3.2.2. Thử hoạt tính sinh học 3.2.2.1. Tác dụng ức chế HDAC
Các acid hydroxamic 3a-d được thử tác dụng ức chế HDAC tại khoa Dược,
Đại học Chungbuk (Cheongju, Hàn Quốc). Kết quảđược trình bày ở bảng 3.7 và hình 3.1.
Hình 3.1: Đánh giá mức độức chế HDAC theo phương pháp Western blot Nhận xét: Kết quả thử tác dụng ức chế enzym HDAC bằng phương pháp Western blot cho thấy cả 4 chất 3a-d đều làm cho hoạt tính enzym bị ức chế
hoàn toàn khi thử nồng độ 3 µg/mL. Từ kết quả này, hoạt tính ức chế HDAC của 4 chất tổng hợp được tiếp tục được tiến hành theo phương pháp định lượng enzym HDAC2.
38 Bảng 3.7: Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC Chất R Khả năng ức chế HDAC 1 Tác dụng ức chế HDAC (IC50) 2 (µg/mL) (µM) 3a H + 3 0,039 0,116 3b 5-CH3 + 0,063 0,179 3c 5-OCH3 + 0,043 0,117 3d 5-Br + 0,050 0,120 SAHA + 0,486 1,841
Ghi chú:1Hoạt tính của enzyme bị ức chế hoàn toàn khi thử tại 3µg/mL bằng phương pháp Western blot; 2Nồng độức chế 50% hoạt động deacetyl hóa của HDAC; 3Hiện tượng deacetyl hóa không xảy ra.
Nhận xét: Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym HDAC của 4 chất 3a-d được trình bảy ở bảng 3.7 đều cho thấy các chất có khả năng ức chế HDAC ở nồng
độ dưới 0.2 µM và đều có tác dụng tốt hơn SAHA khoảng 10 lần. Sau khi thế
H ở vị trí 5 trên vòng 3-hydroxyimino-2-oxoindolin thì tác dụng ức chế
HDAC của các dẫn chất thế đều bị giảm đi so với chất không nhóm thế, tuy nhiên sự khác biệt là không đáng kể. Trong số 4 chất 3a-d, chất có khả năng
ức chế enzym HDAC mạnh nhất là 3a với IC50 = 0,116 µM. Hai dẫn chất có nhóm thế 5-OCH3 (3c) và 5-Br (3d) có khả năng ức chế HDAC tương đương với 3a với IC50 lần lượt là 0,117 và 0,120 µM. Tác dụng ức chế HDAC quyết
định tác dụng chống ung thư, tuy nhiên để gây ra độc tính với tế bào các chất phải có khả năng thấm qua màng sinh học vào trong tế bào tiếp cận với HDAC. Vì vậy, các chất 3a-d được tiến hành thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên các dòng tế bào ung thư: ung thưđại tràng (SW 620), ung thư tuyến tiền liệt (PC-3), ung thư tuỵ (AsPC-1) nhằm tìm ra các chất có khả năng thực sự tốt. Kết quả thử hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư được trình bày trong bảng 3.8.
39
3.2.2.2. Hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro
Các chất 3a-d được đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư người trên các dòng tế bào ung thư: ung thưđại tràng (SW 620), ung thư biểu mô tuyến tiền liệt (PC-3) và ung thư tuyến tụy (AsPC-1). Kết quả giá trị IC50 cụ thể của các chất được trình bày trong bảng 3.8.
Bảng 3.8: Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư
Chất R Độc tính tế bào (IC50) 1 SW620 2 PC-3 3 AsPC-1 4 (µg/mL) (µM) (µg/mL) (µM) (µg/mL) (µM) 3a H 0,761 2,258 0,45 1,135 0,322 0,955 3b 5-CH3 0,676 1,926 0,423 1,205 0,29 0,826 3c 5-OCH3 0,902 2,458 0,416 1,134 0,25 0,681 3d 5-Br 0,587 1,408 0,387 0,928 0,264 0,633 SAHA 0,976 3,697 0,426 1,614 0,665 2,519
Ghi chú: 1Nồng độức chế 50% sự phát triển của tế bào ung thư; 2Dòng tế bào ung thưđại tràng;
3
Dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt; 4Dòng tế bào ung thư tuyến tụy.
