Độ tan của canxi hyđroxyd trong nước ở 25°c là 0,159 g/cm^ [20]. Với lượng dung môi dùng đủ để ngập dược liệu và 2 lần chiết thì khối lượng canxi hyđroxyd sẽ gấp khoảng 200 lần lượng cần dùng. Vì vậy chúng tôi khảo sát ở hai nồng độ vôi là dung dịch nước vôi trong và hỗn dịch nước vôi 1%. Tiến hành so sánh với dung môi chiết là dung dịch acid sulfuric 0,4% ở cùng điều kiện chiết xuất.
22
Tiến hành chiết xuất với 300 gam vàng đắng, một lít dung môi cho 1 lần chiết (chiết ba lần) theo các bước như mục 2.3.3. Thí nghiệm được thực hiện 3 lần. kết quả được ghi lại ở bảng 3.3:
Bảng 3.3. .Hiệu suất chiết berberỉn với các dung môi khác nhau.
Dung môi chiết
Khôi lượng dươc liêu• •
(g)
Sản phàm berberin clorid thô
Hiêu suất chiết (%) Khối lượng (g) Hàm lượng (%)
Acid sulíUric
0,4% 300 13,37 ±0,96 81,14 87,35
Nước vôi
trong 300 13,17 ±0,92 85,27 90,42
Nước vôi 1 % 300 13,27 ±0,93 84,85 90,65
Nhận xét: Với cùng một quy trình chiết xuất như nhau thì berberin thô thu được với dung môi là dung dịch nước vôi và hỗn dịch nước vôi 1% có hàm lượng berberin clorid ( lần lượt là 85,27% và 84,85%) cao hơn so với dung môi là acid sulfiiric 0,4% (81,14%).
Với dung dịch nước vôi trong và dung dịch nước vôi 1% cho khối lượng berberin thô và hàm lượng berberin clorid thu được là gần như nhau. Vì vậy nồng độ vôi được chúng tôi lựa chọn là nước vôi trong.
Ngoài ra, khi tiến hành chiết xuất, ở mỗi bước như: rút dịch chiết, rửa tủa thô thì quá trình thao tác với dung dịch nước vôi dễ dàng hơn và tốn ít thời gian hơn rất nhiều so với dung dịch acid sulfiiric 0,4% có thể vì với dung môi là acid thì dịch chiết nhớt nên khó rút kiệt, tủa thô cũng nhiều chất nhày hơn nên khó rửa sạch hơn, hay bị tắc giấy lọc .
23
Berberin clorid thô với dung môi là nước vôi
trong
Berberin clorid thô với Berberin clorid thô với dung môi là nước vôi dung môi là acid sulíìiric
1% 0,4%
Hình 3.2. Hình ảnh sản phẩm berberỉn clorid thô
3.4. Xác định số lần chiết thích hợp
Trong quá trình chiết xuất nếu số lần chiết ít sẽ không chiết kiệt được hoạt chất, làm giảm hiệu suất. Ngược lại, nếu số lần chiết nhiều gây tốn kém dung môi đồng thời thể tích dịch chiết lớn, khi kết tủa berberin bằng natri clorid sẽ khó triệt để. Do đó cần phải lựa chọn số lần chiết thích hợp.
Để lựa chọn số lần chiết thích hợp, chúng tôi tiến hành chiết xuất 300 gam vàng đắng với số lần chiết là 1, 2, 3 và 4 lần như mục 2.3.3. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần với hai dung môi là dung dịch nước vôi trong và dung dịch acid sulHiric 0,4%. Ket quả được ghi lại như bảng 3.4. và bảng 3.5.
Bảng 3.4. Hiệu suất chiết berberin với sổ lần chiết khác nhau bằng dung dịch nước vôi trong.
