Dụng cụ: Đĩa petri, giấy lọc, cốc đong, kính lúp, kính hiển vi soi nổi OLYMPUS SZ10, kính hiển vi quang học OLYMPUS CH40 có gắn máy vẽ, kính hiển vi giao thoa OLYMPUS BX51 gắn máy ảnh, tủ định ôn, đĩa đếm tuyến trùng, cốc thủy tinh, pipetman, panh kẹp, kim gắp, lam kính, lamen, parafilm, bộ điện di DNA, cân phân tích 10-4g, máy ly tâm, máy khuấy trộn Vortex, máy soi chụp ảnh gel, máy ly tâm lạnh, máy xác định trình tự DNA tự động, tủ lạnh sâu -20o
C, - 80oC.
Hóa chất: Cồn tuyệt đối, glycerin, formandehyde, triethnolamine, dung dịch đệm điện di TBE, dung dịch Ethidium Bromide nồng độ 0,05 μg/ml (EtBr), đệm tra mẫu (Loading Dye), dung dịch WLB (Worm Lysis Buffer), nước cất, các hóa chất phân tử cho PCR và đọc trình tự vùng gien 18S-rDNA.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phƣơng pháp xác định đặc điểm hình thái tuyến trùng
Điều tra,thu mẫu, phân lập tuyến trùng: theo quy trình mô tả của Hominick et al. (1997) và Nguyễn Ngọc Châu (2008) [3].
Tiến hành gây nhiễm ấu trùng cảm nhiễm của chủng tuyến trùng phân lập được trên ấu trùngBSL:
Dùng pipet hút 1ml dung dịch có chứa 100 ấu trùng cảm nhiễm (IJs) cho vào đĩa petri có lót giấy lọc. Thêm vào mỗi đĩa petri một ấu trùng BSL. Sau khi gây nhiễm, đặt các đĩa petri vào tủ định ôn ở nhiệt độ 27 oC để theo dõi. Hàng ngày, bổ sung vào mỗi đĩa petri 1 - 2 giọt nước để duy trì độ ẩm và kiểm tra sâu chết. Sau khi sâu chết, tiến hành mổ sâu mỗi ngày để xác định các giai đoạn phát triển khác nhau của tuyến trùng.
Mẫu tuyến trùng thu được từ những lần mổ khám được làm sạch và xử lý để làm tiêu bản theo quy trình của Seinhorst (1959) :
24
dung dịch TAF (Formalin 40 %: 7ml, Triethanolamine: 2 ml, Nước cất: 91 ml) để cố định trong thời gian 7 ngày.
Bước 2: Gắp tuyến trùng từ dung dịch TAF sang đĩa thuỷ tinh lõm có chứa 0.5 ml dung dịch I (Cồn 96º: 20 ml, Glicerin: 1ml, Nước cất: 79 ml). Đặt đĩa thuỷ tinh trong bình hút ẩm của tủ ấm 40ºC trong thời gian tối thiểu là 12h.
Bước 3: Chuyển đĩa thuỷ tinh trong bình hút ẩm lên giá của tủ ấm trong khoảng 12h cho dung dịch bay hơi, cứ sau 3h thi bổ sung thêm dung dịch II (Cồn 96º: 95ml, Glicerin: 5ml). Sau khi cồn bay hơi hết chỉ còn glycerin thì có thể sử dụng tuyến trùng làm tiêu bản được.
Bước 4: Làm tiêu bản: Dùng ống đồng để khoanh các vòng parafin lên lam kính. Đặt 1 giọt nhỏ glicerin tinh khiết ở giữa vòng paraffin. Gắp tuyến trùng cho vào giọt glicerin. Đặt vài mảnh sợi thuỷ tinh để đỡ tuyến trùng, đậy lamen. Đặt lamkính lên thanh nhiệt và đốt đèn cồn ở bên dưới, sau vài phút parafin sẽ chảy đều và gắn lame vào lamkính.
