Tổng hợp ethyl 7-hydroxy-l-methyl-3,4-dihydroisoquinolin-3-

carboxylat.

3.3.1. Tiến hành phản ứng đóng vòng theo phương pháp Pictet-Spengler: Cho vào bìiứi cầu 2 cổ sạch gồm những chất sau: 5,4g (0,026 mol) chất (i),

50 ml CHCI3, 27ml HCHO và 45 ml HCl đặc.

Hỗn hợp được khuấy đều và đun ở 80-90°C trong lOh.

Sau khi phản ứng kết thúc, khối phản ứng được làm lạnh tới nhiệt độ phòng. Xuất hiện một lớp chất keo nhầy bám vào dưới đáy bình, chất keo này không tan trong nước và dung môi hữu cơ như CH2CI2.

Như vậy phản ứng đã không thu được sản phẩm mong muốn, có khả năng xảy ra phản ứng ngưng tụ giữa OH-phenol của (i) và HCHO tạo thành nhựa.

3.3.2. Tiến hành đóng vòng trong các điều kiện khác nhau trên cơ sở của phản ứng Bischler-Napieralski.

OC2H5

NHCOCH3

(ỉi)

3.3.2.1. Dùng benzen khan và POCI3

Lắp dụng cụ phản ứng gồm bình phản ứng, sinh hàn. Hòa l,2g

(4 ,7 8 m m o l) chất (ii) trong 5 m l benzen đã làm khan ( quan sát thấy (ii)

không tan trong benzen). Thêm 0,6 ml POCI3 (0,987g - 6,43 mmol). Đun hồi lưu trong 2h. Sau đó hỗn hợp được đổ vào nước đá, điều chỉnh về pH=8- 9 bằng NH3 đặc, tiếp đó chiết hỗn hợp với CH2CI2. Chấm sắc ký pha hữu cơ

31

không thấy có vết lạ. Như vậy phản ứng không chạy hay quá trình phản ứng không tạo ra được (iii).

3.3.2.2. Chỉ dùng tác nhân POCI3 [28].

Lắp dụng cụ gồm bình phản ứng, sinh hàn. Cho 0,2 g (0,8mmol) (ii) vào bình cầu, cho tiếp 5,43g POCI3 (3,3 ml) và khuấy ở 100°c dưới bầu khí N2. Sau Ih hỗn họp phản ứng được rót vào đá vụn (khoảng 40g). Lọc bỏ các tạp bẩn và điều chỉnh dịch lọc về pH=7-8 bằng NH3 đặc đồng thời làm lạnh ở 0-

l°c bằng hỗn hợp nước đá và muối ăn.

- Nếu tiếp tục nâng lên pH=10-l 1 thì thấy xuất hiện rất nhiều tủa trắng. Tủa này tan tốt trong nước, sắc ký bản mỏng với tủa không lên vết khi soi dưới đèn tử ngoại.

- Chiết dịch sau khi điều chỉnh pH=7-8 bằng CH2CI2. Chạy sắc ký bản mỏng trong nhiều hệ dung môi khác nhau thì chỉ có hệ n-butanol: acid

Acetic:H20=9:2:2,5 kéo được vết lên nhưng vết lại bị kéo dài, có thể nhóm

ester -COOC2H5 đã bị phân hủy thành nhóm chức acid -COOH.

Như vậy phản ứng này cũng có thể chưa tạo ra được dẫn chất isoquinolin- 3-carboxylat.

3.3.2.S. Dùng dung môi CHCI3 và tác nhân loại nước đóng vòng là POCI3

[19].

Lắp dụng cụ gồm bình phản ứng, sinh hàn. Cho vào bình phản ứng Ig (3,98 mmol) chất (ii) sau đó thêm 11,2 ml CHCl3(sôi ở 61,2°C), tiếp đó

thêm 2,lml POCI3 (3,36g). Hỗn hợp được hồi lưu trong 20h ở 67°c.

Dung môi sau phản ứng được loại đi bằng cất quay và sau đó được đổ vào nước đá, sau đó dịch phản ứng được đưa về pH=8-9 bằng Na2CƠ3 bão hòa.

