Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng có phổ diệt sâu hại khá rộng, chúng có thể ký sinh trên nhiều loài sâu hại khác nhau. Tuy nhiên, khả năng ký sinh gây chết đối với từng loài sâu của từng chủng tuyến trùng lại rất khác nhau. Khả năng ký sinh gây chết vật chủ của tuyến trùng phụ thuộc chủ yếu vào độc tố và khả năng sản sinh của vi khuẩn cộng sinh. Khả năng ký sinh gây chết vật chủ là điều kiện quan trọng nhất khi quyết định sử dụng một chủng tuyến trùng trong phòng trừ một loài sâu hại. Một trong những chỉ số quan trọng để đánh giá khả năng ký sinh gây chết vật chủ của một chủng tuyến trùng là chỉ số LC50 hay còn gọi là liều gây chết 50% là số lượng tuyến trùng gây chết 50% vật chủ. Một chủng tuyến trùng có có chỉ số LC50 càng thấp chứng tỏ độc tính của chúng càng cao và càng có tiềm năng trở thành tác nhân sinh học trong phòng trừ loài sâu hại đó.
Hiệu lực của chủng S-DL13 trên vật chủ là ấu trùng BSL được trình bày ở Bảng 3.5. Kết quả thử nghiệm cho thấy mỗi tương quan chặt chẽ giữa số lượng gây nhiễm ban đầu và tỷ lệ sâu chết thể hiện qua xử lý thống kê PROBIT (Hình 3.9). Số lượng gây nhiễm ban đầu càng cao thì tỷ lệ sâu chết càng lớn. Ở số lượng gây nhiễm ban đầu là 5 ấu trùng cảm nhiễm, tỷ lệ chết đã đạt 42,22 %. Tỷ lệ chết tăng dần khi tăng số lượng gây nhiễm ban đầu. Và ở số lượng gây nhiễm ban đầu là 40 ấu trùng cảm nhiễm, tỷ lệ chết của chủng S-DL13 đạt 100%.
Bảng 3: Hiệu lực gây chết ấu trùng BSL của chủng S-DL13 Số lượng IJs gây
nhiễm ban đầu Số sâu thí nghiệm Số sâu chết Tỷ lệ chết (%)
0 45 0 0,00 5 45 19 42,22 10 45 27 60,00 20 45 35 77,78 30 45 43 95,56 40 45 45 100,00 50 45 45 100,00
49 60 45 45 100,00 70 45 45 100,00 80 45 45 100,00 90 45 45 100,00 LC50 = 7; LC90 = 22
Giá trị số lượng ấu trùng cảm nhiễm gây chết 50% ấu trùng BSL của chủng S-DL13 là 7 (LC50 = 7). Như vậy, chỉ số LC50 = 7 của chủng S-DL13 khá thấp, điều này cho thấy khả năng gây chết ấu trùng BSL của chủng S-DL13 là khá cao. Như vậy chủng S-DL13 thể hiện độc tính khá cao đối với ấu trùng BSL. Cũng tương tự thí nghiệm đối của De Doucet et al. (1999) cho thấy LC50 của S. rarum = 6, S. feltiae = 9, H. bacteriophora = 3 trên ấu trùng G. mellonella. Lại Phú Hoàng (2006) [6] đã thử nghiệm hiệu lực gây chết của các chủng EPN khác nhau với các loại sâu hại khác nhau, cho thấy chỉ số LC50 biến động rất lớn tùy theo chủng tuyến trùng cũng như tùy theo các loài sâu hại
Hình 3.9: Đồ thị tương quan giữa tỷ lệ ấu trùng BSL chết và số lượng gây nhiễm ban đầu của chủng S-DL13
50
Như vậy để thể hiện được độc lực cho phòng trừ các loài sâu hại khác nhau cần thử nghiệm trên nhiều phổ ký chủ để khẳng định chủng tuyến trùng nào có độc lực với loài sâu nào. De Doucet et al. (1999) vẫn gợi ý tính độc lực của các chủng tuyến trùng dựa trên khả năng sinh sản cũng như gây chết trên ấu trùng BSL trong phòng thí nghiệm trước khi thử nghiệm với các loài sâu hại khác.
