19
- Các chất tổng hợp được được xác định cấu trúc bằng các phổ: phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR.
- Phổ hồng ngoại (IR): được ghi tại Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-600 cm-1. Các mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ
khoảng 1:200 rồi ép dưới dạng film mỏng dưới áp lực cao có hút chân không
để loại bỏ hơi ẩm.
- Phổ khối lượng (MS): được đo bằng máy khối phổ Agilent 6310 Ion Trap của Viện Hóa học Việt Nam, chế độ phun mù điện tử ESI, dung môi methanol.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR và carbon 13C-NMR được ghi trên máy Bruker AV-500 tại Trung tâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dung môi DMSO-d6. Độ chuyển dịch hóa học (δ) được biểu thị bằng
đơn vị phần triệu (parts per million - ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội trimethylsilan (TMS).
2.3.2. Thử tác dụng sinh học
2.3.2.1. Thử tác dụng ức chế HDAC
a. Đánh giá theo phương pháp Western blot
Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp được đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong tế bào ung thưđại tràng (SW620). Phân tích dựa trên Western blot có thể khẳng định được tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3, H4 khi so sánh với mẫu trắng. Chi tiết cách tiến hành dựa trên phương pháp đã được công bố trước đây [29].
b. Định lượng nồng độ enzyme HDAC2 bịức chế
Tác dụng ức chế HDAC của dẫn chất tổng hợp được thử tại Khoa Dược Trường Đại học Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc. Enzym HDAC2 được cung
20
cấp bởi BPS Bioscience (San Diego, CA, USA) và sử dụng bộ kit định lượng Fluoregenic HDAC Assay Kit (BPS Bioscience). Các bước tiến hành được thực hiện theo hướng dẫn của bộ KIT thử nghiệm.
Tóm tắt các bước như sau: enzym HDAC2 được ủ với KBH-A42 ở nhiều nồng độ khác nhau ở 37oC trong 30 phút với sự có mặt của cơ chất HDAC có gắn huỳnh quang. HDAC developer (tạo chất phát huỳnh quang trong hỗn hợp phản ứng) được thêm vào sau khi ủ và mức độ phát huỳnh quang được ghi bằng máy VICTOR (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) với bước sóng kích thích 360 nm và bước sóng phát xạ 460 nm. Kết quả được ghi lại và giá trị IC50 được tính toán bằng phần mềm GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
2.3.2.2. Thửđộc tính tế bào
* Nguyên tắc thử
Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư (thử độc tính tế bào) in vitrođược thực hiện tại Khoa Dược, trường Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc theo phương pháp SRB và giá trị IC50 được tính dựa trên phương pháp Probits.
Dòng tế bào thử nghiệm: SW620 (tế bào ung thư đại tràng), PC-3 (tế bào ung thư tuyến tiền liệt) và AsPC-1 (tế bào ung thư tuyến tụy).
Các tế bào ung thư được lấy từ ngân hàng tế bào ung thư của Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và được nuôi cấy trong môi trường RPMI bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bò). Độc tính tế bào của các chất được thử bằng phương pháp SRB theo các bước sau:
Chuẩn bị tế bào (đĩa A): Các tế bào ở pha logarit được trypsin hóa và phân tán vào hỗn dịch đơn tế bào trong môi trường RPMI 1640 bổ sung 10% FBS, 1% glutamin, 1% penicillin/ streptomycin và điều chỉnh đến nồng độ khoảng 3.105 đến 5.105 tế bào/ mL sau đó thu lấy mỗi giếng 100000 tế bào và phân
21
tán thành 10 mL với môi trường RPMI như trên. Sau đó hút 100 µL hỗn hợp tế bào và môi trường cho vào mỗi giếng để có 9000 tế bào/ giếng. Để hàng
đầu tiên trống làm mẫu trắng, hàng thứ 2 là mẫu chứng.