Tiếp đó đem chiết hỗn hợp 3 lần bằng CH2CI2, làm khan dịch chiết bằng Na2SƠ4 khan.

Dịch chiết đem cất quay thu được dạng siro, nghiền dạng siro này với aceton, xuất hiện tủa.

Lọc tủa, dịch aceton được cất quay thu được dạng dầu.

Định tính sản phẩm bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi n-

butanol: acỉd Acetic: H20=9:2:2,5

Rf của sản phẩm =0,76.

Hình 6: Sơ đồ quy trình tổng hợp ethyl 7-hydroxy-l-methyl-3,4- dihydroisoquinolin-3-carboxylat.

3.4. Kết quả thử tác dụng chống đông in vivo của sản phẩm (iii) Tiến hành thử trên 5 chuột kliỏe mạnh (trọng lượng mỗi chuột=20g)

- Ống chứng chứa NaCl đẳng trương (kí hiệu O l)

- Hòa tan sản phẩm (iii) trong cồn được ống 2 (kí hiệu 02)

Tiêm phúc mạc chuột 2 mẫu ống chứng và ống thử thu được kết quả thời gian(tính bằng phút - kí hiệu p) đông máu dưới bảng sau:

Bảng 5: Với TB là thời gian trung bình và s là độ lệch chuẩn.

SI 1 Ống chứng (Ol) Ống thử 0 2 (Iml dich)

1 3,476p 8,25p ..2... ... 4,505p... ... 6,47p .. 3... ... 5,643p 9,28p ..4 ... 5,537p 7,53p 5 6,306p i,94p .TB... 5,0934p 8,09p ... 4,9314 5,1022

Nhìn vào bảng ta thấy thời gian đông máu của chuột được tiêm mẫu chứa sản phẩm cao hơn thời gian đông máu của chuột được tiêm nước muối sinh lý. Sơ bộ cho thấy sản phẩm (iii) có tác dụng chống đông.

Tính toán kết quả: dựa vào tính Test t

t= ( I X, - X2 I / ^/(S^+S\)

Với Xi, X2 lần lượt là giá trị thời gian trung bình của nhóm thử và nhóm chứng

n: số chuột đem thử

35

Tính toán thu được t= 2,115; với độ tin cậy 95% thì a=0.05 ứng với 1^2=1,96 thì t > ttó. do đó bác bỏ giả thuyết kiểm định Ho nên sản phẩm có tác dụng chống đông.

Kết luận: Với độ tin cậy 95% thì sản phẩm (iii) có tác dụng chổng đông, (kết luận này có ý nghĩa về mặt thống kê với độ tin cậy p=0,95).

3.5. Kết quả phân tích số liệu phổ các sản phẩm.

3.5.1. Phổ hồng ngoại IR

Chúng tôi đã tiến hành ghi phổ hồng ngoại IR trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-5000 cm’’ tại Viện Hóa Học - Viện Khoa Học và Công nghệ Việt Nam. Các phổ được trình bày ở phụ lục 1 và phụ lục 3.

Phân tích phổ đồ của các chất tổng họp được cho phép chúng tôi nhận biết được các dải hấp thụ đặc trưng của các dao động hóa trị, dao động biến dạng các nhóm chức và các liên kết điển hình có trong cấu trúc phân tử của chất mà chúng tôi tổng hợp được như: >NH, >c=0, -OH...

* Số liệu phổ của ethyl 2-acetamido-3-(4-hydroxyphenyl) propanoat (ii) Chất (ii) có các đỉnh hấp thụ đặc trưng cho nhóm >NH ( 3334,56 em '), nhóm > c = 0 ester (1725,60 cm '), nhóm > c = 0 amid (1657,50 cm ' ), nhóm OH- phenol (3527,75 cm'*).