51
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI ̣
KẾT LUẬN
1. Đã phân lập được chủng tuyến trùng S-DL13 ký sinh gây bệnh côn trùng từ các vùng cà phê thuộc xã Ea Sin, huyện Krông Búk, tỉnh Đắk Lắk. Tỷ lệ của tuyến trùng trong các mẫu là 0,95 %.
2. Về hình thái chủng tuyến trùng S-DL13 giống loài Steinernema siamkayai
Stock, Somsook & Reid, 1998. Đặc điểm hình thái và hình thái lượng chủng tuyến trùng S-DL13 không có sự biến động nhiều so với mô tả gốc từ mẫu vật Thái Lan nhưng có sự đa dạng về số đo của con cái trưởng thành. Đây là ghi nhận mới đối với Việt Nam.
3. Đặc điểm trình tự 2 đoạn gene 18S-rDNA và D2-D3 của chủng tuyến trùng S-DL13 phân lập ở Việt Nam có sự tương đồng rất cao với trình tự của các chủng khác của loài S. siamkayai,phân lập ở Thái Lan với độ tương đồng là 97-99%.
4. Thời gian để hoàn thành chu kỳ phát triển của ấu trùng cảm nhiễm của tuyến trùng S-DL13 trong cơ thể vật chủ là 8-10 ngày. Tỷ lệ gây chết ấu trùng bướm sáp lớn (G. mellonella) tỷ lệ thuận với số lượng ấu trùng cảm nhiễm gây nhiễm ban đầu. Giá trị LC50 của chủng tuyến trùng S-DL13 đồi với ấu trùng bướm sáp lớn là 7, khá thấp cho thấy độc lực của cả chủng tuyến trùng S-DL13 là tương đối mạnh.
KIẾN NGHỊ
Trên cơ sở nghiên cứu ban đầu về sinh học chủng tuyến trùng S-DL13, chúng tôi đề nghị:
Tiếp tục triển khai nghiên cứu về khả năng nhân nuôi chủng tuyến trùng S- DL13 trên môi trường nhân tạo trong điều kiện in vitro nhằm xác định khả năng sản xuất sinh khối chủng tuyến trùng S-DL13 ở qui mô pilot.
52
trùng S-DL13 nhằm xác định hiệu lực phòng trừ và khả năng áp dụng PTSH các đối tương sâu hại ở Việt Nam.
53
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu trong nƣớc
1 Nguyễn Ngọc Châu (1998),” Nghiên cứu sử dụng tuyến trùng trong phòng trừ sinh học sâu hại cây trồng ở Việt Nam”, Tạp chí Khoa học & Công nghệ
36(2), 24-29.
2 Nguyễn Ngọc Châu (2007), “Tình hình sâu đục thân hại cây ăn quả tại một số trang trại ở Mê Linh, Vĩnh Phúc và khả năng phòng trừ bằng tuyến trùng diệt sâu epn”, Tạp chí BVTV 2 (212), 21-24.
3 Nguyễn Ngọc Châu (2008), Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng ở Việt Nam, Nhà Xuất bản Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội.
4 Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Vũ Thanh (1997), “Phát hiện đầu tiên về nhóm tuyến trùng ký sinh gây bệnh ở côn trùng Việt Nam”, Tạp chí Sinh học 19 (4), 22-29.
5 Nguyễn Ngọc Châu, Vũ Tứ Mỹ, Lại Phú Hoàng, Ngô Xuân Tường (1999), “Hiệu lực gây chết của các chủng tuyến trùng Steinernema sp. TK10 và
Heterorhabditis sp. TK3 đối với một số sâu hại ở cây trồng Việt Nam”, Tạp chí Sinh học 21(2B), 104-113.
6 Lại Phú Hoàng, Nguyễn Ngọc Châu (2004), “Hiệu lực gây chết của chủng tuyến trùng H-MP11 đối với sâu xanh Helicoverpa armigera (Hubner)”, Tạp chí BVTV 6 (198), 27-31.
7 Lại Phú Hoàng, Nguyễn Ngọc Châu (2005), “Hiệu lực diệt sâu xanh
Helicoverpa armigera (Hubner) của chủng tuyến trùng TX1”, Tạp chí Sinh học 27(3A), 87-90.