Nhận xét: Từ kết quả trong bảng 3.8, có thể thấy rằng dù các chất 3a-d có tác dụng ức chế enzym HDAC mạnh gấp SAHA nhiều lần, tuy nhiên hoạt tính kháng tế bào ung thư của các chất trên so với SAHA chỉ chênh lệch nhau khoảng 2 lần. Kết quả thử nghiệm 4 chất 3a-d trên 3 dòng tế bào ung thưđều cho thấy 4 chất trên có tác dụng gây độc tế bào ở nồng độ dưới 1,0 µg/mL, tức là cả 4 chất đều có tác dụng đều có hoạt tính kháng tế bào ung thư
SW620, PC-3, AsPC-1. Do các chất tác dụng theo cơ chế phân tử nên để so sánh hoạt tính giữa các chất, các giá trị IC50 của 4 chất 3a-d được quy đổi từ
µg/mL ra µM. Kết quả quy đổi được trình bày trong bảng 3.11. Trong các dòng tế bào ung thư, 4 chất 3a-d có hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư tuỵ
(AsPC-1) mạnh nhất với giá trị IC50 từ 0,633 đến 0,955 µM, mạnh hơn hoạt tính của SAHA từ 2,6 đến 4,0 lần.
40
3.2.3. Đánh giá mức độ giống thuốc
Bảng 3.9: Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất 3a-d theo qui tắc Lipinsky N N O O H NH O OH R Chất R LogP KLPT Số NH, OH Số N, O 3a H 2,77 337 3 7 3b 5-CH3 3,32 351 3 7 3c 5-OCH3 2,85 367 3 8 3d 5-Br 3,66 417 3 7
Nhận xét: Tất cả các chất đều thỏa mãn được 4 yêu cầu của qui tắc Lipinsky về mức độ giống thuốc. Cùng với kết quả thử hoạt tính sinh học in vitro tốt, các chất có nhiều triển vọng cho việc nghiên cứu tác dụng in vivo.
3.2.3. Sơ bộ đánh giá khả năng tương tác với HDAC (docking)
Để tìm hiểu sơ bộ về tương tác liên kết của các chất với HDAC, nghiên cứu
đánh giá tính tương tác giữa các với HDAC2 của các chất đích đã tổng hợp
được tiến hành tại Khoa Dược, Đại học Chungbuk, Hàn Quốc. Kết quả dự đoán năng lượng liên kết và hình ảnh minh họa được trình bày trong bảng 3.9.
41
Bảng 3.10: Kết quả docking của các chất 3a-d với HDAC2
N N O O H NH O OH R Chất 3a 3b 3c 3d SAHA R H 5-CH3 5-OCH3 5-Br
Năng lượng tương
tác (kcal/mol) -9,4 -8,3 -9,0 -9,1 -7,4
Nhận xét: Để hỗ trợ trong quá trình thiết kế cấu trúc và tìm hiểu khả năng gắn vào trung tâm hoạt động trên enzym HDAC của các chất, nghiên cứu docking được tiến hành với 4 chất 3a-d. Kết quả nghiên cứu Docking cho thấy các chất đều tương tác với ion kẽm tương tự SAHA. Bên cạnh đó, năng lượng liên kết của 4 chất 3a-d với trung tâm hoạt động của HDAC2 được dự đoán từ -9,4 đến -8,3 kcal/mol, nghĩa là đều lớn hơn SAHA (-7,4 kcal/mol), chứng tỏ các chất đều có ái lực với HDAC2 mạnh hơn SAHA. Các chất 3a-d có ái lực cao với HDAC2 có thể do vòng benzen trên vùng cầu nối tương tác với 2 vị trí Phe155 và Phe210 trên trung tâm hoạt động của HDAC. Tóm lại, kết quả docking cho thấy 4 chất 3a-d phù hợp với hướng thiết kế cấu trúc nhằm tìm kiếm những chất có khả năng ức chế HDAC.