* Số liệu phổ của ethyl 7-hydroxy-l-methyl-3,4-dihydroisoquinolin-3- carboxylat (iii)

Chất (iiì) có các đỉnh hấp thụ đặc trưng cho nhóm > c = 0 ester (1740,93 em’ 1664,8 em '), nhóm OH- phenol (3427,56 cm ')

Bảng 6; số liệu phổ của các chất;

Nhóm D max (cm‘')

Chât (ii) Chât (iii)

>NH 3334,56

> c = 0 ester 1725,60 1740,93; 1664,8.

> c = 0 amid 1657,50

OH-phenol 3527,75 3427,56

Nhận xét; Cả chất (ii) và chất (iii) đều có các đỉnh hấp thụ đặc trưng cho nhóm > c= 0 ester và nhóm OH- phenol.

Chất (ii) là sản phẩm của phản ứng acyl hóa chất ethyl 2-amino- 3-(4-hydroxyphenyl) propanoat có đỉnh hấp thụ đặc trưng cho nhóm >NH (amid thế 1 lần), > c = 0 amid.

3.5.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ' H-NMR

Chúng tôi tiến hành ghi phổ ' H-NMR tại phòng đo ’ H-NMR Viện Hóa Học-Viện Khoa Học và Công nghệ Việt Nam. Dữ liệu ghi trên phổ cho phép chúng ta xác định số lưọng H trong phân tử chất đem đo về vị trí và tính chất của các proton này. Qua đó kết luận sơ bộ chất đem đo có cùng công thức phân tử với chất dự kiến hay không.

Phổ đồ được trình bày ở phụ lục 2.

Kết quả phân tích phổ 'H-NMR của ethyl 2-acetamido-3-(4- hydroxyphenyl) propanoat cho thấy sự có mặt của các proton phù hợp với công thức của chất mong muốn.

37

Bảng 7: số liệu phổ 'H-NMR của ethyl 2-acetamido-3-(4-hydroxyphenyl) propanoat

Công thức câu tạo Kêt quả phân tích

0 H 10 " ■ £ 4 . OH 6 1,21(3H, t , C l l H3) 1,93(3H, s, COCH3) 2,87( IH, d d , C3-Ha) 3,03( IH, d d , C3-Hb ) 4,13(2H, m ,C1 0-H2 ) 4,51 { lH,t, C2-H) 6,72( 2H, d , C6-H+C8-H ) 7,02( 2H, d , C5-H+C9-H ) 3.6. Bàn luân 3.6.1. về các phản ứng hóa học

3.6.1.1. Phản ứng ester hóa L-tyrosin

HO' 0 NH2 1.C2H5OH 2.H2SO4 HO' 0C2H5 (i)

Đây là phản ứng thuận nghịch, dựa vào nguyên lý Losatolie để tăng hiệu suất phản ứng có thể dùng dư nguyên liệu ban đầu hoặc loại chất tạo thành trong khối phản ứng. Vì vậy chúng tôi đã dùng dư nguyên liệu ban đầu, lượng C2H5OH được dùng gấp khoảng 92 lần so với lưọng Tyrosin. Để cân bằng chuyển dịch theo chiều thuận tạo sản phẩm (i).

H2SO4 được dùng với vai trò chính là cung cấp proton làm xúc tác cho phản ứng ester hóa.

Đồng thời chúng tôi đã khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất của phản ứng nhằm thu được hiệu suất tối ưu: Giữ nguyên các điều kiện như: tỷ lệ mol của nguyên liệu, nhiệt độ... thay đổi thời gian đun hồi lưu 6h, 8h,

1 2h, 14h nhận thấy hiệu suất phản ứng tỷ lệ thuận với thời gian, nhưng chỉ đến một giới hạn nhất định thì hiệu suất phản ứng hầu như không tăng thêm nữa. Chúng tôi đã lựa chọn được thời gian tối ưu cho phản ứng là 12h, hiệu suất phản ứng đạt 61,2%.

ở phản ứng ester đã tìm được điều kiện đơn giản để tinh chế sản phẩm; sau khi ester hóa nhóm - COOH chuyển thành -COOC2H5, còn lại nhóm chức NH2 do đó sản phẩm (i) sẽ dễ dàng tủa trong môi trường kiềm vì vậy thu sản phẩm bằng cách điều chỉnh pH về 8-9 bằng NaiCOs bão hòa.