8 Lại Phú Hoàng, Phạm Hồng Thái, Nguyễn Ngọc Châu, Vũ Tứ Mỹ (2003), “Hiệu lực phòng trừ sâu xám (Agrotis ypsilon) hại thuốc lá của một số chế phẩm sinh học tuyến trùng (EPN)”, Tạp chí BVTV 4 (190), 26-29.
9 Lại Phú Hoàng, Phạm Hồng Thái, Nguyễn Ngọc Châu, Vũ Tứ Mỹ, Nguyễn Anh Diệp (2003), “Hiệu lực gây chết và khả năng sinh sản của tuyến trùng
54
Steinernema carpocapsae TL trên bọ hung hại mía (Alissonotum impresscolle)”, Tạp chí Khoa học 1, 100-104.
10 Phan Kế Long (2004), “Cây phát sinh chủng loại của một số chủng
Steinernema ở Việt Nam trên cơ sở giải mã vùng ITS-rDNA”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nhà xuất bản KHKT Hà Nội, tr. 156-159.
Tài liệu nƣớc ngoài
11 Akhust R.J. (1986), “Controlling insects in soil with Entomopathogenic Nematodes”, Fundamental and Applied Aspects of Invertebrate Pathology, Wageningen, The Netherlands, 265-267.
12 Anon (1988a), SAS Technical Report, Additional SAS/STAT Procedures. Release 6.03, SAS Institute, NC, USA, pp. 179.
13 Anon (1988b), SAS/STAT User Guide. Release 6.03, SAS Isntitute, Cary, NC, USA, pp. 1028.
14 Bedding R.A. (1984b), “Large scale production, storage and transport of insect parasitic nematodes Neoplectana spp. and Heterorhabditis spp”,
Annals of Applied Biology 104, 117-120.
15 Bedding R.A. (1990), “Logister and strategies for introduction entomopathogenic nematodes technology into Developing Countries”, In: Gaugler, R. & Kaya, H.K.(Eds.), Entomopathogenic Nematodes in Biological Control, CRC Press, Florida, 233-246.
16 Cabanias H.E. & Raulston J.R. (1994), “Pathogenicity of Steinernema riobranis against corn earworm, Helicoverpa zea (Boddie)”, Fund. Appl. Nematol., 17(3), 219-223.
17 Cutler C.G. and Stock S.P. (2003), “Steinernema websteri sp. n. (Rhabditida: Steinernematidae), a new entomopathogenic nematode from China”,
Nematol. medit, 31, pp. 215-224.
18 Deley P., Félix M.A., Frisse L.M., Nadler S.A., Sternberg P.W. & Thomas W.K. (1999), “Molecular and morphological characterisation of two
55
reproductively species with mirror-image anatomy (Nematoda: Cephalobidae)”, Nematology, 2, pp. 591-612.
19 Dutky S.R. & Hough W.S. (1955), “Note on parasitic nematode from codlinhmoth larvae Carpocapsae pomonelle (Lepidoptera: Olethrutidae)”,
Proceedings of the Entomological Society of Washington, 57, pp. 244.
20 Elawad S.A., Gowen S. L., Hague N.G.M. (1999), “The life cycle of S. abbasi and S. riobave in Galleria mellonella”, Nematology, 1(7-8), pp. 762- 764.
21 Friedman M.J. (1990),” Commercial production and development. In: Gaugler R. & Kaya H.K. (Eds.)”, Entomopathogenic Nematodes in Biological Control, CRC Press, Florida, 153-172.
22 Glaser R.W. (1932),” Studies on Neoaplectana glaseri, a nematodes parasite of the Japanese beetle (Popillia japonica Newn)”, New Jersey Department of Agriculture, Trenton, NJ. Circular, 211, pp. 34-42.
23 Hazir S., Stock S.P., Kaya H.K., Koppenhofer A.M. and Kenkin N. (2001), “Developmental temperature effects on five geographic isolates of the entomopathogenic nematodes Steinernema feltiae (Nematoda: Steinernematidae)”, Journal of Invertebrate Pathology, 77, pp. 243-250. 24 Holterman M., Wurff A.V.D., Elsen S., Megen H.,(2009) “Phylum-Wide
Analysis of SSU rDNA Reveals Deep Phylogenetic Relationships among Nematodes and Accelerated Evolution toward Crown Clades” Molecular Biology and Evolution , pp. 1792-1800.