Số lần chiết Khôi lượng dược liệu (gam) Tông thê tích dung môi (lít) Khôi lượng berberỉn thô (gam) Hiệu suât chiết (%) ỉ lần 300 1,0 10,21 ±0,62 70,10
24
2 lần 300 2 ,0 12,85 ±0,80 8 8 ,2 2
3 lần 300 3,0 13,17 ±0,92 90,42
4 lần 300 4,0 12,95 ±0,97 88,91
Nhân xét:
Theo bảng 3.4, khi tiến hành chiểt 3 lần với một mẫu dược liệu bằng dung dịch nước vôi trong thì thu được nhiều sản phẩm nhất. Tuy nhiên so với việc chiết 2 lần thì sản phẩm thu được nhiều hơn không đáng kể mà lại tốn dung môi, công và thời gian. Vì vậy chúng tôi lựa chọn chiết 2 lần để quá trình chiết là tối ưu.
Bảng 3.5. Hiệu suất chiết herherỉn với số ỉần chiết khác nhau bằng dung dịch acid sulfuric 0,4%. Sổ lần chiết Khôi lượng dược liệu (gam) Tông thê tích dung môi (lừ) Khôi lượng berberin thô (gam) Hiệu suât chiết (%) 1 lần 300 1,0 7,52 ± 0,66 49,13 2 lần 300 2 ,0 10,11 ±0,87 66,05 3 lần 300 3,0 13,37 ±0,96 87,35 4 lần 300 4,0 13,52 ±0,99 88,32
25 Hiệu suất(%) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 ■ nước vôi acid số lần chiết 1 lần 2 lần 3 lần 4 lần
Hình 3.3: Biểu đồ so sảnh hiệu suất chiết berberỉn với số lần chiết khác nhau và dung môi khác nhau
Nhận xét:
Từ hình 3.3 và hai bảng 3.4 , 3.5 chúng ta thấy rằng: với dung môi là nước vôi trong sau 2 lần chiết thì dược liệu gần như đã được chiết kiệt (8 8,2 2% gần bằng chiết 3 lần là 90,42%), còn với dung môi là acid sulfuric 0,4% thì sau 4 lần chiết dược liệu vẫn chưa được chiết kiệt (88,32%).
3.5. Tinh chế berberin thô
Berberin thường được tinh chế bằng cách tẩy màu bằng than hoạt và kết tinh lại ừong ethanol hoặc nước [4]. Vì vậy, chúng tôi tiến hành kết tinh lại berberin clorid trong các dung môi ethanol 96%, ethanol 50% và trong nước cất.
Tiến hành kết tinh lại với 2 gam berberin thô với 20 ml dung môi và 0,05 gam than hoạt như mục 2.3.4 và xác định hàm lượng berberin clorid trong sản phẩm tinh chế như mục 2.3.1 với các dung môi tinh chế là ethanol 96%, ethanol 50% và nước cất. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Kết quả được ghi lại như bảng 3.6.
26
Bảng 3.6. Hiệu suất tỉnh chế và độ tỉnh khiết của berberin cỉorid
Dung môi Khối lượng berberin thô (gam) Thê tích dung môi kết tinh (ml) Khôi lượng sản phẩm kết tinh (gam) Hàm lượng berberìn clorid (%) Hìêu• suất (%) Ethanol 96% 2 2 0 1,44 ±0,06 92,14 75,20 Ethanol 50% 2 2 0 1,61 ±0,05 91,98 83,93 Nước cất 2 2 0 1,72 ±0,07 88,33 8 6 ,1 0
Nhận xét: Theo bảng 3.6 thì hàm lượng berberin clorid sau khi tinh chế của các mẫu là tương đương nhau (khoảng 92%) với dung môi tinh chế là ethanol 96% và ethanol 50%, tuy nhiên với ethanol 50% cho khối lượng sản phẩm nhiều hơn và thao tác dễ hơn. Vì vậy chúng tôi lựa chọn dung môi tinh chế là ethanol 50%.
Giai đoạn lọc dịch berberin thô hòa tan trong dung môi tinh chế với mẫu tàa sử dụng dung môi chiết là dung dịch acid sulfuric 0,4% tiến hành rất khó khăn, phải thay giấy lọc nhiều lần do lẫn nhiều tạp (chủ yếu là chất nhầy) gây tắc giấy lọc. Mặt khác, do lọc nóng bằng phễu buchner nên dịch lọc tạo nhiều bọt và dễ trào ngược.