Chuẩn bị thuốc thử (đĩa B): Thêm 125 µL môi trường RPMI 1640 vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng, sau đó thêm 125 µL chất thử hòa tan trong DMSO vào hàng đầu tiên. Sau khi trộn đều, chuyển 125 µL vào hàng tiếp theo và lặp lại thao tác đến hàng cuối cùng. Như vậy, với mỗi hàng sẽ có một nồng độ
chất thử khác nhau. Hút 100 µL dung dịch chất thử từ hàng thứ 10 thêm vào hàng cuối cùng của đĩa A và tiếp tục lặp lại đến hàng thứ 3 của đĩa A. Sau khi hoàn thành, thêm 100 µL môi trường RPMI 1640 vào hàng mẫu chứng và 200 µL môi trường vào hàng mẫu trắng. Sau đó hỗn hợp tế bào - thuốc thửđược ủ
trong vòng 48 giờ.
Tiến hành thử: Sau khi ủ 48 giờ, mỗi giếng được thêm 50 µL dung dịch tricloroacetic 50% (TCA) đã được làm lạnh xuống dưới 4oC để có nồng độ
của TCA trong mỗi giếng là 10%. Đặt đĩa 96 giếng trong vòng 1 giờ ở 4oC để (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
tế bào tự tái tạo. Chuẩn bị dung dịch 0,4% sulforhodamine B (SRB) trong acid acetic 1% và thêm 70 µL dung dịch này vào mỗi giếng và để ở nhiệt độ
phòng trong 30 phút. Rửa đĩa bằng dung dịch acid acetic 1% 5 lần để loại bỏ
SRB tự do. Thêm 200 µL dung dịch Trizma base 10 mM vào mỗi giếng để
hòa tan SRB liên kết. Sau đó đặt đĩa 96 giếng vào máy lắc trong vòng ít nhất 10 phút. Đo độ hấp thụở bước sóng 492 nm [25].
*Tính kết quả:
Giá trị IC50 là nồng độ mẫu thử mà ở đó độ hấp thụ giảm đi 50% so với nhóm chứng (trắng âm tính là giếng chỉ thêm môi trường nuôi cấy): kết quả
cuối cùng là giá trị trung bình của 3 lần đo độc lập với độ khác nhau không quá 5%. Giá trị IC50 được tính dựa theo phương pháp Probits. Trong phương pháp thử này, IC50 ≤ 20 µg/mL được coi là có hoạt tính.
22
2.3.3. Đánh giá mức độ giống thuốc cuả chất tổng hợp được
Tính giá trị logP của các chất tổng hợp được bằng phần mềm EPIsuite cung cấp bởi US Environment Protection Agency’s Office of Pollution Prevention and Toxics and Syracuse Research Corporation (SRC). Quy trình bao gồm vẽ
cấu trúc 2D, tạo Smile notation bằng phần mềm ChemSketch 11.0 của ACD labs sau đó đưa Smile notation vào phần mềm EPIsuite để tính các giá trị
logP.
Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất dựa trên quy tắc Lipinski [24]: - Khối lượng phân tử của chất không lớn hơn 500 g/mol.
- Số trung tâm nhận liên kết hydro (N, O) không lớn hơn 10. - Số trung tâm cho liên kết hydro (NH, OH) không lớn hơn 5. - Giá trị của logP của chất không lớn hơn 5.
2.3.4. Nghiên cứu Docking
Việc nghiên cứu sơ bộ tính tương tác của các chất với HDAC (docking)
được thực hiện tại Phòng Nghiên cứu cấu trúc Đại học Quốc gia Seoul, Hàn Quốc.
Để tìm hiểu sợ bộ tương tác của các chất với HDAC, chúng tôi đã tiến hành docking cho các chất tổng hợp được dựa trên cơ sở mạng lưới của HDAC2 tương tác với SAHA. Chương trình AutoDock Vina được sử dụng cho nghiên cứu docking của các chất. Phức hợp HDAC2-SAHA ban đầu được lấy từ
Ngân hàng Dữ liệu Protein (PDB ID: 4LXZ) và cấu trúc các chất nghiên cứu
được lập bởi chương trình GlycoBioChem PRODRG2 Server. Khung mô hình tương tác của nghiên cứu docking được dựa trên trung tâm hoạt động của SAHA và có kích thước 26 x 26 x 22 điểm với khoảng cách 1,0 Å sau khi SAHA được loại bỏ khỏi phức hợp.
Kết quả của nghiên cứu được minh họa bằng bảng số liệu dự đoán năng lượng tương tác.