3.3. Bàn luận
3.3.1. Tổng hợp hóa học
Các chất 3a-d và các chất trung gian đã tổng hợp được nhìn chung là các chất có cấu tạo phức tạp, có mạch C dài, có các nhóm chức nhạy cảm với các yếu tố của môi trường phản ứng. Vì vậy, trong quá trình tổng hợp cần đảm bảo nghiêm ngặt vềđiều kiện phản ứng. Cụ thể:
42
- Các phản ứng tổng hợp ester trung gian 2a-d là các phản ứng alkyl hóa, xảy ra khá dễ dàng và đạt hiệu suất cao (89 - 95%). Tuy nhiên, do sản phẩm và chất tham gia có nhóm chức ester nên khi tiến hành phản ứng cần đảm bảo dụng cụ phải khô hoàn toàn, các hóa chất và dung môi phải khan nước để
tránh việc nhóm chức ester bị thủy phân. Đồng thời cần theo dõi quá trình phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng để xác định thời điểm kết thúc phản ứng, tránh tạo ra sản phẩm phụ trong quá trình phản ứng.
- Với các phản ứng tổng hợp acid hydroxamic 3a-d: để tránh phân hủy ester thành acid carboxylic bởi dung dịch NaOH đậm đặc, hỗn hợp chất phản
ứng 2a-d và NH2OH.HCl và dung dịch NaOH cần được làm lạnh đến -5oC trong hỗn hợp đá muối trước khi cho vào bình phản ứng. Khi nhỏ NaOH cần phải nhỏ từ từ để tránh dung dịch trong bình phản ứng bị quá nhiệt dẫn tới nhóm chức ester của chất tham gia và nhóm chức amid của sản phẩm bị phân hủy. Hơn nữa, phản ứng cũng cần được tiến hành ở nhiệt độ thấp (-5oC) trong thời gian ngắn để tránh bị phân hủy nhóm chức amid. Lượng NaOH cần dùng dưđể chuyển hết NH2OH.HCl thành dạng NH2OH tan và đồng thời đảm bảo các acid hydroxamic tạo thành tan hết trong dung dịch phản ứng. Ngoài ra, phản ứng cũng cần được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng để xác định thời điểm kết thúc phản ứng.
3.3.2. Tác dụng sinh học
Tác dụng sinh học của 4 chất 3a-d được thể hiện thông qua sự ức chế
HDAC, tác dụng gây độc lên tế bào ung thư cũng như khả năng gắn với HDAC. Theo kết quả docking cũng như tác dụng ức chế HDAC, chất 3d có tác dụng không mạnh bằng 3a (0,120 µM so với 0,116 µM), tuy nhiên chất 3d lại thể hiện rõ tác dụng kháng tế bào ung thư (IC50 cao nhất trong nhóm 4 chất trên 3 dòng tế bào ung thư).
43
Kết quả thử độc tính tế bào cho thấy các acid hydroxamic mang khung 3-hydroxyimino-2-oxoindolin và cầu nối có chứa nhân thơm có hoạt tính kháng ung thư tốt, đồng thời sự thay đổi các nhóm thế trên khung 3- hydroxyimino-2-oxoindolin mang lại hoạt tính khác nhau. Trong số 4 chất
được nghiên cứu, chất 3d có hoạt tính tốt nhất trên cả 3 dòng tế bào ung thư
trong khi chất 3c có tác dụng tốt trên 2 dòng tế bào ung thư PC-3 và AsPC-1 nhưng có hoạt tính yếu đối với tế bào ung thưđại tràng SW620. Các dẫn chất mang nhóm thế đẩy điện tử 5-CH3 hay 5-OCH3 (3b và 3c) có tác dụng tương
đương với dẫn chất không nhóm thế trong khi dẫn chất 3d gắn nhóm thế hút
điện tử 5-Br có hoạt tính tốt trên cả 3 dòng tế bào ung thư. Có thể do việc gắn thêm nhóm thế hút điện tử là 5-Br làm cho chất 3d đạt hệ số phân bố dầu- nước thích hợp, từđó vào được trong tế bào với nồng độ cao gây ra tác dụng
đồng thời nhóm thế 5-Br còn giúp chất 3d có cấu trúc phù hợp với cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động của HDAC. Tóm lại, sự có mặt của 1 nhóm thế trên nhân phenyl, đặc biệt là nhóm thế hút điện tử, là cần thiết đối với các dẫn chất N-hydroxy-4-(3-hydroxyimino-2-oxo-1- indolinyl)methylcinnamamid để có hoạt tính sinh học tốt hơn SAHA.
