Nguyên liệu nghiên cứu gồm nhiễu mẫu Nưa được thu hái ở nhiều địa phương khác nhau:
- Tại Nho Quan - Ninh Bình vào tháng 1 và tháng 4/2014.
- Tại Ba Vì – Hà Nội vào tháng 10/2013 đến tháng 4/2014.
- Tại Phú Quốc – Kiên Giang vào tháng 4/2014.
Các mẫu sau khi thu hái, một phần được trồng ở vườn Thực Vật trường Đại học Dược Hà Nội và ở Nho Quan - Ninh Bình để lưu mẫu và tiếp tục nghiên cứu và giám định tên khoa học của các loài.
Mẫu củ tươi được bảo quản trong hỗn hợp Glycerin : cồn : nước (1:1:1) để cắt vi phẫu. Củ được rửa sạch, cạo bỏ lớp bần, thái lát và sấy khô, nghiền thô bằng thuyền tán, bảo quản trong túi nilon kín để nghiên cứu.
2.1.2. Phương tiện nghiên cứu
2.1.2.1. Hóa chất và dụng cụ
- Hóa chất và thuốc thử trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích theo Dược Điển Việt Nam IV [4].
- Hóa chất: Javen, acid acetic, xanh methylen, đỏ son phèn, nước cất, cloral hydrat 25%, natri sulfat khan.
- Dung môi hữu cơ: Cloroform, ethyl acetat, acid formic, ether dầu hỏa, toluen, aceton, methanol…
- Thuốc thử: Các thuốc thử dùng trong phản ứng định tính và sắc ký.
- Bản mỏng tráng sẵn silicagel 60F254 của Merck.
- Dụng cụ: Dụng cụ thủy tinh và các dụng cụ khác dùng trong phòng thí nghiệm (cốc có mỏ, bát sứ, chày, cối, thuyền tán, đũa thủy tinh, lam kính, bình nón…)
2.1.2.2. Thiết bị dùng trong nghiên cứu
- Kính hiển vi Labomed.
- Cân kỹ thuật Sartorius.
18
- Tủ sấy.
- Máy chấm sắc ký CAMAG LINOMAT 5.
- Máy chụp ảnh sắc ký CAMAG REPROSTAR 3.
- Máy vi tính với các phần mềm winCATS, VideoScan versison 1.01, Adobe Photoshop cs7.0
- Máy ảnh Casio Exilim Ex-H10.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Mô tả đặc điểm hình thái
Các loài Nưa nghiên cứu được mô tả đặc điểm hình thái bằng phương pháp mô tả phân tích.
2.2.2. Nghiên cứu hiển vi
2.2.2.1. Đặc điểm vi phẫu
- Mẫu củ của các loài Nưa được cắt bằng dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay, chọn các lát cắt mỏng.
- Tẩy các lát cắt bằng javen hoặc cloramin B đã pha bão hòa tới khi lát cắt trắng hoàn toàn. Rửa nhiều lần bằng nước.
- Ngâm trong dung dịch acid acetic 5% trong 15 phút. Rửa lại nhiều lần bằng nước.
- Nhuộm xanh methylen trong vòng 30 phút. Rửa lại nhiều lần bằng nước.
- Nhuộm đỏ son phèn trong vòng 10 phút. Rửa lại nhiều lần bằng nước.
- Đặt vi phẫu vào một giọt glycerin trên phiến kính, đậy lamen, soi trên kính hiển vi và quan sát các đặc điểm. Vẽ sơđồ tổng quát.
Sau khi quan sát vi phẫu củ các loài Nưa trên kính hiển vi, tiến hành mô tả, vẽ
sơđồ cấu tạo tổng quát, chụp ảnh các đặc điểm đặc biệt [2], [3].
2.2.2.2. Đặc điểm bột
- Củ Nưa sau khi thu hoạch được rửa sạch, cạo bỏ lớp bần, sấy khô, nghiền nhỏ thành bột bằng thuyền tán và cối sứ, rây lấy bột mịn.
- Mô tảđặc điểm cảm quan, lên tiêu bản và quan sát.
- Chụp ảnh dưới kính hiển vi bằng máy ảnh Casio exilim Ex-H10 để xác định các đặc điểm bột [2], [3], [14].