23
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. HÓA HỌC
3.1.1. Tổng hợp hóa học
Quá trình tổng hợp 4 chất trong khóa luận được thực hiện theo sơ đồ chung như sau (sơđồ 3.1):
Sơ đồ 3.1. Sơđồ tổng hợp chung
Tác nhân và điều kiện: i) methyl 3-(4-(bromoethyl)phenyl)prop-2-enoat, K2CO3, DMF, 24
h; ii) Hydroxylamin hydroclorid, NaOH, MeOH, THF, H2O,
-5oC, 1,5 - 2 h.
3.1.1.1. Tổng hợp N-hydroxy-4-(3-hydroxyimino-2-oxo-1-indolinyl)- methylcinnamamid (3a). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
a. Tổng hợp chất methyl 3-{4-[(2,3-dioxo-2,3-dihydro-1H-indol-1-yl)- methyl)phenyl}prop-2-enoat (2a)
Chất methyl 3-{4-[(2,3-dioxo-2,3-dihydro-1H-indol-1-yl)methyl)phenyl}- prop-2-enoat (2a) được tổng hợp từ isatin (1a) qua phản ứng thế ái nhân với methyl 3-(4-bromoethyl)phenyl)prop-2-enoat có mặt xúc tác là K2CO3 theo sơ đồ 3.2: N H O O N O O OCH3 O K2CO3 24 h OCH3 O Br + 1a 2a Sơ đồ 3.2: Sơđồ tổng hợp chất 2a Tiến hành phản ứng: N H O O R i N O O OCH3 O R ii N N O NH O OH OH R 1a-d 2a-d 3a-d 3a: R = 5-H 3b: R = 5-CH3 3c: R = 5-OCH3 3d: R = 5-Br
24
- Hòa tan 0,1470 g (1 mmol) isatin và 0,2461 g (2 mmol) K2CO3 bằng 2 mL DMF trong bình cầu đáy tròn dung tích 50 mL, sau đó khuấy ở nhiệt độ
phòng trong 1 h.
- Thêm tiếp 0,2539 g (1 mmol) methyl 3-[4-(bromoethyl)phenyl]prop-2- enoat đã hòa tan trong 1 mL DMF vào bình phản ứng.
- Tiến hành phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 24 h.
- Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) với pha động là DCM/MeOH = 9/1.
Xử lý phản ứng:
- Trung tính hóa hỗn hợp phản ứng bằng dung dịch HCl 5% để tạo tủa. - Lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nước cất cho đến khi dịch lọc trung tính. - Sấy khô tủa ở 60oC. Kết quả: - Cảm quan: thể rắn, màu vàng. - Hiệu suất: 96% (0,3103 g). - to nc= 207,0 - 209,0oC. - Rf = 0,72 (DCM/MeOH = 9/1). b. Tổng hợp chất N-hydroxy-4-(3-hydroxyimino-2-oxo-1- indolinyl)methylcinnamamid (3a) Chất N-hydroxy-4-(3-hydroxyimino-2-oxo-1-indolinyl)methylcinnamamid (3a) được tổng hợp bằng phản ứng tạo acid hydroxamic giữa chất 2a với hydroxylamin hydroclorid theo sơ đồ 3.3 như sau:
N O O OCH3 O N N O NH O OH OH NH2OH.HCl, NaOH MeOH, H2O, -5 oC, 1,5 - 2 h 2a 3a Sơ đồ 3.3: Sơđồ tổng hợp chất 3a Tiến hành phản ứng
25
- Hòa tan 0,1602 g (0,5 mmol) chất 2a vào trong bình cầu đáy tròn dung tích 100 mL bằng 4 mL MeOH. Thêm 0,6957 g (10 mmol) NH2OH.HCl vào bình cầu. Bình phản ứng được làm lạnh đến -5oC bằng hỗn hợp nước đá - muối.
- Hòa tan 0,8032 g (20 mmol) NaOH bằng 4 mL nước cất trong ống nghiệm và làm lạnh đến -5oC, sau đó thêm từ từ vào bình phản ứng. Chuyển từ từ dung dịch NaOH vào bình phản ứng.
