- Sử dụng phưong pháp Bischler-Napieralski, Pictet- Spengler để tổng hợp dẫn chất isoquinolin-3-carboxylat.
- Sử dụng các phương pháp vật lý và hoá học để chiết tách và tinh chế sản phẩm.
21
tích phổ hồng ngoại, phổ cộng hưỏng từ ’H-NMR.
- Xác định độ tinh khiết của các chất dựa vào phưoTig pháp đo nhiệt độ nóng chảy và phương pháp sắc ký lóp mỏng.
- Thử tác dụng chổng đông máu của sản phẩm tạo thành.
So sánh thời gian đông máu khi tiêm phúc mạc chuột với nước muối sinh lý và dung dịch trong cồn của sản phẩm.
Phưong pháp: kiểm định thống kê Test t
Đặt giả thuyết kiểm định là Ho nghĩa là nhóm chứng và nhóm thử không khác nhau ( Xi = X2 )
X , - ^ 2
Trong đó Xi là giá trị trung bình của nhóm chứng ( dùng NaCl 0.9% ) X2 là giá trị trung bình của nhóm thử (dùng dung dịch sản phẩm)
S| S2 là độ lệch chuẩn tương ứng của nhóm chứng và nhóm thử ĨI], n2 tương ứng là số lượng mẫu chứng và mẫu thử.
với độ tin cậy 95%, a= 0,05 thì ti.a/2 =1,96. Nếu t > ti.a/2thì bác bỏ giả thuyết Ho
Chương III. THựC NGHIỆM, KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Sơ đồ quá trình tổng hợp: HO" o NH2 C 2 H 5 O H H 2 S O 4 H O " o NH2 NaHC0 3/(C2H5)20 (CH3C0 ) 2 0 o u Kìunr H O O C 2 H 5 N H C O C H 3 C H 3 C I POCU Ethyl 7 -h y d r o x y -ím e th y l-3 ,4 dihydro isoquinolin-3-carboxylat
Hình /: Sơ đồ quá trình tổng họp dẫn chất isoquinolin-3-carboxylat. 3.1. Tổng hợp ethyl 2-amino-3-(4-hydroxyphenyl) propanoat (i)
Tyrosin I.C2H5OH 2.H2SO4 HO 0 \ OC2H5 NHo (i)
Lắp dụng cụ gồm bình 1 cổ, sinh hàn, bếp khuấy từ. Cho vào bình 1 cổ 5g tyrosin (0,028 mol), thêm 150 ml (2,57 mol) cồn tuyệt đối sau đó thêm 5 ml H2SO4 đặc, khuấy kĩ để hòa tan đồng thời đun hồi lưu cách dầu.
Hỗn hợp sau phản ứng có màu vàng chanh nhạt.
Sau khi kết thúc phản ứng, để nguội bình phản ứng về nhiệt độ phòng. Tiến hành cất quay hỗn hợp phản ứng đến dạng siro. Hòa tan siro vào một
23
lượng nước cất vừa đủ. Làm lạnh đồng thời điều chỉnh pH về 8-9 bằng Na2C0 3 bão hòa để kết tủa sản phẩm. Lọc tủa, tinh chế lại bằng cách hòa tan trong HCl IM, điều chỉnh pH về 8-9 bằng Na2CƠ3 bão hòa cùng với điều kiện làm lạnh. Lọc, rửa tủa với nước cất (2 lần) và sấy thu được (i).
Hệ dung môi chạy sắc ký n-Butanol:AcOH:H2 0=9 ;2 :2 , 5
Sơ đồ quy trình phản ứng được tóm tắt như hình 2
* Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất của phản ứng, chúng tôi
thu được kết quả sau:
Bảng 3: Khảo sát thời gian phản ứng
STT Thời gian phản ứng Lượng sản
phẩm(gam-g) Hiệu suât phản ứng (%) 1 6h l,61g 27,93% 2 8h 2,57g 44,46% 3 1 2h 3,53g 61,2% 4 14h 3,54g 61,37% Thời gian phản ứng
Từ kết quả trên cho thấy thời gian phản ứng tăng thì hiệu suất phản ứng cũng tăng nhưng đến một thời điểm nhất định (1 2h), nếu ta tiếp tục tăng thời gian thì hiệu suất phản ứng hầu như không tăng thêm nữa. Vì vậy chúng tôi chọn thời gian tối ưu khi đun hồi lưu cho phản ứng ester là 1 2 giờ.
* Kết quả:
- Khối lượng sản phẩm thu được msp=3,53g
-Hiệu suất H= 61,2%
- Nhiệt độ nóng chảy tnc=103,2-104,6°c.