19
2.2.3. Nghiên cứu hóa học
Các mẫu Nưa sau khi thu hái được rửa sạch, cạo vỏ, sấy khô, nghiền thô bằng thuyền tán, bảo quản trong túi nilon kín để nghiên cứu
2.2.3.1. Định tính sơ bộ các nhóm chất có trong dược liệu bằng phản ứng hóa học
Dựa vào các tài liệu dược liệu học [5], [6], phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc [10], hóa học saponin [16] tiến hành định tính sơ bộ các nhóm chất có trong dược liệu là củ của các loài nưa bằng các phản ứng sau:
+ Định tính saponin trong dược liệu
Quan sát hiện tượng tạo bọt: Cho 1g bột củ Nưa vào ống nghiệm lớn. Thêm 10ml nước. Lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 5 phút. Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt. Phản ứng dương tính khi cột bọt cao trên 1cm bền trong hơn 15 phút.
+ Định tính anthranoid
• Phản ứng Borntraeger (Định tính anthranoid dạng toàn phần)
Cho 2g bột củ Nưa vào ống nghiệm lớn. Thêm 5ml dung dịch acid sulfuric 1N.
Đun trực tiếp trên nguồn nhiệt đến sôi. Lọc dịch chiết còn nóng qua giấy lọc vào bình gạn dung tích 50ml. Để nguội dịch lọc, thêm 5ml cloroform. Lắc nhẹ, gạt bỏ lớp nước. giữ lớp cloroform để làm phản ứng. Lấy 1ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1ml dung dịch NaOH 10%. Lắc nhẹ. Phản ứng dương tính nếu lớp nước có màu đỏ sim.
• Vi thăng hoa
Trải bột dược liệu thành lớp mỏng trong một nắp chai bằng nhôm, đốt nhẹ trên
đèn cồn để loại nước. Sau đó đậy lên nắp nhôm một miếng lam kính, bên trên có miếng bông đã thấm nước, tiếp tục đun nóng trong khoảng 5-10 phút. Lấy lam kính ra để nguội, soi kính hiển vi. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện tinh thể hình kim màu vàng trên lam kính.
+ Định tính tanin
Cho 2g bột củ Nưa vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nước cất. Đun sôi trực tiếp 5 phút. Lọc qua giấy lọc gấp nếp. Lấy dịch lọc chia làm 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml, đem làm các phản ứng định tính.
20
• Phản ứng với protein
Ống 1: Thêm vào 1 giọt dung dịch gelatin 1% mới pha. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện kết tủa bông trắng.
• Phản ứng với ion kim loại nặng
Ống 2: Thêm vào vài giọt FeCl3 5%. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện kết
tủa xanh đen.
Ống 3: Thêm vào vài giọt chì acetat 10%. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện kết tủa bông.
+ Định tính đường khử
Cân khoảng 2g bột củ Nưa cho vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nước cất, đun sôi vài phút. Lọc qua giấy vào 1 ống nghiệm khác. Thêm 1ml dung dịch thuốc thử
Felling A và 1ml dung dịch Felling B. Đun cách thủy sôi vài phút. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa đỏ gạch.
+ Định tính polysaccharid
Lấy 2g bột củ Nưa cho vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nước cất. Đun sôi cách thủy vài phút. Lọc qua giấy lọc lấy dịch. Cho vào 3 ống nghiệm.
Ống 1: 4ml dịch chiết + 5 giọt thuốc thử Lugol.
Ống 2: 4ml nước cất + 5 giọt thuốc thử Lugol.
Ống 3: 4ml dịch chiết.
Phản ứng dương tính nếu màu của ống 1 đậm hơn màu ống 2, màu ống 2 đậm hơn ống 3.
+ Định tính acid amin
Lấy 2g bột củ Nưa cho vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nước cất, đun sôi vài phút. Lọc qua giấy lọc vào 1 ống nghiệm khác. Thêm vài giọt thuốc thử Ninhydrin 3%. Đun cách thủy sôi vài phút. Phản ứng dương tính nếu ống nghiệm xuất hiện màu xanh.
+ Định tính acid hữu cơ
Cho 2g bột củ Nưa vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nước cất. Đun sôi trực tiếp vài phút trên ngọn lửa đèn cồn. Để nguội và lọc qua giấy lọc. Thêm vào dịch lọc một ít bột Na2CO3. Phản ứng dương tính nếu ống nghiệm xuất hiện bọt khí CO2 bay lên.
21
+ Định tính flavonoid
Lấy 2g bột củ Nưa cho vào bình nón dung tích 50ml. Thêm 20ml ethanol 90%.
