Nyirady J và cộng sự đã nghiên cứu độ ổn định của tretinoin trong gel chứa vi tiểu phân tretinoin 0,1%. Kết quả cho thấy công thức gel chứa vi tiểu phân tretinoin 0,1% có khả năng chống lại đáng kể sự thoái quang của tretinoin cả khi trong công thức chứa chất oxy hóa mạnh như benzoylhydroxid[17].
Nighland M và các cộng sự đã đánh giá ảnh hưởng của tia UV đối với tretinoin trong gel vi tiểu phân tretinoin 0,1% và gel tretinoin 0,025%. Kết quả cho thấy công thức gel vi tiểu phân tretinoin giúp bảo vệ tretinoin tránh bị thoái quang tốt hơn gel tretinoin, kể cả khi trong công thức chứa kháng sinh hoặc chất oxy hóa mạnh[16].
M.J. Lucero và cộng sự nghiên cứu độ ổn định của gel thân nước chứa tretinoin. Kết quả cho thấy các chất chống oxy hóa làm chậm và làm giảm quá trình suy thoái của tretinoin do bị oxy hóa các nối đôi liên hợp [23].
Kawata K và các cộng sự đã nghiên cứu xây dựng công thức gel tretinoin chứa ota-carrageenan, polyethylen oxid và Emulgen® 408. Trong nghiên cứu này, gel tretinoin được xây dựng với các chế phẩm khác nhau chứa polyethylen oxid (Emulgen ®) và iota-carrageenan (ι-CG) đã được chuẩn bị và đánh giá các tính chất hóa lý. Từ kết quả kiểm tra độ nhạy cảm, các thuộc tính của gel như độ kết dính, độ bền gel và độ chảy đã được điều chỉnh tùy thuộc vào tình trạng của da bằng cách thay đổi các thành phần của gel. Thông qua nghiên cứu tính bền vững đối với ánh sáng, các điều kiện và ngày hết hạn lưu trữ của gel này được xác định là 4°C trong 28 ngày mà không tiếp xúc với ánh sáng[15].
Tashtoush BM và các cộng sự đã nghiên cứu phương pháp HPLC sử dụng detector UV để xác định đồng thời tretinoin và isotretinoin trong các chế phẩm dùng ngoài da. Tretinoin và isotretinoin chiết từ mẫu chế phẩm bằng acetonitril. Phương pháp HPLC sử dụng dung môi pha đảo gồm acid trifluoracetic 0,01% : acetonitril (tỷ lệ 15:85) có thể tách tretinoin và isotretinoin và định lượng 2 chất này cả với hàm lượng thấp tới 10pmol. Các thí nghiệm đã xác nhận độ chính xác của phương pháp này. Khi áp dụng phương pháp này để phân tích một loại kem chứa tretinoin tiếp xúc với ánh sáng mặt trời mô phỏng đã chứng minh sự thoái quang tạo sản phẩm chính là isotretinoin và acid 9 – cis retinoid[19].
Martin B và các cộng sự đã nghiên cứu độ ổn định hóa học của adapalen và tretinoin khi phối hợp với benzoyl peroxid trong điều kiện tránh sáng hoặc chiếu ánh sáng nhìn thấy và ánh sáng tử ngoại. Mẫu nghiên cứu là gel trị mụn trứng cá chứa 0,1% adapalen và 0,025% tretinoin được trộn với 1 thể tích tương đương chế phẩm chứa benzoyl peroxid 10% và chiếu sáng trong 24 giờ. Kết quả cho thấy dù tránh sáng hay chiếu sáng thì adapalen vẫn ổn định trong khi tretinoin đặc biệt nhạy cảm với ánh sáng. Lượng tretinoin trong mẫu chiếu sáng bị giảm 50% sau 2 giờ và giảm 95% sau 24 giờ [25].
Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.1. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ 1.1.1. Nguyên liệu
Bảng 2.1. Nguyên liệu bào chế gel
STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn
1 Tretinoin Trung Quốc TCCS
2 Erythromycin Trung Quốc TCCS
3 Propylene glycol Trung Quốc TCCS
4 Glycerin Malaysia TCCS
5 Butylate hydroxyltoluen Trung Quốc TCCS
6 Acid citric Trung Quốc TCCS
7 Triethanolamin Đức TCCS
8 Hydroxylpropyl cellulose Trung Quốc TCCS
9 Hydroxylethyl cellulose Trung Quốc TCCS
10 HPMC Trung Quốc TCCS
11 Ethanol Trung Quốc TCCS
12 Isopropanol Việt Nam TCCS
13 Nước cất Việt Nam TCCS
Bảng 2.2. Hóa chất dùng cho định lượng tretinoin bằng phương pháp HPLC
STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn
1 Ethanol Trung Quốc TCCS
2 Methanol Đức TCCS
3 Acid acetic bang Đức TCCS
Bảng 2.3. Hóa chất dùng cho định lượng erythromycin bằng phương pháp vi sinh vật
STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn
1 Pepton Ấn Độ TCCS
2 Cao thịt bò Đức TCCS
3 Cao nấm men Đức TCCS
4 Glucose monohydrate Việt Nam TCCS
5 Thạch bột Việt Nam TCCS
6 Casein thủy phân bởi casein
pancreatin Đức TCCS
7 Natri clorid Việt Nam TCCS
8 Natri hydroxid Trung Quốc TCCS
9 Kali dihydrophosphat Trung Quốc TCCS
1.1.2. Thiết bị
Các dụng cụ thủy tinh dùng trong bào chế và phân tích Tủ sấy DAIHAN (Hàn Quốc)
Cân phân tích Sartorius TE214S Cân phân tích Mettler Toledo. Cân kỹ thuật Sartorius
Máy siêu âm Sonorex
Máy đo pH Mettler Toledo LE438
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity Màng lọc cellulose acetat 0,45m
Syring lọc PVDF 0,45µm Micropipette
Nồi hấp tiệt khuẩn ALP – KT30S Tủ cấy Sanyo Clean Bench
Máy đo độ nhớt Brookfield
1.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố công thức như tá dược tạo gel, chất hóa dẻo, chất điều chỉnh pH, chất chống oxy hóa tới các chỉ tiêu chất lượng của gel.
Đánh giá một số đặc tính của gel bào chế được.
1.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.3.1. Phương pháp bào chế gel
Bào chế gel chứa erythromycin và tretinoin theo phương pháp hòa tan với sự thay đổi các yếu tố trong công thức (tá dược, dung môi,chất điều chỉnh pH,…).
Với công thức gel sử dụng dung môi có chứa một phần nước: Ngâm trương nở tá dược tạo gel trong nước.
Hòa tan dược chất và các tá dược còn lại trong ethanol/IPA. Phối hợp hai phần trên, khuấy cho đồng nhất.
Với công thức gel sử dụng dung môi là ethanol hoặc IPA:
Hòa tan dược chất và các tá dược (trừ tá dược tạo gel) trong dung môi. Thêm tá dược tạo gel, khuấy cho hòa tan hoàn toàn và đồng nhất.
1.3.2. Phương pháp đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của gel chứa erythromycin và tretinoin
1.3.2.1. Hình thức
Đánh giá cảm quan các tiêu chí màu sắc, sự đồng nhất, độ trong,…
1.3.2.2. Độ nhớt
Sử dụng máy đo độ nhớt Brookfield, kim số 2, tốc độ 3 vòng/phút.
1.3.2.3. pH
Hòa tan 1g gel trong ethanol. Thêm ethanol vừa đủ 100ml.
Đo pH bằng máy đo pH Mettler Toledo [5].