Hơn nữa, các chất đích 3a-d đã tổng hợp được không chỉ có hoạt tính sinh học cao mà còn thỏa mãn quy tắc Lipinsky về mức độ giống thuốc, điều này mở ra triển vọng cho việc nghiên cứu cận lâm sàng và lâm sàng của các chất sau này.
Các chất mang khung 3-hydroxyimino-2-oxo-1-indolinyl tương tự 3a-d với cầu nối heptanamid được nhóm nghiên cứu tại Bộ môn Hóa Dược - Đại học Dược Hà Nội tiến hành năm 2013 và mang lại kết quả hoạt tính sinh học tốt. Vì vậy, để xét tác động của việc thay thế cầu nối heptanamid bằng cầu nối 3- phenyl-2-propenamid, nồng độ gây độc tế bào (IC50) của 3a-d được so sánh với các dẫn chất tương ứng cùng mang khung 3-hydroxyimino-2-oxo-1-
44
indolinyl và cầu nối heptanamid được tổng hợp bởi Nam N.H và cộng sự
(2013) [29]:
Bảng 3.11: So sánh hoạt tính kháng tế bào ung thư 3a-d và IIIa,d,f
N NH OH O N O OH R III N N O O H NH O OH R 3 Chất
3a IIIa 3b IIIf 3d IIId
R 5-H 5-CH3 5-Br Độc tính tế bào (IC50, µM) SW620 2,26 0,64 1,93 0,99 0,59 0,29 PC-3 1,14 0,98 1,21 0,62 0,40 2,21 AsPC-1 0,96 1,10 0,83 2,44 0,63 0,08
Từ kết quả ở bảng trên có thể thầy rằng khi thay thế cầu nối heptanamid bằng cầu nối 3-phenyl-2-propenamid, các chất tổng hợp được vẫn giữ được hoạt tính tốt trên 3 dòng tế bào ung thư: đại tràng (SW620), tuyến tiền liệt (PC-3) và tụy (AsPC-1). Hơn nữa các chất tổng hợp được với cầu nối chứa vòng phenyl và mạch 3 carbon thể hiện hoạt tính tốt hơn trên dòng tế bào AsPc-1 (3a, 3b) và PC-3 (3d). Điều này có thể cho thấy dù việc thay thế cầu nối mạch thẳng truyền thống bằng cầu nối 3-phenyl-2-propenamid dù không cho hoạt tính vượt trội nhưng vẫn cho thấy hoạt tính tốt trên một số dòng tế
bào ung thư với một số nhân thơm có nhóm thế khác nhau. Đặc biệt, dẫn chất mang nhóm thế 5-Br với dãy có cầu nối heptanamid chỉ thể hiện hoạt tính vượt trội trên dòng tế bào AsPc-1 và SW620 nhưng dẫn chất tương ứng (chất
3d) với cầu nối có chứa nhân thơm lại thể hiện hoạt tính tốt trên cả 3 dòng tế
bào được thử. Vì vậy, nên tiến hành thử thêm hoạt tính của dẫn chất này trên một số dòng tế bào ung thư khác để xác định có thể tìm ra dòng tế bào bị ức chế tốt hơn.