- Tiến hành phản ứng ở -5oC.
- Theo dõi tiến trình phản ứng và xác định thời điểm kết thúc bằng cách dùng FeCl3 và sắc ký lớp mỏng (TLC), cụ thể làm như sau:
+ Lấy 0,1 mL hỗn hợp phản ứng cho vào khay sứ, sau đó acid hóa bằng HCl 5%. Nhỏ 1 giọt FeCl3 5%, nếu xuất hiện màu đỏ vang chứng tỏ phản ứng tạo acid hydroxamic đã xảy ra.
+ Acid hóa 0,1 mL hỗn hợp phản ứng trong ống nghiệm bằng HCl 5%, thêm methanol để hòa tan tủa, kiểm tra bằng TLC với pha động là hỗn hợp dung môi DCM / MeOH / CH3COOH = 90 / 10 / 1. Kết thúc phản ứng khi kết quả cho thấy phản ứng đã hết ester ban đầu.
Xử lý phản ứng
- Acid hóa hỗn hợp phản ứng bằng dung dịch HCl 5% lạnh đến pH = 3 - 4,
để lạnh 15 phút để tủa sản phẩm.
- Lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nước cất lạnh. - Sấy khô tủa ở 60oC.
- Kết tinh lại trong hệ methanol - nước tỉ lệ 9 - 1.
Kết quả
- Cảm quan: bột kết tinh màu đỏ cam. - Hiệu suất: 65% (0,1095 g).
26
- Nhiệt độ nóng chảy và Rf của chất 3a sau khi kết tinh lại được trình bày trong bảng 3.1.
- Chất 3a tổng hợp được được xác định cấu trúc bằng các phổ IR, MS, 1H- NMR, 13C-NMR. Kết quả cụ thểđược trình bày trong phần 3.1.3.
3.1.1.2: Tổng hợp N-hydroxy-4-(3-hydroxyimino-5-methyl-2-oxo-1- indolinyl)methylcinnamamid (3b) a. Tổng hợp chất methyl 3-{4-[(5-methyl-2,3-dioxo-2,3-dihydro-1H-indol-1- yl)methyl)phenyl}prop-2-enoat (2b) N H O O N O O OCH3 O K2CO3 24 h OCH3 O Br + 1b 2b Sơ đồ 3.4: Sơđồ tổng hợp chất 2b Để tổng hợp chất 3b cần tổng hợp chất methyl 3-{4-[(5-methyl-2,3-dioxo- 2,3-dihydro-1H-indol-1-yl)methyl)phenyl}prop-2-enoat (2b). Qui trình tổng hợp chất 2b từ 0,1612 g (1 mmol) chất 5-methylisatin (1b) được thực hiện tương tự như tổng hợp chất 2a. Kết quả thu được như sau:
- Cảm quan: thể rắn, màu vàng. - Hiệu suất: 90% (0,3024 g). - tonc = 213,3 - 215,2oC. - Rf = 0,62 (DCM/MeOH = 9/1). b. Tổng hợp chất N-hydroxy-4-(3-hydroxyimino-5-methyl-2-oxo-1- indolinyl)methylcinnamamid (3b) N O O OCH3 O N N O NH O OH OH NH2OH.HCl, NaOH MeOH, H2O, -5 oC, 1,5 - 2 h 2b 3b Sơ đồ 3.5: Sơđồ tổng hợp chất 3b (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
27
Tổng hợp chất N-hydroxy-4-(3-hydroxyimino-5-methyl-2-oxo-1- indolinyl)methylcinnamamid (3b) từ 0,1671 g (0,5 mmol) chất 2b được tiến hành tương tự như tổng hợp chất 3a. Kết quả như sau:
- Cảm quan: bột kết tinh màu đỏ cam. - Hiệu suất: 68% (0,1210 g).
- Nhiệt độ nóng chảy và Rf của chất 3b sau khi kết tinh lại được trình bày trong bảng 3.1.
- Xác định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR kết quả cụ thể được trình bày trong phần 3.1.3.