1.3.2.4. Định lượng erythromycin bằng phương pháp vi sinh vật
Chất chuẩn: Erythromycin
Chủng chỉ thị: Bacillus pumilus, Bacillus subtilis hoặc Bacillus cereus
Môi trường số 1:
Pepton 6,0 g
Casein thủy phân bởi casein pancreatin 4,0 g
Cao thịt bò 3,0 g
Cao nấm men 3,0 g
Glucose monohydrat 1,0 g
Thạch 15 g
Nước 1000 ml
pH sau khi tiệt trùng: 7,8 – 8,0 Dung môi hòa tan: ethanol 96
Dung môi pha loãng:dung dịch đệm số 12 (DĐVN IV) tiệt trùng, pH = 8,0 ± 0,1
b. Cách thử
Dung dịch đối chiếu:
Tính toán để cân chính xác lượng chất chuẩn P mg để pha dung dịch có nồng độ 1000 IU/ml theo công thức:
1000 ( ) V P mg a
1000: nồng độ của dung dịch mẹ của chất chuẩn (IU/ml) V: thể tích bình định mức (ml)
a = 883,4 IU/mg: số đơn vị trong 1 mg chất chuẩn Tiến hành:
Cân chính xác khoảng P mg chất chuẩn, hòa tan bằng ethanol 96 trong bình định mức để được dung dịch ban đầu 1000 IU/ml. Từ dung dịch ban đầu pha thành 3 dung dịch có nồng độ thích hợp 2,5 – 5 – 10 IU/ml bằng dung dịch đệm pH 8.
Cân chính xác một lượng chế phẩm tương ứng để pha 1 dung dịch có nồng độ 1000 IU/ml như phần pha dung dịch đối chiếu.
Từ dung dịch này pha thành 3 dung dịch có nồng độ như phần pha dung dịch đối chiếu bằng dung dịch đệm pH 8.
c. Tiến hành thử
Chuẩn bị các đĩa petri tiếp chủng: dùng các đĩa petri đã được tiệt trùng, đặt trên 1 mặt phẳng, đổ vào mỗi đĩa 25ml môi trường số 1 đã được tiếp chủng Bacillus subtilis. Để nguội, dùng bộ đục lỗ đục 6 lỗ cách đều nhau và cách tâm hộp khoảng 2,5 cm.
Nhỏ các dung dịch có nồng độ đã pha ở trên vào các lỗ thạch (mỗi lỗ thạch nhỏ 50 µl), để ở nhiệt độ thường 30 – 60 phút, sau đó để tủ ấm 35 - 37C trong 16 – 18 giờ.
Đo đường kính vòng vô khuẩn, tỷ lệ phần trăm hoạt lực kháng sinh thử so với chuẩn được tính theo công thức:
4 log 2 log 3 A R anti I B A = (T1 + T2 + T3) – (S1 + S2 + S3) B = (T3 – T1) + (S3 – S1)
T1, T2, T3, S1, S2, S3 là tổng giá trị đường kính vòng vô khuẩn của các nồng độ tương ứng (đơn vị mm)
I là tỷ số của 2 nồng độ pha loãng kế tiếp nhau, I = 2 [6], [4].
1.3.2.5. Định lượng tretinoin
a. Quét phổ hấp thụ UV – VIS của tretinoin
Cân chính xác khoảng 5mg tretinoin, hòa tan trong ethanol vừa đủ được 10ml dung dịch A. Lấy 0,5ml dung dịch A, pha loãng với ethanol vừa đủ 25ml.
Quét phổ dung dịch vừa pha bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity trong dải bước sóng từ 200 – 400 nm.
b. Xây dựng phương pháp định lượng tretinoin bằng HPLC
Qua tham khảo các tài liệu [19], [27] và kết quả quét phổ hấp thụ, quyết định lựa chọn các điều kiện sắc ký để định lượng tretinoin như sau:
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity kết nối với detector UV – VIS.
Cột sắc ký C18 (4,6×150mm, 5m)
Pha động: methanol : dung dịch acid acetic 0,5% (85:15) Tốc độ dòng: 1,8ml/phút
Thể tích tiêm: 20l
Bước sóng hấp thụ: 365nm
c. Khảo sát tính tương thích hệ thống
Tiến hành bằng cách tiêm lặp lại 6 lần cùng một dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn. Độ thích hợp của hệ thống HPLC được biểu thị qua hệ số kéo đuôi, số đĩa lý thuyết, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu và diện tích pic.
