ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 Quy trình nghiên cứu
2.3.1. Quy trình nghiên cứu
Hình 2.5. Sơ đồ quy trình nghiên cứu thành phần hóa học và đặc tính kháng vi sinh vật kiểm định từ các mẫu thực vật
Mẫu lá thực vật khô
Tiến hành chiết phân đoạn các hợp chất tự nhiên
Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm đinh Khảo sát thành phần hóa học
Thăm dò thành phần hoá học có hoạt tính kháng khuẩn
2.3.2. Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Mục đích: Xác định khả năng kháng khuẩn của các mẫu cao chiết và
chế phẩm phân đoạn đối với một số chủng vi khuẩn và nấm gây bệnh theo phương pháp nhỏ dịch, xác định vòng kháng khuẩn.
Tiến hành: - Chuẩn bị môi trường nuôi cấy, hấp khử trùng 3 lần trong 3
ngày liên tiếp.
- Nuôi cấy lắc khởi động vi sinh vật trong môi trường dịch thể trong 24 giờ, nấm men trong 48 giờ.
- Cấy vi sinh vật đã khởi động trên môi trường đặc trong đĩa petri, sau đó đục giếng.
- Mẫu dịch chiết được pha theo tỷ lệ thích hợp (thường là 1 mẫu: 19 nước cất) sẽ được tra vào các giếng. Để đĩa petri trong 4oC cho mẫu khuyếch tán đều vào thạch rồi đưa vào tủ ấm 37oC. Đọc kết quả vòng kháng khuẩn sau 24 giờ đối với vi khuẩn và 48 giờ đối với nấm.
2.3.3. Khảo sát thành phần các hợp chất tự nhiên bằng các phản ứng hóa học đặc trưng
Nguyên tắc của phương pháp là dựa trên phản ứng của từng nhóm chất với các thuốc thử đặc trưng và cho màu hoặc dấu hiệu nhận biết khác nhau. Với một liều lượng xác định, việc so sánh cường độ màu cũng có thể bước đầu đánh giá được hàm lượng của chúng trong các mẫu nghiên cứu.
2.3.3.1. Định tính flavonoid
Mẫu thử được pha trong Ethanol với một lượng thích hợp, thêm vài giọt HCl đặc.
- Phản ứng Shinoda: Cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: một ống
đối chứng, ống kia thêm vài mảnh Mg và đun trên nồi cách thủy trong vài phút. Phản ứng dương tính khi trong ống nghiệm xuất hiện màu hồng, đỏ hay da cam.
- Phản ứng với acid sunfuric: Cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm:
một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt acid sunfuric đặc. Phản ứng cho màu vàng đậm cho thấy sự có mặt của flavon và flavonol, màu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron.
- Phản ứng định tính catechin: Nhỏ một giọt dung dịch mẫu lên giấy
lọc, nhỏ tiếp lên một giọt dung dịch vanilin trong HCl đặc. Kết quả cho màu đỏ son là phản ứng dương tính.
2.3.3.2. Định tính tannin
Mẫu thử cũng được pha như trên và làm các phản ứng:
- Phản ứng với vanilin: Chia dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: một
ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt thuốc thử vanilin/H2SO4. Phản ứng dương tính khi thu được màu đỏ đậm.
- Phản ứng với gelatin/NaCl: Cho vài giọt thuốc thử vào dung dịch
mẫu, phản ứng dương tính khi trong dung dịch xuất hiện vẩn đục.
- Phản ứng với acetate chì: cho vài giọt dung dịch acetate chì 10% vào
dung dịch mẫu, phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa.
2.3.3.3. Định tính các polyphenol khác
- Phản ứng với dung dịch kiềm: Dung dịch mẫu thử được pha như trên.
Chia dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt NaOH 10%. Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu vàng, vàng cam.
- Phản ứng với FeCl3: Nhỏ dung dịch FeCl3 trong HCl 0,5N vào ống nghiệm đựng mẫu thử được pha loãng bằng ethanol 96%. Phản ứng có kết quả dương tính khi dung dịch có màu lục, tía, lam, xanh đen hay đen.