Giai đoạn lọc dịch của tủa berberin clorid thô hòa tan ừong dung môi tinh chế với berberin thô thu được khi chiết bằng dung dịch nước vôi ừong thì dễ lọc, không phải thay giấy.
Sản phẩm berberin clorid sau khi tẩy màu và kết tinh lại chỉ đạt hàm lượng 88,33 - 92,14 % ( bảng 3.6), chưa đạt hàm lượng theo qui định DĐVNIV.
27
Vì vậy chúng tôi tiến hành kết tinh lại sản phẩm đã tinh chế một lần bằng eửiannol 50%. Thí nghiệm được tiến hành như sau: Cân 2gam berberin clorid đã tinh chế 1 lần hòa tan trong 15 ml dung môi tinh chế. Đun cách thủy ở 80°c,
khuấy trong 10 phút. Lọc nóng trên phễu Buchner để loại tạp, thu dịch lọc. Đậy kín dịch lọc bằng màng PE, để kết tinh qua đêm ở nhiệt độ phòng. Lọc lấy tinh thể trên phễu Buchner. sấy tinh thể trong tủ sấy ở 60°c. Kết quả được ghi lại trong bảng 3.7.
Bảng 3.7: Hàm lượng berberỉn clorid tinh chế lần 2
Lần Khối lượng berberin (gam) Thê tích dung môi ìâ t tình (ml) Khối lượng sản phẩm kết tinh (gam) Hàm lượng berberìn clorid (%) Lần 1 2 15 1,82 98,55 Lần 2 2 15 1,85 98,76 Lần 3 2 15 1,80 99,01 TB 2 15 1,82 ± 0,03 98,77 ± 0,24 é ; ^ 1 " ' , \ f ị
28
clorid thô của dm chiêt là nước vôi trong với ethanol 96%
clorid thô của dm chiêt là nước vôi trong với ethanol 50%
; Sản phẩm tinh chế của tủa berberin
clorid thô của dm chiết là nước vôi trong với nước
Sản phẩm tinh chế của tủa berberin clorid thô của dm chiết là acid sulfuric
0,4% với ethanol 96%
Hình 3.4. Hĩnh ảnh sản phẩm berberin tinh chế
Từ những két quả thu được, chúng tôi đề xuất phương pháp chiết xuất berberin từ vàng đắng bằng nước vôi trong sơ đồ như hình 3.4. và hình 3.5.
29
y r r r
30
31
Chương 4. KÉT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT
Kết luân:
1. Đã khảo sát sử dụng dung dịch nước vôi để chiết xuất berberin tò vàng đắng. Các thông số chiết thích họp là:
• Dung môi: nước vôi trong.
• Tỉ lệ dung m ô i : dược liệu (2 l í t : 300 g). • Phương pháp chiết: ngâm lạnh.
• Số lần chiết: 2 lần.
• Kết tủa berberin tò dịch chiết bằng natri clorid.
• Tẩy màu bằng than hoạt và kết tinh lại trong ethanol 50%.
Với các thông số chiết xuất như trên, sản phẩm berberin thô đạt hiệu suất chiết là 88,22% và có độ tinh khiết là 85,27%.
2. Đã khảo sát ba dung môi để tinh chế berberin là ethanol 96%, ethanol 50% và nước. Kết quả cho thấy: ethanol 50% là thích hợp nhất (hiệu suất và độ tinh khiết cao, dễ thao tác). Sau khi tinh chế 1 lần có độ tinh khiết là 91,98%. Tiếp tục kết tinh lại lần 2 thu được berberin clorid tinh khiết có hàm lượng 98,77%. Hiệu suất toàn chặng là 72,35%.
3. So sánh với phưong pháp chiết bằng dung dịch acid sulfuric 0,4%, dùng dung môi chiết là dung dịch nước vôi trong có những ưu điểm sau:
• Chiết nhanh kiệt hơn: sau 2 lần chiết đạt hiệu suất là 88,22% ( với dung môi chiết là acid sulfuric 0,4% thì sau 3 lần chiết hiệu suất mới đạt 87,35%).