Đun cách thủy sôi trong vài phút. Lọc nóng qua giấy lọc. Dịch chiết đem tiến hành các phản ứng định tính.
• Phản ứng Cyanidin (Phản ứng Shinoda)
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết. Thêm một ít bột magnesi kim loại (khoảng 10mg). Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3 - 5 giọt). Để yên một vài phút. Phản
ứng dương tính khi dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ.
• Phản ứng với kiềm
Bước 1: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ. Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% sau đó thêm 1ml nước cất. Phản ứng dương tính khi ống nghiệm xuất hiện tủa vàng.
Bước 2: Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc. Hơ khô rồi để lên miệng lọ
amoniac đặc đã được mở nút. Nhỏ một giọt khác lên giấy lọc để so sánh. Phản ứng dương tính khi màu vàng của vết dịch chiết tăng lên.
• Phản ứng với FeCl3
Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ. Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%. Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa xanh đậm.
• Phản ứng diazo hóa
Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch kiềm (dung dịch NaOH, Na2CO3), thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha, lắc đều, đun nóng trên nồi cách thủy trong vài phút. Phản ứng dương tính khi dung dịch xuất hiện màu đỏ.
+ Định tính coumarin
Lấy 2g bột củ Nưa rồi cho vào bình nón dung tích 50ml. Thêm 20ml ethanol 90%. Đun cách thủy sôi trong vài phút. Lọc nóng qua giấy lọc. Dịch chiết đem tiến hành các phản ứng định tính sau:
• Phản ứng mởđóng vòng lacton
Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết: Ống 1 thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%. Ống 2 để nguyên. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện các hiện tượng dưới đây.
22
Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi. Để nguội rồi quan sát:
Ống 1 có tủa vàng.
Ống 2 trong.
Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2ml nước cất. Lắc đều rồi quan sát:
Ống 1 trong.
Ống 2 đục.
Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, quan sát:
Ống 1 đục.
Ống 2 trong.
• Phản ứng diazo hóa
Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ. Thêm vào 2ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thủy đến sôi rồi để nguội. Nhỏ vào giọt thuốc thử diazo. Phản ứng dương tính khi dung dịch xuất hiện màu đỏ.
• Quan sát huỳnh quang của các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoại khi tác dụng với dung dịch kiềm (phản ứng chuyển từđồng phân cis sang đồng phân trans dưới tác dụng của tia tử ngoại)
Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy thấm. Nhỏ tiếp vài giọt dung dịch NaOH 5%. Sấy nhẹ. Che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng một miếng kim loại (chìa khóa, đồng xu…) rồi chiếu tia tử ngoại trong một vài phút. Bỏ miếng kim loại ra, quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại. Phản ứng dương tính nếu phần không bị che có huỳnh quang sáng hơn phần bị che.
+ Phản ứng định tính glycosid tim
Cân 5g bột củ Nưa cho vào bình nón dung tích 250ml. Thêm 100ml ethanol 25% rồi ngâm trong 24 giờ. Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ dung tích 100ml. Thêm vài ml chì acetat 30%, khuấy đều. Để lắng, lọc dịch qua giấy lọc vào một cốc có mỏ
dung tích 100ml. Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào một ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat. Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm tiếp chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thửđến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat.
Chuyển dịch lọc vào một bình gạn dung tích 100ml. Lắc dịch chiết với hỗn hợp cloroform – ethanol (4:1), lắc 2 lần, mỗi lần 8ml. Gạn lớp dịch chiết cloroform
23
– ethanol vào một cốc có mỏđã được sấy khô. Gộp các dịch chiết cloroform và loại nước bằng natri sulfat khan.
Chia đều dịch chiết vào 4 ống nghiệm nhỏđã được sấy khô. Đem cô cách thủy
đến khô. Cắn thu được đem tiến hành làm các phản ứng định tính.
• Phản ứng của khung steroid: Phản ứng Liebermann – Burchardt
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn. Nghiêng ống 450. Thêm từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Phản ứng dương tính khi ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện một vòng màu tím đỏ.
• Phản ứng của vòng lacton 5 cạnh
- Phản ứng Baljet
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết
cắn. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha (1 phần dung dịch acid picric 1% và 9
phần dung dịch NaOH 10%). So sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn
glycosid tim. Phản ứng dương tính nếu ống thử có màu đỏ cam đậm hơn ống chứng.
