6.1.Các phương pháp định tính ankaloid
6.1.1. Định tính ankaloid bằng phương pháp hóa học
6.1.1.1. phản ứng tạo kết tủa
Để xác định xem trong dược liệu của ankaloid hay không thì trước tiên phải thực hiện phản ứng với thuốc thử tạo kết tủa.
- Thường dùng thuốc thử Mayer, thuốc thử Bouchardat, thuốc thử Dragendorff.
- Phản ứng phải thực hiện trong môi trường acid
6.1.1.2. phản ứng tạo màu
Sau khi kết luận trong dược liệu có ankaloid, muốn biết đó là loại ankaloid gì hoặc có cấu trúc khung gì thì cần phải thực hiện phản ứng tạo màu hoặc phản ứng đặc hiệu
Một số ví dụ:
- Dịch chiết hạt Mã Tiền + HNO3 đậm đặc xuất hiện màu đỏ máu (có Brucin)
- Dịch chiết cà độc dược + T.T Mandelin xuất hiện màu đỏ ( có scopolamin)
- Dịch chiết là Hyoscyamus + T.T wasicky đun nóng xuất hiện màu đỏ tím (có hyoskyamin)
Một số phản ứng tạo màu đặc hiệu: - Phản ứng Vitali
- Phản ứng Van-urk - Phản ứng Murexid - Phản ứng OTTO
Một số ankaloid dễ dàng tạo muối dạng tinh thể. Có thể làm phản ứng trên tấm kính rồi quan sát tinh thể trên kính hiển vi
Ví dụ: Hoàng Liên, Hoàng Đằng, Hồng Đắng
Cho 1, 2 giọt dịch chiết lên phiến kính rồi nhỏ vào đó 1, 2 giọt HCL đặc, sau 10 phút đối với dịch chiết đem soi dưới kính hiển vi sẽ quan sát thấy những tinh thể hình kim màu vàng của muối berberin hoặc palmatin.
6.1.1.4. Vi thăng hoa
Có 1 số ankaloid thăng hoa được ví dụ như cafein trong cà phê, ephedrin trong ma hồng có thể vi thăng hoa rổi quan sát tinh thế dưới kính hiển vi hoặc làm phản ứng định tính sau khi thăng hoa.
6.1.2. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
• Chất hấp phụ Silicagel G ( Merck) có thể tự tráng hoặc hoặc dựng bản mỏng tráng sẵn. Để ở nhiệt độ phòng cho khô rồi hoạt hóa ở 100oC – 105oC trong vòng 1h, để nguội và cho vào bình hút ẩm.
• Chuẩn bị dịch chấm sắc ký: Lấy cao dược liệu đã được chiết hòa tan vừa đủ với 1 lượng methanol để chấm sắc ký.
• Hệ dung môi khai triển: Tùy theo cấu trúc ankaloid trong dược liệu mà ta lựa chọn các hệ dung môi khai triển thích hợp.
Ankaloid trong của bình vôi: CHCl3: MeOH (9:1) hoặc toluen : aceton : EtOH : NH3 ( 45: 45 : 7 : 3)
Ankaloid trong lá Sen: CHCl3 : MeOH : NH4OH (50 : 9 : 1) Ạnkaloid trong lá vông: CHCl3: aceton : NH4OH ( 50 : 9 : 1) Ankaloid trong dạ cẩm: n- Butanol : CH3COOH : H2O ( 5:1 : 4) Ankaloid trong bách bộ: CH3Cl : MeOH : NH4OH ( 50 : 9 : 1) Ankaloid trong ba gạc: CH3Cl : MeOH : NH4OH ( 50 : 9 : 0,5 ) Ankaloid trong mã tiền: CH3Cl : MeOH : NH4OH ( 50: 9 : 1)
Ankaloid trong hoàng đằng: n-butanol : CH3COOH : H2O (7 : 1 : 2) • Thuốc thử phun hiện màu: Đa số dựng thuốc thử Dragendorff pha theo
phát hiện cafein có thể phun dung dịch Iod sau đó phun H2SO4 3N. Cafein sẽ tạo với Iod trong môi trường acid màu đỏ nâu của cafein- periodid.
alkaloid trong rễ cây ba gạc có thể phun hỗn hợp acid percloric và FeCl3 sẽ xuất hiện màu xanh hoặc phun HNO3 bốc khói sẽ xuất hiện màu tím của ajimalicin
ankaloid trong vỏ canhkina: phun acid Focmic sau đó soi dưới đen UV sẽ có huỳnh quang xanh đậm.
ankaloid trong cựa khỏa mạch có thể phun thuốc thư Van- Urk sẽ xuất hiện màu xanh lam.
6.2. Các phương pháp định lượng Ankaloid
6.2.1. Phương pháp cân
• phương pháp cân sử dụng khi.
Ankaloid có tính base rất yếu, những ankaloid này không chuẩn độ được bằng phương pháp acid- base vì hằng số điện ly quá bộ sẽ không có bước nhảy điện thế trên đường cong chuẩn độ nên sẽ không quan sát được sự chuyển màu rõ rệt của chỉ thị.
Những ankaloid đang nghiên cứu chưa xác định rõ cấu trúc hóa học.
Cần định lượng hỗn hợp nhiều ankaloid mà trong đó các ankaloid có phân tử lượng rất khác nhau
• Quá trình tiến hành.
Chiết lấy ankaloid, loại tối đa các tạp chất, cất thu hồi dung môi, bốc hơi tới khô
Sấy cao ở nhiệt độ thích hợp đến khối lượng không đổi, đem cân Tính kết quả ra hàm lượng % ankaloid trong dược liệu khô tuyệt
đối.