Yêu cầu: RSD ≤ 2% [10], [9].
d. Xây dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ tretinoin
Cách tiến hành:
Pha dung dịch A tương tự như khi quét phổ
Từ dung dịch A, pha thành các dung dịch có nồng độ lần lượt 2,5; 5; 10; 20; 40; 80 g/ml.
Lần lượt phân tích các mẫu trên bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao theo chương trình đã chọn.
Phân tích kết quả theo phương pháp thống kê nhờ phần mềm Microsoft Excel 2007.
Yêu cầu hệ số tương quan hồi quy tuyến tính khi xây dựng đường chuẩn phải thỏa mãn 0,995 ≤ R ≤ 1 hay 0,99 ≤ R2 ≤ 1 [10], [9].
Để xác định độ lặp, tiến hành thí nghiệm lặp lại 6 lần trên cùng 1 mẫu thử (mỗi lần bắt đầu từ cân, đong mẫu).
Chuẩn bị mẫu thử:
Cân chính xác 1 lượng mẫu thử tương đương với khoảng 0,1mg tretinoin. Hòa tan mẫu vừa cân trong ethanol vừa đủ 10ml.
Lọc qua màng lọc 0,45m.
Độ lặp lại được biểu thị bằng độ lệch chuẩn (SD) hoặc độ lệch chuẩn tương đối (RSD).
Yêu cầu: RSD ≤ 2% [9].
f. Tiến hành định lượng tretinoin trong mẫu thử
Chuẩn bị mẫu chuẩn:
Cân chính xác khoảng 5mg tretinoin, hòa tan bằng ethanol vừa đủ 10ml được dung dịch A.
Lấy 0,5 ml dung dịch A, pha loãng thành 25ml bằng ethanol. Lọc qua màng lọc 0,45m.
Chuẩn bị mẫu thử:
Cân chính xác lượng mẫu thử tương đương 0,1 mg tretinoin. Hòa tan mẫu trong lượng ethanol vừa đủ 10ml.
Lọc qua màng lọc 0,45m.
Phân tích mẫu chuẩn và mẫu thử bằng hệ thống HPLC theo chương trình trên.
Tính hàm lượng tretinoin trong mẫu thử theo công thức:
100 10 (%) 500 t c t c t S m C S m
Trong đó: mc là khối lượng chất chuẩn đã cân mt là khối lượng mẫu thử đã cân Sc: diện tích pic sắc ký của mẫu chuẩn St: diện tích pic sắc ký mẫu thử
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TRETINOIN 3.1.1. Kết quả quét phổ dung dịch tretinoin 3.1.1. Kết quả quét phổ dung dịch tretinoin
Hình 3.1. Phổ hấp thụ tử ngoại của tretinoin
Tiến hành quét phổ dung dịch tretinoin nồng độ 10g/ml trong dung môi ethanol như mục 2.3.2.5 (phần a)
Từ kết quả quét phổ như trên và tham khảo tài liệu [27], chúng tôi quyết định chọn bước sóng 365nm để tiến hành định lượng tretinoin bằng phương pháp HPLC.
3.1.2. Xây dựng đường chuẩn biểu thị tương quan giữa diện tích pic với nồng độ tretinoin độ tretinoin
Tiến hành theo mục 2.3.2.5 (phần d). Kết quả thu được như sau:
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ dung dịch tretinoin
Bảng 3.1. Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ tretinoin
Nồng độ tretinoin (g/ml) Diện tích pic (mAU.s)
2,5 231,238 5 453,838 10 922,706 20 1756,012 40 3460,743 80 6630,467
Nhận xét: Kết quả cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic tại bước sóng 365nm và nồng độ tretinoin trong khoảng khảo sát từ 2,5 g/ml đến 80g/ml với hệ số tương quan hồi quy R2 = 0,9995 đảm bảo độ chính xác cho phương pháp HPLC.