- R f = 0,632.
25
Hình 3: Sơ đồ quy trình tổng hợp ethyl 2-amino-3-(4-hydroxyphenyl) propanoat.
3.2. Tổng hợp ethyl 2-acetamido-3-(4-hydroxyphenyl) propanoat (ii)
OCoH2^5 1.NaHC0 3/(C2H5 ) 2 0
2. (CH3C0 ) 2 0
OC2H5 NHCOCH3
Lắp bộ dụng cụ gồm bình cầu 3 cổ, máy khuấy từ, nhiệt kế. Tạo hỗn dịch của 3g (0,014 mol) chất (i) với 56 ml diethyl ether, sau đó rót vào bình 3 cổ có chứa 69 ml NaHCOs bão hòa.
Làm lạnh hỗn hợp xuống 0-1 bằng hỗn họp nước đá và muối ăn (kiểm
tra bằng nhiệt kế). Duy trì nhiệt độ này và nhỏ giọt chậm (CH3C0 ) 2 0 vào hỗn hợp, sau đó khuấy thêm 30 phút nữa.
Kết thúc phản ứng thu được tủa mịn. Lọc tủa, hòa tan vào dung dịch HCl 0,2M lạnh để loại nguyên liệu đầu có thể còn. Tiếp tục tiến hành lọc và rửa
2 lần bằng nước đá để lấy tủa.
Sấy nhẹ hoặc để trong bình hút ẩm thu được (ii).
Hệ dung môi chạy sắc ký n-Butanol:AcOH:H2 0=9 :2 :2 ,5.
* Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol giữa chất ethyl 2-amino-3-(4- hydroxyphenyl) propanoat (i) và tác nhân anhydrid acetic đến hiệu suất phản ứng.
27
Bảng 4: Khảo sát tỷ lệ mol của phản ứng.
STT Lượng chất i (g) Thê tích (CH3C0 ) 2 0 (V ml) Tỷ lệ rnol nj:n(CH3C0 ) 2 0 Lượng sản phẩm (g) Hiệu suât phản ứng ( % ) 1 3g 1,3 m l 1 : 1 l,08g 30% 2 3g 2 , 0 ml 1:1,5 l,4g 38,9% 3 3g 2,7 ml 1 : 2 l,62g 45,1% 4 3g 3,3 ml 1:2,5 l,87g 52% 5 3g 4,0 ml 1:3 l,8 8g 52,3% 60% 50% ”t r § t i s ă w 8 ' " ' i i í l S S i l t ■| | | ^ ^
Hình 4: Biểu đồ khảo sát ảnh hưỏng của tỷ lệ mol riị: n (CHịC0)20 đến hiệu suất phản ứng acyl.
Nhận xét:
Từ kết quả trên cho thấy khi tăng tỷ lệ mol giữa chất (i) và tác nhân anhydrid acetic thì hiệu suất của phản ứng acyl hóa tăng. Nhưng hiệu suất của phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhất định thì không tăng nữa. Hiệu
suất đạt tối đa khi tỷ lệ /7/; n (CH3C0)20=\'.2,5. Vì vậy chúng tôi chọn tỷ lệ mol tối ưu cho phản ứng acyl là n (CH3CO)20=1:2,5.
*Kết quả:
- Khối lưọng sản phẩm thu được nisp =l,87g - Hiệu suất phản ứng H=52%
- Nhiệt độ nóng chảy tnc=78,7-80,9”c. -R<^0,93.
Sản phẩm được chứng minh cấu trúc bằng phổ hồng ngoại IR và phổ cộng hưởng từ hạt nhân ' H-NMR.
29
Hĩnh 5: Sơ đồ quy trĩnh tổng hợp ethyl 2-acetamido-3-(4-hydroxyphenyl) propanoat.
3.3. Tổng hợp ethyl 7-hydroxy-l-methyl-3,4-dihydroisoquinolin-3- carboxylat. carboxylat.
3.3.1. Tiến hành phản ứng đóng vòng theo phương pháp Pictet-Spengler: Cho vào bìiứi cầu 2 cổ sạch gồm những chất sau: 5,4g (0,026 mol) chất (i),
50 ml CHCI3, 27ml HCHO và 45 ml HCl đặc.
Hỗn hợp được khuấy đều và đun ở 80-90°C trong lOh.
Sau khi phản ứng kết thúc, khối phản ứng được làm lạnh tới nhiệt độ phòng. Xuất hiện một lớp chất keo nhầy bám vào dưới đáy bình, chất keo này không tan trong nước và dung môi hữu cơ như CH2CI2.