6.2.2. Phương pháp acid-base
• Định lượng ankaloid bằng phương pháp trung hòa khi: Ankaloid trong dược liệu chiết ra ở dạng base
Phải biết khối lượng phân tử của ankaloid cần định lượng để tính đương lượng với acid cần chuẩn độ
• Dịch chiết ankaloid trước khi định lượng phải:
Không lẫn chất kiềm như amoniac, các amin sẽ gây sai số thừa Không lẫn chất màu, chất béo làm cho khi chuẩn độ khó quan sát
vùng chuyển màu chỉ thị
Dung dịch ankaloid phải trong, vì có ít vẩn đục hay ít nhũ dịch sẽ gây ra hiện tượng hấp phụ các chấy kiềm làm cho kết quả định lượng sai số thừa
• Khắc phục các hiện tượng trên bằng cách:
Đối với amoniac và các amin người ta lợi dụng tính chất dễ bay hơi của nó. Sau khi bốc hơi hết dung môi hữu cơ thường cho cặn ankaloid base vào sấy ở 100oC trong vòng 30 phút đến 60 phút. Đối với chất béo nêu dược liệu là quả , hạt chứa nhiều chất béo
người ta thường chiết với eter dầu hỏa loại chất béo trước khi chiết ankaloid .Nếu có ít chất béo lẫn vào dung dịch ankaloid thì khắc phục bằng cách cho thêm 1 ít eter dầu hỏa vào, lắc để chất béo tan vào với eter nối lên trên sẽ không làm ảnh hưởng tới việc quan sát vùng chuyển màu của chất chỉ thị
Chất màu thường được loại đi bằng cách chuyển từ dạng base sang dạng muối và ngược lại. Khi cần thiết mới dựng chất hấp phụ màu. • Sau khi có dịch chiết ankaloid trong dung môi hữu cơ có thế đem đi định
lượng gián tiếp bằng cách đem lắc với 1 lượng chính xác dung dịch acid dư, sau đó gạn lấy lớp acid, định lượng acid thừa bằng base tương ứng, hoặc cho bốc hơi dung môi hữu cơ, cặn ankaloid còn lại được hòa tan với 1 lượng chính xác dung dịch acid chuẩn độ dư rồi định lượng acid thừa bằng kiềm tương ứng.
• Acid chuẩn độ thường là HCl, H2SO4 có nồng độ từ 0.01- 0,1N hoặc 0,01-0,1M.
• Chỉ thị màu thường dùng là đỏ methyl, vì theo lý thuyết cũng như thực tế pH của hầu hết các muối ankaloid đều có vùng chuyển màu của chỉ thị
• Tính toán kết quả: Khi định lượng nhiều ankaloid trong dược liệu người ta thường tính kết quả theo một ankaoloid chính trong đó. Ví dụ định lượng ankaloid toàn phần trong lá benladon thì tính theo hyoscyamin , định lượng ankaloid trong Ma Hồng thì tính theo epherdrin…
Những ankaloid có tính base rất yếu nên nếu chuẩn độ acid-base trong môi trong môi trường dung dịch nước sẽ không chính xác nên người ta thường hòa tan ankaloid vào dung môi không phải là nước, thường dùng aicd acetic khan để định lượng hoặc thường dùng acid percloric 0,1N để chỉ thị và chỉ thị màu là tím tinh thể.Căn cứ vào lượng acid percloric tiêu thụ sẽ tính ra lượng alkaloid có trong dược liệu.
6.2.3. Phương pháp so màu
Hầu hết các alkaloid không có màu nên để định lượng theo phương pháp này thì phải tạo ra dung dịch có màu theo nguyên tắc sau:
• Dựa vào phản ứng tạo màu của alkaloid với thuốc thử thích hợp.ví dụ alkaloid trong cựa khỏa mạch tạo màu xanh lơ với p-dimethyl- amino-benzaldehyde ở môi trường H2SO4 đặc
• Tạo ra tủa có màu với alkaloid, sau đó lấy riêng tủa hòa trong dung môi thích hợp tạo ra dung dịch có màu. Ví dụ alkaloid trong vỏ canhkina phản ứng với thuốc thử reinecke tạo ra tủa reineckat alkaloid có màu, lấy riêng phẩn tủa đêm hòa tan trong aceton tạo ra dung dịch có màu để định lượng
• Thực hiện phản ứng biến đổi alkaloid thành chất dẫn có màu. Ví dụ biến đổi morphin thành 2-nitrosomorphin có màu đỏ đậm trong môi trường kiềm.
• Thực hiện phản ứng giáng phân, cắt alkaloid thành những phần nhỏ, lấy riêng phần cần thiết ra rồi cho tác dụng với thuốc thử thích hợp tạo ra dung dịch có màu để định lượng.
• Định lượng alkaloid bằng phương pháp so màu phải tuân theo định luật lam bert-beer nên phải tìm được điều kiện thích hợp trong giới hạn cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ alkaloid.
6.2.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Phương pháp HPLC có độ chính xác và độ nhạy cao, có tính đặc hiệu, thực hiện tương đối nhanh và thuận tiện, có thể áp dụng để định lượng alkaloid trong dược liệu. Để tiến hành định lương bằng HPLC cần phải:
• Có alakaloid tinh khiết làm chuẩn
• Xây dựng phương pháo chiết kiệt alkaloid trong dược liệu đáp ứng yêu cầu định lượng
• Xây dựng được chương trình trên máy HPLC ( pha tĩnh, pha động, detetor, tốc độ dòng, thể tích tiêm, nhiệt độ phân tích ).