3.6.1.2. Phản ứng acyỉ hóa chất (i)

- Phản ứng acyl hóa chất (i) sử dụng tác nhân acyl hóa mạnh là (CH3C0 ) 2 0 trong môi trường kiềm yếu NaHCOs, đồng thời đây là phản ứng tỏa nhiệt nên thực hiện phản ứng ở điều kiện lạnh; nhiệt độ 0°c, tránh phân hủy tác nhân (CH3C0 ) 2 0 kết họp nhỏ từ từ tác nhân (CH3C0 ) 2 0 vào hỗn hợp phản ứng tạo điều kiện thuận lợi cho phản ứng xảy ra nhằm thu được hiệu suất phản ứng cao.

Chúng tôi đã khảo sát ảnh hưcmg của tỷ lệ mol ni:n(CH3C0)20 đến hiệu suất của phản ứng nhận thấy với tỷ lệ mol nị:n(CH3C0)20 =1:2,5 thì hiệu suất phản ứng là cao nhất đạt 52%.

Quá trình thực hiện phản ứng đơn giản, nguyên liệu đầu dễ dàng được loại đi bằng HCl loãng ở nhiệt độ lạnh do đó thuận lợi cho việc tinh chế sản phẩm.

39

3.6.1.3. Phản ứng đóng vòng tạo chất (iii) - Theo phưong pháp Bischler-Napieralski:

+ Dùng dung môi Benzen khan, tác nhân loại nước đóng vòng là POCI3

hoặc chỉ dùng POCI3, phản ứng được thực hiện trong bầu khí N2 đều không tạo ra được sản phẩm hoặc sản phẩm bị phân hủy.

+ Dùng dung môi CHCI3, tác nhân loại nước đóng vòng là POCI3:

Trong thời gian phản ứng theo dõi phản ứng xảy ra bằng sắc ký lớp mỏng và soi dưới đèn ư v thấy vết nguyên liệu đầu mờ dần đồng thời vết sản phẩm đậm dần lên.

Sau quá trình tinh chế thu được duy nhất sản phẩm (iii), với Rf= 0,76;

đây là phương pháp duy nhất thu được sản phẩm. - Theo phương pháp Pictet-Spengler:

Phản ứng không thành công do xảy ra phản ứng trùng ngưng giữa OH- phenol chất (i) với HCHO tạo thành nhựa.

3.6.2. v ề phổ của các chất.

- Phổ IR: đều cho các đỉnh hấp thụ đặc trưng của các nhóm chức như: >NH, > c = 0 ester, > c = 0 amid, OH-phenol của ethyl 2-acetamido-3-(4- hydroxyphenyl) propanoat; > c = 0 ester, OH-phenol của ethyl 7-hydroxy-l- methyl-3,4-dihydroisoquinolin-3-carboxylat.

- Phổ ’H-NMR; cho phép xác định chính xác cấu trúc của chất thông qua xác định số proton. Chất đem xác định cho kết quả phù hợp với cấu trúc của chất mong muốn

KÉT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT

Kết luân:

Từ những thí nghiệm thực hiện trong khóa luận, chúng tôi đã thu được một số kết quả sau;

1. Đã tổng họfp được ethyl 7-hydroxy-l-methyl-3,4-dihydroisoquinolin-3- carboxylat từ nguyên liệu đầu là Tyrosin trên cơ sở phản ứng Bischler- Napieralski qua 3 giai đoạn. Các sản phẩm trung gian cũng như sản phẩm cuối cùng đã được xác định bằng phương pháp: sắc ký lớp mỏng, đo nhiệt độ nóng chảy, phân tích phổ IR, ’H-NMR.

2. Đã thử được tác dụng chống đông máu in vivo của hợp chất ethyl 7- hydroxy- 1 -methyl-3,4-dihydroisoquinolin-3-carboxylat.

