum) của hãng in vitrogen.
- Adriamycin của hãng Sigma - DMSO của hãng sigma - Và các hóa chất khác
Máy móc thiết bị: máy đọc ELISA của hãng Thermo Labsystems, kính hiển vi soi ngược, và các máy móc khác.
* Nguyên tắc:
Áp dụng phương pháp MTT được biên soạn bởi tác giả Mosmann (1983) để đánh giá độc tính trên tế bào [36]. Nguyên tắc của phương pháp như sau: MTT là thử nghiệm in vitro để đo sự tăng sinh và sống sót của tế bào. Tế bào được nuôi cấy trong một đĩa 96 giếng, đáy bằng. Hợp chất MTT 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, có màu vàng được thêm vào mỗi giếng và tế bào được ủ ở 37o
C, 5% CO2. Màu vàng này bị biến đổi thành formazan tím trong ty thể của những tế bào sống. Khả năng
hấp thụ của dung dịch có màu này có thể được định lượng bằng máy quang phổ kế ở bước sóng 540 – 600 nm. Sự biến đổi màu chỉ xảy ra khi enzyme reductase trong ty thể là hoạt động, và do đó sự chuyển đổi có thể liên quan trực tiếp đến số lượng tế bào sống sót. Chúng tôi sử dụng phương pháp này để nghiên cứu độc tính của thuốc đối với tế bào.
* Cách tiến hành:
- Nuôi cấy tế bào: Các dòng tế bào được lưu giữ trong nitơ lỏng, đánh thức và duy trì trong môi trường DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) có bổ sung huyết thanh bê tươi 10%, dung dịch kháng sinh và kháng nấm 1% (penicillin 50,000 units/L và streptomycin 50 mg/L). Tế bào được nuôi cấy cho phát triển tới mức khoảng 70%, thay môi trường sạch, tế bào này được dùng làm thí nghiệm.
- Mẫu thí nghiệm: Hòa mẫu thí nghiệm vào dung dịch DMSO 100% sao cho nồng độ gốc của các mẫu là 2 mg/ml. Tiếp theo pha thuốc nghiên cứu thành thang nồng độ gồm 5 nồng độ 100, 50, 25, 12.5, và 6.25 μg/ml. Nồng độ của thuốc thử được dùng theo tiêu chuẩn sàng lọc thuốc chống ung thư có nguồn gốc dược liệu của tác giả Teicher 1997 [24]. Adriamycin được sử dụng làm chứng dương và dung dịch DMSO 0,1% được sử dụng làm chứng âm.
- Quy trình nuôi cấy:
1. Pha loãng tế bào ở nồng độ khoảng 2x104tế bào/ml môi trường nuôi cấy. Thêm vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng 180μl huyền dịch tế bào. Để 3 giếng trống chứa môi trường nuôi cấy làm chứng trắng (blank control).
2. Các tế bào được nuôi trong môi trường ở 37o
C và 5% CO2 cho phép tế bào gắn vào đáy mỗi giếng của đĩa nuôi cấy. Giữ tế bào trong 24 giờ để tế bào ổn định.
3. Sau 24 giờ nuôi cấy, thêm 20 μl thuốc thử và thuốc chuẩn ở các nồng độ khác nhau vào mỗi giếng. Mỗi nồng độ được lặp lại ở 2 giếng. Lắc nhẹ đĩa
nuôi cấy để thuốc được tan hoàn toàn trong môi trường. 4. Ủ đĩa nuôi cấy từ 48 giờ (37o
C, 5% CO2)cho phép thuốc phát huy tác dụng. Quan sát tế bào hàng ngày bằng kính hiển vi.
5. Chuẩn bị dung dịch MTT nồng độ 5mg/ml.
6. Thêm 20 μl dung dịch MTT vào mỗi giếng của đĩa nuôi cấy. Lắc nhẹ cho MTT khuếch tán đều trong môi trường nuôi cấy.
7. Ủ 37oC trong 3 giờ để MTT được chuyển hóa.
8. Loại bỏ môi trường trong các giếng của đĩa nuôi cấy.
9. Hoàn trả formazan (sản phẩm chuyển hóa MTT) bằng 100 μl DMSO. Lắc kỹ để formazan có thể tan hoàn toàn.
10. Đọc mật độ quang ở bước sóng 540 nm. Mật độ quang sẽ phản ánh số lượng tế bào sống sót.
- % tế bào sống sau khi đã xử lý thuốc so với chứng trắng được tính theo công thức như sau:
% tế bào sống = [OD540 của tế bào được xử lý] / [OD540 của tế bào không được xử lý thuốc] x 100%
- Cách tính giá trị IC50: Giá trị IC50 được tính bằng phân tích hồi quy không tuyến tính của đường cong đáp ứng liều tương ứng, sử dụng phần mềm Exell.
, hồi lưu
Chương 3
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 TỔNG HỢP HÓA HỌC
3.1.1. Sơ đồ tổng hợp hóa học
Trong khóa luận này, chúng tôi tiến hành các phản ứng tổng hợp theo sơ đồ sau: R1 CHO R2 N H S O X R1 CH R2 N H S O X R1 CH R2 N S O X CH2 + AcONa, AcOH -H2O CH2Cl K2CO3, MW Trong đó: 3.1.2. Tổng hợp 5-arylidenrhodanin và 5-arylidenthiazolidin-2,4-dion.
Dựa vào khả năng phản ứng của nhóm methylen (>CH2) ở vị trí 5 trong phân tử rhodanin và thiazolidin-2,4-dion, chúng tôi tiến hành phản ứng ngưng tụ của các aldehyd thơm (p-fluorobenzaldehyd và 2,4-diclorobenzaldehyd) vào vị trí số 5 của nhân rhodanin và thiazolidin-2,4-dion trong môi trường