3.1.3. Kết quả đánh giá tính tương thích hệ thống
Tiến hành theo mục 2.3.2.5 (phần c). Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.2. Kết quả đánh giá tính tương thích hệ thống
STT Diện tích pic (mAU.s) Thời gian lưu (s)
1 1056,229 8,369 2 1062,699 8,374 3 1060,614 8,347 4 1058,067 8,353 5 1059,803 8,326 6 1060,550 8,325 Trung bình 1059,482 8,354 SD 2,248 0,021 RSD (%) 0,212 0,248
Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký là diện tích pic và thời gian lưu lần lượt là 0,212% và 0,248% đều nằm trong khoảng giới hạn cho phép. Điều đó chứng tỏ tính phù hợp của hệ thống sắc ký đối với việc phân tích và định lượng tretinoin.
3.1.4. Kết quả đánh giá độ lặp lại
Tiến hành: theo mục 2.3.2.5 (phần e).
Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.3. Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp
STT Khối lượng gel (g) Diện tích pic (mAU×s) Hàm lượng tretinoin so với lý thuyết (%) 1 0,3669 943,524 104,923 2 0,3721 935,546 102,830 3 0,3681 929,758 103,055 4 0,3678 901,881 100,046 5 0,3688 932,134 103,122 6 0,3939 974,546 100,944 Trung bình 0.3728 936,232 102,487 SD 1,739 RSD (%) 1,696
Nồng độ tretinoin trong mẫu sắc ký là khoảng 10ppm nên theo tài liệu tham khảo [9], độ lặp lại chấp nhận được khi RSD không quá 7,3%. Theo kết quả như bảng trên, giá trị RSD là 1,7%, nằm trong khoảng cho phép. Như vậy phương pháp phân tích có độ lặp lại tốt, phù hợp với mục đích nghiên cứu.
3.2. KẾT QUẢ XÂY DỰNG CÔNG THỨC BÀO CHẾ
Qua tham khảo các tài liệu [1], [24], [26], chúng tôi xác định một số thành phần cơ bản của công thức gồm erythromycin (4,8%), tretinoin (0,028%), tá dược tạo gel, chất chống oxy hóa là BHT và sử dụng PG và glycerin để giữ ổn định thể chất của gel và tăng khả năng thấm của dược chất qua da.
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của dung môi và tá dược tạo gel
Các tá dược tạo gel được khảo sát là hydroxyethyl cellulose (HEC), hydroxypropylmethyl cellulose (HPMC), hydroxypropyl cellulose (HPC). Vì cả hai dược chất erythromycin và tretinoin đều không tan trong nước, tan tốt trong alcol nên chúng tôi tiến hành khảo sát các dung môi: hỗn hợp ethanol và nước cất, ethanol, isopropanol.
3.2.1.1. Khảo sát với tá dược tạo gel HEC
Bảng 3.4. Công thức khảo sát tá dược tạo gel HEC
STT Nguyên liệu CT1 (g) CT2 (g) CT3 (g) CT4 (g) 1 Erythromycin 4,8 4,8 4,8 4,8 2 Tretinoin 0,028 0,028 0,028 0,028 3 BHT 1 1 1 1 4 Propylen glycol 5 5 5 5 5 Glycerin 5 5 5 5 6 Acid citric 1 1 1 1 7 HEC 3 3 3 3 8 Ethanol 40 vđ 100g vđ 100g 0 9 IPA 0 0 0 vđ 100g 10 Nước cất vđ 100g 40 0 0
Tiến hành bào chế gel theo mục 2.3.1. Kết quả thu được như sau:
Công thức 1 và công thức 2:
Để HEC trương nở tạo gel, phải đun nóng.
Gel thu được có màu vàng nhạt, tương đối trong nhưng sau 1 ngày bị đục dần, có hiện tượng kết tủa. Nguyên nhân có thể do erythromycin và tretinoin không tan trong nước, lượng nước trong công thức khá lớn (gần 50%) đã làm các dược chất này bị kết tủa lại.
Công thức 3 và công thức 4: HEC khó tạo gel trong ethanol và IPA do tá
dược này không tan trong các dung môi ethanol, IPA.
3.2.1.2. Khảo sát với tá dược tạo gel HPMC