45
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
I. KẾT LUẬN
Từ các kết quả nghiên cứu đã trình bày có thể rút ra một số kết luận sau:
1.1. Về tổng hợp và khẳng định cấu trúc
* Đã tổng hợp và khẳng định cấu trúc 4 chất như dự kiến, trong đó cả 4 chất 3a-d chưa từng được công bố trong bất kỳ tài liệu nào:
-N-hydroxy-4-(3-hydroxyimino-2-oxo-1-indolinyl)methylcinnamamid (3a). -N-hydroxy-4(3hydroxyimino-5-methyl-2oxo-1-indolinyl)methylcinnamamid (3b). -N-hydroxy-4(3hydroxyimino-5methoxy-2oxo1-indolinyl)methylcinnamamid (3c). -N-hydroxy-4(5-bromo-3hydroxyimino-2-oxo-1-indolinyl)methylcinnamamid (3d). 1.2. Về hoạt tính sinh học
* Đã thử tác dụng ức chế HDAC và hoạt tính kháng tế bào ung thư của các chất tổng hợp được, kết quả cho thấy:
- Về tác dụng ức chế HDAC: cả 4 chất đều có tác dụng ức chế HDAC với tác dụng gấp SAHA khoảng 10 lần.
- Về tác dụng kháng tế bào ung thư: cả 4 chất đều có hoạt tính ức chế mạnh trên cả 3 dòng tế bào ung thư: đại tràng (SW620), tuyến tiền liệt (PC-3) và tuyến tụy (AsPC-1). Trong đó chất 3d (IC50 trên 3 dòng tế bào SW620, PC-3 và AsPC-1 lần lượt là 1,408 µM; 0,928 µM và 0,633µM) có tác dụng mạnh nhất trên cả 3 dòng tế bào, mạnh hơn SAHA khoảng 2 - 4 lần.
II. KIẾN NGHỊ
- Tiến hành thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro của các chất tổng hợp được trên các dòng tế bào ung thư khác, tìm ra chất có tác dụng mạnh làm cơ sở cho việc thử tác dụng in vivo.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Đỗ Thị Mai Dung, (2013), Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 1,3,4-thiadiazol, Khóa luận Dược sĩ Đại học,
Đại học Dược Hà Nôi.
2. Hoàng Đức Minh, (2014), Tổng hợp và thử tác dụng sinh học một số acid hydroxamic mang khung 3-methoxim-isatin hướng ức chế Histon Deacetylase, Khóa luận Dược sĩĐại học, Đại học Dược Hà Nội
3. Nguyễn Đình Triệu, (2001), Các phương pháp phân tích vật lý và hóa lý, NXB Khoa học kỹ thuật, trang 29-100; 195-228.
4. Trần Thị Lan Phương, (2013), Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 3-oxim-isatin hướng ức chế histon deacetylase, Khóa luận Dược sĩ Đại học, Đại học Dược Hà Nội.
Tiếng Anh
5. Agarwal H., et al., (2010), “Synthesis, characterisation and biocidal studies of some hydroxamic acid”, International Journal of Applied Biology and Pharmaceutical Technology, 1(3), pp. 1293-1299.
6. Carrasco M.P., et al., (2011), “Novel folate-hydroxamate based antimetabolites: synthesis and biological evaluation”, Med. Chem., 7(4), pp. 265-274.
7. Chen X., et al., (2011), “Design, Synthesis and Biological Evalution of Hydroxamic Acid derivatives as Potential High Density Lipoprotein (HDL) Receptor CLA-1 Up-Regulating Agents”, Molecules, 16, pp. 9178-9193. 8. Choi J.H., et al., (2001), “Expression profile of histone deactylase 1 in gastric cancer tissues”, Jpn. J. Cancer Res., 92, pp. 1300-1304.
9. Choi S.E., (2012), The structural requirements of histone deacetylase (HDAC) inhibitors: suberolyanilide hydroxamic acid (SAHA) analogues
modified at C3, C6 and C7 positions enhance selectivity, Doctor of Philosophy Dissertation, The Graduate School of Wayne State University, Detroit, Michigan, USA.
10. Christofori G., Semb H., (1999), “The role of the cell-adhesion molecule E-cadherin as a tumour-suppressor gene”, Trends Biochem. Sci., 24, pp. 73-