- Phản ứng Legal
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ 1 giọt thuốc thử natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%. Lắc đều sẽ xuất hiện màu đỏ cam. So sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn glycosid tim. Phản ứng dương tính nếu ống thử có màu đỏ đậm hơn
ống chứng.
- Phản ứng của phần đường 2,6 – desoxy: Phản ứng Keller – Kiliani
Cho vào ống nghiệm chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong acid acetic. Lắc đều. Nghiêng ống 450. Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Phản ứng dương tính khi ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện vòng màu đỏ tím.
+ Định tính alcaloid
Cân 5g bột củ Nưa, cho vào bình nón dung tích 50ml, thấm ẩm bằng dung dịch ammoniac đặc. Đậy kín để khoảng 30 phút. Cho 15ml chloroform lắc đều
24
trong 1h. Lọc qua giấy lọc lấy dịch chiết cho vào bình gạn. Sau đó lắc kỹ 2 lần, mỗi lần với 10ml dung dịch H2SO4 1N. Để phân lớp, gạn lấy dịch chiết acid, chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1ml. Nhỏ vào từng ống nghiệm 2-3 giọt lần lượt các thuốc thử sau:
Ống 1: Thuốc thử Mayer: Phản ứng dương tính nếu có kết tủa trắng
Ống 2: thuốc thử Bouchardat: Phản ứng dương tính nếu có kết tủa nâu.
Ống 3: Thuốc thử Dragendorff: Phản ứng dương tính nếu có kết tủa đỏ cam.
+ Định tính chất béo, steroid, caroten
Lấy 5g bột củ Nưa vào bình nón dung tích 50ml, đổ ngập ether dầu hỏa, bọc kín, ngâm 24 giờ. Lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc. Chia dịch lọc làm 3 phần
đểđịnh tính như sau:
• Định tính chất béo
Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên mảnh giấy trắng, sấy nhẹ cho bay hết hơi dung môi. Phản ứng dương tính nếu trên giấy có để lại vết mờ.
• Định tính steroid
Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, cô cách thủy đến cắn. Thêm vào ống nghiệm khoảng 1ml anhydrid acetic, lắc kỹ cho tan hết cắn. Để nghiêng ống nghiệm 45độ, thêm từ từ H2SO4đặc theo thành ống nghiệm, tránh làm xáo trộn các lớp chất lỏng. Phản ứng dương tính nếu mặt phân cách giữa 2 lớp chất lỏng có vòng tím đỏ, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá.
•Định tính caroten
Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, cô cách thủy đến cắn, nhỏ vài giọt H2SO4 đặc vào cắn. Phản ứng dương tính nếu dung dịch có màu xanh lá.
2.2.3.2. Sắc ký lớp mỏng
+ Chuẩn bị dịch chiết
- Dịch chiết methanol: Ngâm 10g bột củ Nưa trong 20 ml methanol trong vòng 24h. Lọc qua giấy lọc lấy dịch lọc trong, bốc hơi dịch lọc đến khi còn khoảng 0,5 ml để lấy dịch chấm sắc ký.
- Dịch chiết cloroform: Ngâm 10g bột củ Nưa trong 20 ml methanol trong vòng 24h. Lọc qua giấy lọc lấy dịch trong. Thêm đồng lượng HCl 10%. Thủy phân trong
25
vòng 3 giờở nhiệt độ 100°C. Để nguội, chuyển dịch thủy phân vào bình gạn 50ml. Lắc với CHCl3 3 lần, mỗi lần 5ml. Gộp các dịch chiết CHCl3 vào một cốc có mỏ
sạch. Bốc hơi dung môi đến khi còn khoảng 0,5 ml để lấy dịch chấm sắc ký.
+ Tiến hành
- Sử dụng bản mỏng Silicagel 60F254 tráng sẵn của Merck, hoạt hóa ở 110oC trong
1 giờ, bảo quản trong bình hút ẩm.
- Chấm sắc ký bằng máy chấm sắc ký CAMAG LINOMAT 5.
- Khai triển trong dung môi thích hợp.
- Hiện vết ở các bước sóng 254nm và 366nm, phun thuốc thử hiện màu Vanilin - H2SO4.
- Chụp ảnh và phân tích sắc ký bằng phần mềm winCATS và VideoScan.
2.2.4. Xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm dược liệu
Từ kết quả nghiên cứu về thực vật, hóa học, tiến hành xây dựng một số chỉ
tiêu kiểm nghiệm dược liệu. Một số chỉ tiêu được xây dựng là:
- Mô tả
- Vi phẫu
- Bột