Như vậy phản ứng đã không thu được sản phẩm mong muốn, có khả năng xảy ra phản ứng ngưng tụ giữa OH-phenol của (i) và HCHO tạo thành nhựa.
3.3.2. Tiến hành đóng vòng trong các điều kiện khác nhau trên cơ sở của phản ứng Bischler-Napieralski.
OC2H5
NHCOCH3
(ỉi)
3.3.2.1. Dùng benzen khan và POCI3
Lắp dụng cụ phản ứng gồm bình phản ứng, sinh hàn. Hòa l,2g
(4 ,7 8 m m o l) chất (ii) trong 5 m l benzen đã làm khan ( quan sát thấy (ii)
không tan trong benzen). Thêm 0,6 ml POCI3 (0,987g - 6,43 mmol). Đun hồi lưu trong 2h. Sau đó hỗn hợp được đổ vào nước đá, điều chỉnh về pH=8- 9 bằng NH3 đặc, tiếp đó chiết hỗn hợp với CH2CI2. Chấm sắc ký pha hữu cơ
31
không thấy có vết lạ. Như vậy phản ứng không chạy hay quá trình phản ứng không tạo ra được (iii).
3.3.2.2. Chỉ dùng tác nhân POCI3 [28].
Lắp dụng cụ gồm bình phản ứng, sinh hàn. Cho 0,2 g (0,8mmol) (ii) vào bình cầu, cho tiếp 5,43g POCI3 (3,3 ml) và khuấy ở 100°c dưới bầu khí N2. Sau Ih hỗn họp phản ứng được rót vào đá vụn (khoảng 40g). Lọc bỏ các tạp bẩn và điều chỉnh dịch lọc về pH=7-8 bằng NH3 đặc đồng thời làm lạnh ở 0-
l°c bằng hỗn hợp nước đá và muối ăn.
- Nếu tiếp tục nâng lên pH=10-l 1 thì thấy xuất hiện rất nhiều tủa trắng. Tủa này tan tốt trong nước, sắc ký bản mỏng với tủa không lên vết khi soi dưới đèn tử ngoại.
- Chiết dịch sau khi điều chỉnh pH=7-8 bằng CH2CI2. Chạy sắc ký bản mỏng trong nhiều hệ dung môi khác nhau thì chỉ có hệ n-butanol: acid
Acetic:H20=9:2:2,5 kéo được vết lên nhưng vết lại bị kéo dài, có thể nhóm
ester -COOC2H5 đã bị phân hủy thành nhóm chức acid -COOH.
Như vậy phản ứng này cũng có thể chưa tạo ra được dẫn chất isoquinolin- 3-carboxylat.
3.3.2.S. Dùng dung môi CHCI3 và tác nhân loại nước đóng vòng là POCI3
[19].
Lắp dụng cụ gồm bình phản ứng, sinh hàn. Cho vào bình phản ứng Ig (3,98 mmol) chất (ii) sau đó thêm 11,2 ml CHCl3(sôi ở 61,2°C), tiếp đó
thêm 2,lml POCI3 (3,36g). Hỗn hợp được hồi lưu trong 20h ở 67°c.
Dung môi sau phản ứng được loại đi bằng cất quay và sau đó được đổ vào nước đá, sau đó dịch phản ứng được đưa về pH=8-9 bằng Na2CƠ3 bão hòa.
Tiếp đó đem chiết hỗn hợp 3 lần bằng CH2CI2, làm khan dịch chiết bằng Na2SƠ4 khan.
Dịch chiết đem cất quay thu được dạng siro, nghiền dạng siro này với aceton, xuất hiện tủa.
Lọc tủa, dịch aceton được cất quay thu được dạng dầu.
Định tính sản phẩm bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi n-
butanol: acỉd Acetic: H20=9:2:2,5
Rf của sản phẩm =0,76.
Hình 6: Sơ đồ quy trình tổng hợp ethyl 7-hydroxy-l-methyl-3,4- dihydroisoquinolin-3-carboxylat.
3.4. Kết quả thử tác dụng chống đông in vivo của sản phẩm (iii) Tiến hành thử trên 5 chuột kliỏe mạnh (trọng lượng mỗi chuột=20g)
- Ống chứng chứa NaCl đẳng trương (kí hiệu O l)
- Hòa tan sản phẩm (iii) trong cồn được ống 2 (kí hiệu 02)
Tiêm phúc mạc chuột 2 mẫu ống chứng và ống thử thu được kết quả thời gian(tính bằng phút - kí hiệu p) đông máu dưới bảng sau:
Bảng 5: Với TB là thời gian trung bình và s là độ lệch chuẩn.