3.1.1.3: Tổng hợp N-hydroxy-4-(3-hydroxyimino-5-methoxy-2-oxo-1- indolinyl)methylcinnamamid (3c) a. Tổng hợp chất methyl 3-{4-[(5-methoxy-2,3-dioxo-2,3-dihydro-1H-indol-1- yl)methyl)phenyl}prop-2-enoat (2c) N H O O H3CO K2CO3 24 h OCH3 O Br + N O O OCH3 O H3CO 1c 2c Sơ đồ 3.6: Sơđồ tổng hợp chất 2c Để tổng hợp chất 3c cần tổng hợp chất methyl 3-{4-[(5-methoxy-2,3- dioxo-2,3-dihydro-1H-indol-1-yl)methyl)phenyl}prop-2-enoat (2c). Qui trình tổng hợp chất 2c từ 0,1772 g (1 mmol) chất 5-methoxyisatin (1c) được thực hiện tương tự như tổng hợp chất 2a. Kết quả như sau:
- Cảm quan: thể rắn, màu vàng. - Hiệu suất: 91% (0,3200 g). - tonc = 219,0 - 221,3oC. - Rf = 0,70 (DCM/MeOH = 9/1). b. Tổng hợp chất N-hydroxy-4-(3-hydroxyimino-5-methoxy-2-oxo-1- indolinyl)methylcinnamamid (3c)
28 N O O OCH3 O H3CO N N O NH O OH OH H3CO NH2OH.HCl, NaOH MeOH, H2O, -5 oC, 1,5 - 2 h 2c 3c Sơ đồ 3.7: Sơđồ tổng hợp chất 3c Tổng hợp chất N-hydroxy-4-(3-hydroxyimino-5-methoxy-2-oxo-1- indolinyl)methylcinnamamid (3c) từ 0,1750 g (0,5 mmol) chất 2c được tiến hành tương tự như tổng hợp chất 3a. Kết quả như sau:
- Cảm quan: bột kết tinh màu đỏ cam. - Hiệu suất: 76% (0,1405 g).
- Nhiệt độ nóng chảy và Rf của chất 3c sau khi kết tinh lại được trình bày trong bảng 3.1.
- Xác định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR kết quả cụ thể được trình bày trong phần 3.1.3.
3.1.1.4: Tổng hợp N-hydroxy-4-(5-bromo-3-hydroxyimino-2-oxo-1- indolinyl)methylcinnamamid (3d) a. Tổng hợp chất methyl 3-{4-[(5-bromo-2,3-dioxo-2,3-dihydro-1H-indol-1- yl)methyl)phenyl}prop-2-enoat (2d) N H O O Br N O O OCH3 O Br K2CO3 24 h OCH3 O Br + 1d 2d Sơ đồ 3.8: Sơđồ tổng hợp chất 2d Để tổng hợp chất 3d cần tổng hợp chất methyl 3-{4-[(5-bromo-2,3-dioxo- 2,3-dihydro-1H-indol-1-yl)methyl)phenyl}prop-2-enoat (2d). Qui trình tổng hợp chất 2d từ 0,1802 g (1 mmol) chất 5-bromoisatin (1d) được thực hiện tương tự như tổng hợp chất 2a. Kết quả như sau:
- Cảm quan: thể rắn, màu vàng. - Hiệu suất: 90% (0,3621 g).
29 - tonc = 222,2 - 224,1oC. - Rf = 0,78 (DCM/MeOH = 9/1). b. Tổng hợp chất N-hydroxy-4-(5-bromo-3-hydroxyimino-2-oxo-1- indolinyl)methylcinnamamid (3d) N O O OCH3 O Br N N O NH O OH OH Br NH2OH.HCl, NaOH MeOH, H2O, -5 oC, 1,5 - 2 h 2d 3d Sơ đồ 3.9: Sơđồ tổng hợp chất 3d Tổng hợp chất N-hydroxy-4-(5-bromo-3-hydroxyimino-2-oxo-1- indolinyl)methylcinnamamid (3d) từ 0,1778 g (0,5 mmol) chất 2d được tiến hành tương tự như tổng hợp chất 3a. Kết quả như sau:
- Cảm quan: bột kết tinh màu đỏ cam. - Hiệu suất: 72% (0,1503 g).
- Nhiệt độ nóng chảy và Rf của chất 3d sau khi kết tinh lại được trình bày