• Dung môi chiết phổ biến, rẻ tiền. Phưong pháp chiết đơn giản đơn giản và dễ thực hiện.
• Dụng cụ chiết không cần dùng vật liệu đặc biệt (chịu được acid).
• Các thao tác: tiến hành dễ dàng hơn. Sản phẩm thô dễ tinh chế hơn, sản phẩm tinh khiết hơn, tốn ít hóa chất để tinh chế hơn.
32
Sử dụng dung môi chiết mới là nước vôi ừong cho hiệu quả cao hơn khi sử dụng dung môi acid sulfuric 0,4%.
Đề xuất: Tiếp tục nghiên cứu phưong pháp chiết xuất berberin từ vàng đắng bằng dung dịch nước vôi ở quy mô lớn hơn.
TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI
12. Bhutada p. et al(2010), “Anticonvulsant activity of berberine, an isoquinoline alkaloid in mice”, Epilepsy & Behavior, 18, pp. 207 - 210.
13. Battu S. K. (2010), “Physicochemical Characterization of Berberine Chloride: A Perspective in the Development of a Solution Dosage Form for Oral Delivery”, AAPSPharmSciTech, 11(3), pp. 1466-1475.
14. Kong Wei-Jia et al.(2008), “Combination of simvastatin with berberin improves the lipid-lowering efficacy”, Metabolism Clinical and Experimental,
57, pp. 1029-1037.
15. Kulkami s. K.(2008), “On the mechanism of antidepressant-like action of berberine chloride”, European Journal o f Pharmacology, 589, pp. 163-
172.
16. Merck & Company Incorporated (2001), The Merk Index, 13* edition, pp. 197, 1252-1253.
17. Patil J. B. et al(2010), “Berberine induces apoptosis in breast cancer cells (MCF-7) through mitochondrial-dependent pathway”, European Journal o f Pharmacology^ 645, pp. 70-78.
18. Pharmaceutical Press (1996), Martindale - The extra pharmacopoeia,
31* edition, p. 1678.
19. Singh A. et al(2010), “Berberin; Alkaloid with wide spectrum of pharmacological activities”, IJournal o f Natural Products, 3, pp. 64 - 75.
20. University of the Sciences in Philadelphia(2006), The Science And Practice o f Pharmacy, Office of the Librarian of Congress, USA. pp. 1084.
21. Zhou- Xi-Qiao et al.(2008), “Neuroprotective effects of berberine on stroke modes in vitro and vivo”, Neuroscience Letters, 447, pp. 31-36.
PHU LUC
Mot so hinh änh sac ky do cua berberin trong cac mau
300 200 100 Z) < E 600 400 200 PDA-345 nm berberin hamiuongtrongduociieu-14'.dat Retention Time Area 7) \ to.. V__i ■... ^ . ... 1 ... — CO 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Minutes r
Hinh 1: Sac ky do berberin trong diro’c lieu
PDA-345 nm berberin mauchuan-13.dat Retention Time Area to K o V . CO 4 5 Minutes r ^ ^
800 600 I 400 200 PDA-345 nm --- berberin mauchuantinhche-12.dat Retention Time Area 3 4 Minutes
Hình 3: sắc ký đồ berberin trong mẫu tinh khiết
800 600 400 200 PDA-345 nm berberin tuathoacld-5.dat Retention Time Area iỉ i 'í^ \ 5 V 1 sL ! ■ ' ... ... . - . . ... .. .... ... ... CO 3 4 Minutes
Hình 4: sắc ký đồ berberin trong berberin thô với dung môi là dung dịch acid sulfuric 0,4%
800 600 200 PDA-345 nm --- berberin tuathobasetrong-6.dat Retention Time Area 3 4 Minutes
Hình 5: sắc ký đồ berberin trong berberin thô với dung môi chiết là dung dịch nước vôi trong