SI 1 Ống chứng (Ol) Ống thử 0 2 (Iml dich)
1 3,476p 8,25p ..2... ... 4,505p... ... 6,47p .. 3... ... 5,643p 9,28p ..4 ... 5,537p 7,53p 5 6,306p i,94p .TB... 5,0934p 8,09p ... 4,9314 5,1022
Nhìn vào bảng ta thấy thời gian đông máu của chuột được tiêm mẫu chứa sản phẩm cao hơn thời gian đông máu của chuột được tiêm nước muối sinh lý. Sơ bộ cho thấy sản phẩm (iii) có tác dụng chống đông.
Tính toán kết quả: dựa vào tính Test t
t= ( I X, - X2 I / ^/(S^+S\)
Với Xi, X2 lần lượt là giá trị thời gian trung bình của nhóm thử và nhóm chứng
n: số chuột đem thử
35
Tính toán thu được t= 2,115; với độ tin cậy 95% thì a=0.05 ứng với 1^2=1,96 thì t > ttó. do đó bác bỏ giả thuyết kiểm định Ho nên sản phẩm có tác dụng chống đông.
Kết luận: Với độ tin cậy 95% thì sản phẩm (iii) có tác dụng chổng đông, (kết luận này có ý nghĩa về mặt thống kê với độ tin cậy p=0,95).
3.5. Kết quả phân tích số liệu phổ các sản phẩm.
3.5.1. Phổ hồng ngoại IR
Chúng tôi đã tiến hành ghi phổ hồng ngoại IR trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-5000 cm’’ tại Viện Hóa Học - Viện Khoa Học và Công nghệ Việt Nam. Các phổ được trình bày ở phụ lục 1 và phụ lục 3.
Phân tích phổ đồ của các chất tổng họp được cho phép chúng tôi nhận biết được các dải hấp thụ đặc trưng của các dao động hóa trị, dao động biến dạng các nhóm chức và các liên kết điển hình có trong cấu trúc phân tử của chất mà chúng tôi tổng hợp được như: >NH, >c=0, -OH...
* Số liệu phổ của ethyl 2-acetamido-3-(4-hydroxyphenyl) propanoat (ii) Chất (ii) có các đỉnh hấp thụ đặc trưng cho nhóm >NH ( 3334,56 em '), nhóm > c = 0 ester (1725,60 cm '), nhóm > c = 0 amid (1657,50 cm ' ), nhóm OH- phenol (3527,75 cm'*).
* Số liệu phổ của ethyl 7-hydroxy-l-methyl-3,4-dihydroisoquinolin-3- carboxylat (iii)
Chất (iiì) có các đỉnh hấp thụ đặc trưng cho nhóm > c = 0 ester (1740,93 em’ 1664,8 em '), nhóm OH- phenol (3427,56 cm ')
Bảng 6; số liệu phổ của các chất;
Nhóm D max (cm‘')
Chât (ii) Chât (iii)
>NH 3334,56
> c = 0 ester 1725,60 1740,93; 1664,8.
> c = 0 amid 1657,50
OH-phenol 3527,75 3427,56
Nhận xét; Cả chất (ii) và chất (iii) đều có các đỉnh hấp thụ đặc trưng cho nhóm > c= 0 ester và nhóm OH- phenol.
Chất (ii) là sản phẩm của phản ứng acyl hóa chất ethyl 2-amino- 3-(4-hydroxyphenyl) propanoat có đỉnh hấp thụ đặc trưng cho nhóm >NH (amid thế 1 lần), > c = 0 amid.
3.5.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ' H-NMR
Chúng tôi tiến hành ghi phổ ' H-NMR tại phòng đo ’ H-NMR Viện Hóa Học-Viện Khoa Học và Công nghệ Việt Nam. Dữ liệu ghi trên phổ cho phép chúng ta xác định số lưọng H trong phân tử chất đem đo về vị trí và tính chất của các proton này. Qua đó kết luận sơ bộ chất đem đo có cùng công thức phân tử với chất dự kiến hay không.
Phổ đồ được trình bày ở phụ lục 2.
Kết quả phân tích phổ 'H-NMR của ethyl 2-acetamido-3-(4- hydroxyphenyl) propanoat cho thấy sự có mặt của các proton phù hợp với công thức của chất mong muốn.