25 Hunt D.J. (2007),” Overview of taxonomy and systematics”, In: Nguyen K.B. & Hunt D.J. (Eds). Entomopathogenic nematodes: systematics, phylogeny and bacterial symbionts. Nematology Monographs and Perspectives 5. Leiden, The Netherlands, Brill, pp. 27-57.
26 Hussaini S.S., Ansari M.A., Ahmad W. and Subbotin S.A. (2001),” Identification of some Indian populations of Steinernema species
56
(Nematoda) by RFLP analysis of the ITS region of rDNA”, International Journal of Nematology, 11(1), pp. 73-76.
27 Kaya H.K. and Gaukler R. (1993), “Entomopathogenic nematodes”, Annual Review of entomology, 38, pp. 181-206.
28 Nguyen K.B. & Smart J.C. (1994), “Neosteinernema longicurvicaudata n. gen. n. sp. (Rhabditida: Steinernematidae), a parasite of termite
Reticulitermis flavips (Koller)”, Journal of Nematology, 26, pp. 162-174. 29 Nguyen K.B., Shapiro-Ilan D.I., Stuart R.J., McCoy C.W., James R.J. and
Adams B.J. (2004a), “Heterorhabditis mexicana n. sp. (Rhabditida: Heterorhabditidae) from Tamaulipas, Mexico and morphological studies of the bursa of Heterorhabditis spp”, Nematology, 6(2), pp. 231-244.
30 Nguyen K.B., Tesfamariam M., Gozel U., Gaugler R. and Adams J.B. (2004b), “Steinernema yirgalemense n. sp. (Rhabditida: Steinernematidae) from Ethiopia”, Nematology,6(6), pp.839-856.
31 Nguyen K.B., Malan A.P., Gozel U. (2006), “Steinernema khoisanae n. sp.
(Rhabditida : Steinernematidae), a new entomopathogenic nematode from South Africa”, Nematology, 8(2), pp. 157-175.
32 Nguyen N. Chau, Phan K. Long (2009), “Some field trials of entomopathogenic nematodes in biological control of some insect pests in Viet Nam“, Development of IPM in Asia and Africa, Vol. 2, Sci. Publ. House, Hanoi, 217-223.
33 Phan K.L., Nguyen N.C. and Moens M. (2001a), “Steinernema loci n. sp. and Steinernema thanhi n. sp. (Rhabditida: Steinernematidae) from Vietnam“, Russ. J. Nematology, 9, pp. 1-7.
34 Poinar G.O.Jr. (1975), “Description and biology of a new insects, parasitic rhabditoids, Heterorhabditis bacretiophora n. gen., n. sp. (Rhabditida: Heterorhabditidae n, fam) “, Nematologica, 21, pp. 463-470.
57
35 Qiu L., Hu X., Zhou Y., Mei S., Nguyen K.B. and Y. Pang (2005), “Steinernema akhursti sp. n. (Nematoda: Steinernematidae) from Yunnan, China”, Journal of Invertebrate Pathology, 90, pp. 151-160.
36 Rodda M.S. Nguyen N. Chau (2009), “The potential of entomopathogenic nematode train S-TX1 for biocontrol of flea beetle (Phyllotreta striolata) on cabbage in Hai Phong“, Development of IPM in Asia and Africa, Vol. 2, Sci. Publ. House, Hanoi, 225-233.
37 Spiridonov S.E., Waeyenberge L., Moens M. (2010), “Steinernema schliemanni sp. n. (Steinernematidae; Rhabditida): a new species of steinernematids of the 'monticolum' group from Europe”, Russ. J. Nematol, 18 (2). pp. 175-190.
38 Steiner G. (1929),” Neoaplectana glaseri n. g., n. sp., (Oxyuridae) a new nemic parasite of Japanese beetle (Popillia japonica Newm)”, J. Wash. Acad. Science., 19, pp. 436-440.