Đề xuất:

1. Khảo sát thêm các điều kiện thí nghiệm, các tác nhân hóa học khác nhau nhằm tổng hợp dẫn chất isoquinolin-3-carboxylat đạt hiệu suất cao hơn. 2. Khảo sát phản ứng tổng hợp dẫn chất isoquinolin-3-carboxylat từ các nguồn nguyên liệu phổ biến trong thiên nhiên khác ngoài Tyrosin.

3. Cải tiến quy trình thực hiện và một số điều kiện thí nghiệm để có thể triển khai ở quy mô lớn hon.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG ANH

1. Bentley Kanneth w. (1998), The Isoquinolines Alkaloid, Harwood Acedamic Publisher.

2. Birkle D.L (1987), "Effect of Bicuculline-induced status epilepticus on prostaglanins and hydroxyeicosatetraenoic acids in rat brain subcelluular fraction", J. Neurochem., 48(6), p.l76.

3. Cong Liu, James B. Thomas, Larry Brieaddy, Bertold Berrang, F.Ivy Carroll (2007), "An improved synthesis of (3R)-2-(tert-Butoxycarbonyl)-7-hydroxy-

l,2,3,4-tetrahyroisoquinoline-3-carboxylic acid", Organic and Medicinal Chemistry, Research Triangle Institute, Research Triangle Park, NC 27709, USA.

4. Dale L. Boger, Christine E.Brotherton and Marshall p.kelley(1981), "A simplified isoquinolline synthesis", Tetrahydron, Vol 37, No 23, pp.3977- 3980.

5. DiMaio, John(2000)," Isoquinolines useful as analgesics", Astra AB.

6. Elvin L. Anderson, James w . Wilson, Glenn E. Ullyot(1952), " Isoquinoline derivatives as local anesthetics", Journal o f the American Pharmacetỉcaỉ Association, Volume 41, p.643-650.

7. Eugene A. Mash, Lawrene J. William, and Steven s. Pfeiffer (1997), "Synthesis of ethyl N-( Diphenyl ) methyl 1,2,3,4-tetrahydro isoquinoiine-3- carboxylates ", Tetrahedron Letters, Vol.38, pp.6977-6980.

8. Iwasa Kinuko(2001)," Simple Isoquinoline and Benzylisoquinoline Alkaloids as Potential Antimicrobial, Antimalarial, Cytotoxic, and Anti-HIV Agents",

Bioorganic & Medical Chemistry, Vol.9, Issue 11, p. 2871-2884.

121-128.

11. King Fahd University of Petroleum and Minerals, ''Polycyclic and

heterocyclic Aromatic Compounds’’', Chemistry Department, Saudi Arabia. 12. Manske R.H.F. (1967), The alkaloids: chemistry and physiology. Academic

Press Inc, Vol 9, p. 117-123.

13. Meiging Zhing, Yifan Yang, ming Zhao, Xiaoyi Zhang, Jianhui Wu, Gong Chen, Li Peng, Yui Wang, Shigi Peng(2011), "A class of Novel N- Isoquinoline-3-carbonyl-L-amino acid Benzylesters: synthesis. Anti-tumor, Evalution and 3D QSAR Analysis", European Journal o f Medicinal Chemistry.

14. Omstein, Paul Leslie(2007), " Ester derivatives o f a dacehydroisoquinoline- 3-carboxylic acid as analgestics ", Eli Lily and Company(lndianapolis, IN). 15. Samuel Samnick, Ursula Nestle, Mathias Wager, Thierry Fozing, Andrea

Schaefer, Michael D. Menger, Carl-Martin Kirsch(2006), " Validation of 8- ['^^I]iodo-L-l,2,3,4-tetrahydro-7-hydroxy isoquinolin-3-carboxylic acid as an imaging agent for prostate cancer in experimental model of human prostate cancer ", Nuclear Medicine and Biology 34, p.99-107.