2.3.3.4. Định tính glycosid Phản ứng Keller-Killian:
Thuốc thử Keller-Killian:
+ Dung dịch B: thêm 0,5ml dung dịch FeCl3 5% vào 50ml acid sunfuric đặc. Phương pháp: Cho cặn dịch chiết vào ống nghiệm. Thêm 1ml dung dịch A lắc cho tan hết, nghiêng ống nghiệm từ từ cho dung dịch B vào. Phản ứng dương tính khi xuất hiện vòng nâu đỏ giữa 2 lớp chất lỏng.
2.3.3.5. Định tính alkaloid
Mẫu thử được pha trong dung dịch acid acetic 2% với một lượng thích hợp để làm các phản ứng.
- Phản ứng với thuốc thử Bouchardat (hỗn hợp KI và I2 trong dung dịch HCl): phản ứng cho kết tủa màu nâu sẫm.
- Phản ứng với thuốc thử Vans-Mayer (hỗn hợp HgCl2 và KI trong nước): phản ứng cho kết tủa màu trắng ánh vàng.
- Phản ứng với thuốc thử Dragendroff (hỗn hợp Bi(NO3)3 và KI trong dung dịch acid acetic): phản ứng cho màu vàng da cam đến đỏ.
2.3.4. Xác định hàm lượng polyphenol tổng số
Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng của các hợp chất polyphenol với thuốc
thử Folin-Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam. Đo độ hấp thụ của dung dịch sau phản ứng ở bước sóng 765nm. Hàm lượng polyphenol tổng số được tính theo mg acid gallic chuẩn.
Chuẩn bị mẫu định lượng:
- Cân chính xác 5 gam bột mẫu dược liệu và tiến hành chiết rút 3 lần bằng Methanol (mỗi lần 50ml), lọc gom dịch lọc và thêm MeOH tới 150ml.
- Cân chính xác 0,05 mg cao các phân đoạn hoà tan trong 10ml MeOH.
Phương pháp tiến hành:
Lấy 1,58ml nước cất 2 lần vào cuvet loại 3ml sau đó thêm 20l mẫu và 100l thuốc thử Folin, lắc đều và để trong tối trong 5 phút. Tiếp theo thêm
300ml dung dịch Na2CO3 bão hoà, lắc đều và để trong tối trong 2h sau đó tiến hành đo ở bước sóng 765nm.
2.3.5. Sắc ký lớp mỏng
Nguyên tắc: Sắc ký lớp mỏng dựa trên sự phân chia hai pha: một pha
đứng im gọi là chất hấp phụ là lớp mỏng Silicagen rải trên một tấm thủy tinh, một pha di động là một dung môi đựng trong một bình có nắp kín. Lớp hấp phụ nhúng vào dung môi. Dung môi di chuyển lên làm chuyển dịch mẫu để phân tách từ vị trí chấm của nó trên lớp mỏng. Nếu mẫu là một hỗn hợp, mỗi chất trong đó có hệ số hấp phụ và có ái lực xác định đối với dung môi sẽ di chuyển với tốc độ riêng.
Vị trí các vết chuyển dịch có thể soi dưới ánh sáng tử ngoại, hoặc hiện màu bằng những thuốc thử thích hợp. Ta có thể cạo các vết, rửa được các chất, tinh chế, đem phân tích bằng quang phổ kế để xác định thành phần riêng biệt.
Cách tiến hành:
Sắc ký trên bản mỏng tráng sẵn silicagel DC - Alufolien 60 F254 (Merck
5554). Hệ dung môi chạy sắc ký là hệ dung môi TEF theo tỷ lệ 5:4:1 (Toluen
– Etthylacetat – acid formic). Hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10%. - Chuẩn bị dung môi chạy sắc ký hệ dung môi TEF theo tỷ lệ 5:4:1. - Hòa tan mẫu trong dung môi thích hợp và tiến hành lọc qua màng lọc kích thước lỗ 0,45m.
Tiến hành chấm mẫu lên bản mỏng và chạy sắc kí (đặt trong dung môi). - Hiện kết quả bằng thuốc thử.
Xác định hệ số Rf theo công thức: Rf = a/b.
Trong đó: - a: khoảng di chuyển của chất nghiên cứu - b: khoảng di chuyển của dung môi
Chương 3