39 Stock S.P. , V. Somsook & A Reid (1998), “Steinernemasiamkayai n. sp. (Rhabditida: Steinernematidae), an entomopathogenic nematode from Thailand”, Systematic Parasitology 41:105-113.
40 Vu Quang Con, Nguyen Ngoc Chau (2001), “ Development of biological control as key component for ecological sustainable agriculture in Vietnam”,
Proceedings of the 20th APEC Symposium on Advanced Technology for Sustainable Agriculture, 68-78.
41 Wang, J.X. & Bedding, R.A. (1996), “Population development of
Heterorhabditis bacteriophora and Steinernema carpocapsae in the larvae of
Galleria mellonella”, Fundamental and Applied Nematology, 19, pp. 363- 367.
WEB SITES
58
PHỤ LỤC
Phụ lục 1:Trình tự vùng 18S-rDNA của chủng tuyến trùng S-DL13
Kết quả đọc trình tự đoạn gen 18S-rDNA của loài Steinernema siamkayai từ Việt Nam trên máy tự động ABI 3100 Avant Genetic Analyzer
>AI_V2 CCGCCGTCGCTGCCCGGGACTGAGTTGTTTCGAGAAAAGCGGAGATTGC GATGTTGAATGTTTTCGGATGTTCTTTATTGCGAGAACCGCGTTAATCGAA TCGGCTTGAACCGGGCAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCT GCGGAAGGATCATTATTGAGCTAATTTCTTCCATTTTAATCAGGTCTTTGC TGTTCGTTTCTAAGCATTGACTTGTTCTGGCTTTGAATGGTTTCTAGAGAC GTTTGGAGCAGTCGTTTAAGCGTGACTGTGGTGATAAGCGTTTTACTTTG CTTAGCAGTTCGTTGTTTCTTGAATGCTTAGCGATGAGAATTAAAGAGGT CTGCTGACTCGCCATTTTTGATTGCTAACAAAAACGTTTTGTTTTGATATT TGTGTCACTCGTTGATGCATTATTCAATTATCAAGTCTTATCGGTGGATCAC TCGGTTCGTAGGTCGATGAAAAACGGGGCAAAAACCGTTATTTGGCGTG AATTGCAGACATATTGAGCGCTAAAATTTTGAACGCAAATGGCACTAACA GGGTTATCTGTTAGTATGTTCAATTGAGGGTCTTTTGACTAGAATCTGGCA ATCGGCTGTGATTGCTTTTTCGGAAAGCTACTTTGCTGTGCAGTGAAGTA CCTTTTTGGTATGGCTATTTGATTGTCTAATGGATGTCTGGTTCGCTGTTTC TTGACTAGACGTCTGCAATCATTTGGCTTTGCGTAGTGTTTGAATGATAGG TTAGCGCGTTTCTTGCTAACTGACTTTTGCACAAGCAAGTGTAATACGTTT CTTAAAGTCAGCTATTATTCAATTTGGTTTTCTGACTTGATTTGTCGGTTTA CTGTGCTATGCTCTGTCAATCTTTTCGAACTAGACCTCAATTTGAGCAAGA TTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAGTAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACT AGGATTTCCTTAGTACGGGCGAAGTG
59
Phụ lục 2 :Số liệu thống kê sinh học đánh giá độc lực và sinh sản của chủng tuyến trùng S-DL13 Tính chỉ số LC Probit Analysis Data Information N of Cases Valid 11 Rejected Missing 0 LOG Transform Cannot be Done 0 Number of Responses > Number of Subjects 0 Control Group 1 Convergence Information Number of Iterations Optimal Solution Found PROBI T 16 Yes Parameter Estimates
Parameter Estimate Std. Error Z Sig. 95% Confidence Interval
Lower Bound Upper Bound PROBIT a soluongIJsgaynhie m 2.670 .281 9.501 .000 2.119 3.221 Intercept -2.283 .333 -6.867 .000 -2.616 -1.951
60
a. PROBIT model: PROBIT(p) = Intercept + BX (Covariates X are transformed using the base 10.000 logarithm.) Chi-Square Tests Chi- Square dfb Sig. PROBI T Pearson Goodness-of- Fit Test 9.117 9 .427 a
a. Since the significance level is greater than .150, no heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits.
b. Statistics based on individual cases differ from statistics based on aggregated cases.