16. Sandra Marie Jennings, Gregory, MI(2005), "Preparation of Quinapril hydrochloride", United States Patent.

17. Shenling Cheng, Xiaoyi Zhang, Wei Wang, Ming Zhao, Meiqing Zheng, Heng Wei Chang, Jianghui Wu, Shiqi Peng(2009), " A class of novel N-(3S-

1,2,3,4-tetrahydro isoquinolin-3-carbonyl)-L-amino acid derivatives: their synthesis, anti-thrombotic activity evaluation, and 3D QSAR analysis",

European Journal o f Medicinal Chemistry44, pp .4904-4919.

18. Shital K. Chattopadhyay, Susama Maity, Benoy K. Pal and Srikanta Panja(2002), "A new (3+3) annulation route to isoquinolin-3-carboxylates".

Tetrahedron Letters 43, p.5079-5081.

19. Silvio. J. Martines, Lesley Larsen, Jonathan D. Street, and John A. Joule(2011), "Synthesis of 6-hydroxy-1,4-dimethyl isoquinoline and of ethyl 7-

hydroxy-6-methoxy-1-methyl isoquinoline-3-carboxylate", Chemistry

Department, Manchester University, Manchester M 139 PL.

20. Siuciak Judith A. (2006), "Inhibition of the striatum-enriched

phosphodiesterase PDEioa^ A novel approach to the treatment of psychosis". Neuropharmacology, Vol 51, p.386-396.

21. Steward Alfred W. (2007), Recent Advances in Organic Chemistry,

Longmans Green and Co., p. 197..

22. Surachai Nimgirawath and Somsak Kaewket(1981), "The Pictet-Spengler

reaction of aryl glyoxals: a conventent synthesis ofl-aroyl-1,2,3,4

tertahydroisoquinoline”, J. Sci. Soc. Thailand, 8, pp. 167-169.

23. Uff Barrie C. (1988), “Alkylation of Isoquinoline via 2-benzoyl-l,2- dihydroisoquinaldonitriles: 1-benzylisoquinoline”, Organic Synthesis, Coll. Vol. 6, p. 115.

24. University of Illinois (2009), “ Isoquinoline and benzylisoquinoline Alkaloids”, Intergrative Biology- Lecture Notes,425,Ubana-Champaign.

25. William Thomas, Brady (1957), "The synthesis of O-methyl-N-acetyl-L- tyrosine" Master's thesis, California Institute o f Technology.

26. Xiang Wei Liao, Bao He Guan, Zhan Zhu Liu(2007), "A new and efficient method for the synthesis of isoquinolin-3-carboxylate", Chinese Chemical Lettersl9, p.253-255.

27. Xiaoyi Zhang, Wei Wang, Shenling Cheng, Ming Zhao. Melqing zhing, heng Wei Chang(2010), "2,3-diamino acid mofifying 3S-tetrahydroisoquinoline-3- carboxylic acid: leading to a class of novel agebts with highly inforded conformation, selective in vitro anti-platalet aggregation and potent in vivo

Total synthesis of (±)-a-Narcotine via Bischler- Napieralski cyclization", Acta Chimica Hungarica, 128(6), pp.831-837.

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Phổ hồng ngoại của ethyl 2-acetamido-3-(4- hydroxyphenyl) propanoat.

Phụ lục 2: Phổ cộng hưởng từ ^H-NMR của ethyl 2-acetamido- 3-(4-hydroxyphenyl) propanoat.

Phụ lục 3: Phổ hồng ngoại của ethyl 7-hydroxy-1-methy 1-3,4- dihydroisoquinolin-3 carboxylat.

A b o r b va- n c e 18 16 1.4 1 2 1 0 0.8 0.6 0.4 0 2 0 0 4000 29t32.48 3500

Date: Fri Apr 22 02:59:63 2011 Scam: 32

Resolution: 4.000

3000 2600 2000

Wavenumbers (cnv1) SP Acyl Ethyl ester KBr

ị 54^ ÍS3 _ Ị ị ' V: í- ' "•L1 ^ J M 14ầ,.2r’ íl ì I ỉ ! il l:j pâ •c 'ự o 1500 1000

llj' I üèï î f j s l ■ ï d I i s