37
Bảng 7: số liệu phổ 'H-NMR của ethyl 2-acetamido-3-(4-hydroxyphenyl) propanoat
Công thức câu tạo Kêt quả phân tích
0 H 10 " ■ £ 4 . OH 6 1,21(3H, t , C l l H3) 1,93(3H, s, COCH3) 2,87( IH, d d , C3-Ha) 3,03( IH, d d , C3-Hb ) 4,13(2H, m ,C1 0-H2 ) 4,51 { lH,t, C2-H) 6,72( 2H, d , C6-H+C8-H ) 7,02( 2H, d , C5-H+C9-H ) 3.6. Bàn luân 3.6.1. về các phản ứng hóa học
3.6.1.1. Phản ứng ester hóa L-tyrosin
HO' 0 NH2 1.C2H5OH 2.H2SO4 HO' 0C2H5 (i)
Đây là phản ứng thuận nghịch, dựa vào nguyên lý Losatolie để tăng hiệu suất phản ứng có thể dùng dư nguyên liệu ban đầu hoặc loại chất tạo thành trong khối phản ứng. Vì vậy chúng tôi đã dùng dư nguyên liệu ban đầu, lượng C2H5OH được dùng gấp khoảng 92 lần so với lưọng Tyrosin. Để cân bằng chuyển dịch theo chiều thuận tạo sản phẩm (i).
H2SO4 được dùng với vai trò chính là cung cấp proton làm xúc tác cho phản ứng ester hóa.
Đồng thời chúng tôi đã khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất của phản ứng nhằm thu được hiệu suất tối ưu: Giữ nguyên các điều kiện như: tỷ lệ mol của nguyên liệu, nhiệt độ... thay đổi thời gian đun hồi lưu 6h, 8h,
1 2h, 14h nhận thấy hiệu suất phản ứng tỷ lệ thuận với thời gian, nhưng chỉ đến một giới hạn nhất định thì hiệu suất phản ứng hầu như không tăng thêm nữa. Chúng tôi đã lựa chọn được thời gian tối ưu cho phản ứng là 12h, hiệu suất phản ứng đạt 61,2%.
ở phản ứng ester đã tìm được điều kiện đơn giản để tinh chế sản phẩm; sau khi ester hóa nhóm - COOH chuyển thành -COOC2H5, còn lại nhóm chức NH2 do đó sản phẩm (i) sẽ dễ dàng tủa trong môi trường kiềm vì vậy thu sản phẩm bằng cách điều chỉnh pH về 8-9 bằng NaiCOs bão hòa.
3.6.1.2. Phản ứng acyỉ hóa chất (i)
- Phản ứng acyl hóa chất (i) sử dụng tác nhân acyl hóa mạnh là (CH3C0 ) 2 0 trong môi trường kiềm yếu NaHCOs, đồng thời đây là phản ứng tỏa nhiệt nên thực hiện phản ứng ở điều kiện lạnh; nhiệt độ 0°c, tránh phân hủy tác nhân (CH3C0 ) 2 0 kết họp nhỏ từ từ tác nhân (CH3C0 ) 2 0 vào hỗn hợp phản ứng tạo điều kiện thuận lợi cho phản ứng xảy ra nhằm thu được hiệu suất phản ứng cao.
Chúng tôi đã khảo sát ảnh hưcmg của tỷ lệ mol ni:n(CH3C0)20 đến hiệu suất của phản ứng nhận thấy với tỷ lệ mol nị:n(CH3C0)20 =1:2,5 thì hiệu suất phản ứng là cao nhất đạt 52%.
Quá trình thực hiện phản ứng đơn giản, nguyên liệu đầu dễ dàng được loại đi bằng HCl loãng ở nhiệt độ lạnh do đó thuận lợi cho việc tinh chế sản phẩm.
39
3.6.1.3. Phản ứng đóng vòng tạo chất (iii) - Theo phưong pháp Bischler-Napieralski:
+ Dùng dung môi Benzen khan, tác nhân loại nước đóng vòng là POCI3
hoặc chỉ dùng POCI3, phản ứng được thực hiện trong bầu khí N2 đều không tạo ra được sản phẩm hoặc sản phẩm bị phân hủy.
+ Dùng dung môi CHCI3, tác nhân loại nước đóng vòng là POCI3:
Trong thời gian phản ứng theo dõi phản ứng xảy ra bằng sắc ký lớp mỏng và soi dưới đèn ư v thấy vết nguyên liệu đầu mờ dần đồng thời vết sản phẩm đậm dần lên.
Sau quá trình tinh chế thu được duy nhất sản phẩm (iii), với Rf= 0,76;
đây là phương pháp duy nhất thu được sản phẩm. - Theo phương pháp Pictet-Spengler:
Phản ứng không thành công do xảy ra phản ứng trùng ngưng giữa OH-