Cell Counts and Residuals
Number soluongIJs gaynhiem Number of Subjects Observed Responses Expected Responses Residual Probability PROBIT 1 .699 45 19 15.222 3.778 .338 2 1.000 45 27 29.270 -2.270 .650 3 1.301 45 35 39.736 -4.736 .883 4 1.477 45 43 42.821 .179 .952 5 1.602 45 45 43.961 1.039 .977 6 1.699 45 45 44.454 .546 .988 7 1.778 45 45 44.691 .309 .993 8 1.845 45 45 44.815 .185 .996 9 1.903 45 45 44.884 .116 .997 10 1.954 45 45 44.925 .075 .998 11 2.000 45 45 44.950 .050 .999
61
Confidence Limits
Probability 95% Confidence Limits for soluongIJsgaynhiem
95% Confidence Limits for
log(soluongIJsgaynhiem)a
Estimate Lower Bound Upper Bound Estimate Lower Bound Upper Bound
PROBIT .010 .964 .473 1.552 -.016 -.325 .191 .020 1.219 .635 1.890 .086 -.197 .277 .030 1.415 .765 2.143 .151 -.116 .331 .040 1.583 .880 2.355 .200 -.056 .372 .050 1.734 .986 2.544 .239 -.006 .406 .060 1.875 1.086 2.717 .273 .036 .434 .070 2.007 1.182 2.878 .302 .073 .459 .080 2.133 1.275 3.030 .329 .106 .481 .090 2.255 1.366 3.176 .353 .135 .502 .100 2.373 1.455 3.317 .375 .163 .521 .150 2.931 1.890 3.971 .467 .276 .599 .200 3.467 2.325 4.585 .540 .366 .661 .250 4.005 2.774 5.192 .603 .443 .715 .300 4.559 3.249 5.810 .659 .512 .764 .350 5.139 3.758 6.454 .711 .575 .810 .400 5.759 4.311 7.137 .760 .635 .854 .450 6.429 4.917 7.875 .808 .692 .896 .500 7.165 5.590 8.687 .855 .747 .939 .550 7.985 6.344 9.598 .902 .802 .982 .600 8.915 7.202 10.642 .950 .857 1.027 .650 9.990 8.191 11.868 1.000 .913 1.074 .700 11.263 9.351 13.356 1.052 .971 1.126 .750 12.819 10.745 15.232 1.108 1.031 1.183 .800 14.807 12.478 17.725 1.170 1.096 1.249 .850 17.516 14.754 21.293 1.243 1.169 1.328
62 .900 21.639 18.054 27.061 1.335 1.257 1.432 .910 22.772 18.932 28.710 1.357 1.277 1.458 .920 24.071 19.926 30.629 1.381 1.299 1.486 .930 25.585 21.069 32.904 1.408 1.324 1.517 .940 27.388 22.410 35.665 1.438 1.350 1.552 .950 29.601 24.028 39.123 1.471 1.381 1.592 .960 32.430 26.060 43.649 1.511 1.416 1.640 .970 36.280 28.769 49.983 1.560 1.459 1.699 .980 42.116 32.769 59.925 1.624 1.515 1.778 .990 53.279 40.141 79.937 1.727 1.604 1.903 a. Logarithm base = 10.
Sự tƣơng quan giữa sản lƣợng IJs và số lƣợng IJs gây nhiễm ban đầu của chủng S-DL13
63 ANOVA SanluongIJs Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups .131 9 .015 40.871 .000 Within Groups .007 20 .000 Total .138 29 Homogeneous Subsets SanluongIJs Duncan
soluongIJsgaynhiem N Subset for alpha = 0.05
1 2 3 4 5 10.00 3 1.8703 20.00 3 1.9263 30.00 3 1.9501 40.00 3 1.9965 100.00 3 2.0196 2.0196 50.00 3 2.0221 2.0221 90.00 3 2.0464 60.00 3 2.0468 80.00 3 2.0544 70.00 3 2.1037 Sig. 1.000 .137 .130 .054 1.000
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.