Để định loại tuyến trùng tiến hành quan sát tuyến trùng, đo kích thước và vẽ tuyến trùng dưới kính hiển vi. Các chỉ số hình thái lượng sử dụng trong mô tả đặc điểm hình thái của EPN được tiến hành Hominick et al. (1997) và Nguyễn Ngọc Châu (2007) như sau:
n: Số lượng cá thể tuyến trùng được đo L: Chiều dài cơ thể
W: Chiều rộng cơ thể
EP: Chiều dài từ đỉnh đầu đến lỗ bài tiết NR: Chiều dài từ đỉnh đầu vòng thần kinh ES: Chiều dài từ đỉnh đầu cuối thực quản T : Chiều dài đuôi
ABW: Chiều rộng cơ thể tại hậu môn
H%: Chiều dài Hyalin / Chiều dài đuôi x 100 TES: Chiều dài nhánh sinh dục đực
25 Wst: Chiều rộng xoang miệng Lsp: Chiều dài gai giao cấu Wsp: Chiều rộng gai giao cấu Lgu: Chiều dài gai đệm Wgu: Chiều rộng gai đệm
V (%): Chiều dài từ đỉnh đầu đến Vuval / Chiều dài cơ thể x 100
a: L / W
b: L / ES
c: L / T
D (%:) EP / ES x 100 E (%): EP / T x100
2.4.2. Phƣơng pháp phân loại tuyến trùng dựa trên trình tự 18S – rDNA
Tách DNA tổng số
ADN tổng số của EPN được tách chiết theo Joyce et al (1994) và Reid et al. (1997) với các bước:
- Gắp một cá thể trưởng thành vào 1 ống effendorf có chứa 8μl dung dịch đệm WLB và 10μl nước cất 2 lần.
- Nghiền mẫu tuyến trùng bằng máy nghiền rung (Vibro Mixer) trong 2-3 phút.
- Thêm 2μl proteinase K.
- Chuyển sang tủ lạnh sâu -200C trong ít nhất 60 phút. - Chuyển sang ủ ở nhiệt độ 650C trong 60 phút.
- Chuyển sang tủ lạnh sâu -200C trong ít nhất 60 phút. - Chuyển sang ủ ở nhiệt độ 650C trong 60 phút.
- Để ở nhiệt độ 960C trong 10 phút.
- Ly tâm 1000 vòng/ phút trong 1 phút thu dịch trong - Bảo quản ADN thu được ở tủ -200C.
Nhân đoạn DNA đích bằng kỹ thuật PCR
Đoạn ADN đích sẽ được nhân bản (PCR) nhờ các mồi đặc hiệu. Trong đó cặp mồi để nhân bản đoạn ADN đặc hiệu được sử dụng theo nguồn
26 tham khảo sau:
Bảng 2.1. Các mồi đặc hiệu cho PCR
Tên mồi Trình tự mồi ( 5‟- 3‟) Kích thước (bp) Nguồn tham khảo D2D3
primer
5‟-ACA AGTACC GTG AGG GAA AGT TG-3‟
3‟-TCC TCG GAA GGA ACC AGC TAC TA-5‟
600 bp De Ley et al., 1999
Vùng 18S
5' - GCT TGT CTC AAA GAT TAA GCC - 3'
5' - TGA TCC C GC AGG TTC AC -3'
1000 bp Holterman et al. (2009) Căn cứ thông số kỹ thuật của mồi do nhà sản xuất cung cấp, chúng tôi đã thiết lập được chu trình nhiệt cho phản ứng như sau :
Bảng 2.2: Thành phần hỗn hợp cho PCR TT Thành phần Nồng độ Lượng (µl) 1 Taq PCR Mastermix 2X 12,5 2 Mồi xuôi 20 mM 1 3 Mồi ngược 20 mM 1 4 DNA tổng số 10 ng/μl 2,5 5 Nước cất khử ion - 8 Tổng 25
Bảng 2.3: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR
Các giai đoạn PCR Nhiệt độ (oC) Thời gian (giây) Số chu kì
Biến tính ban đầu 95 115 1
Biến tính 96 35
35
Bắt cặp 50 30
Kéo dài 72 45
27
Giữ mẫu 4 Đến khi lấy mẫu
Điện di DNA trên gel agarose
- Chuẩn bị gel agarose 1 %: cân 0,4 g bột agarose hoà trong 40 ml dung dịch TBE 1X, đun cho bột agarose tan hết. Khi gel hạ nhiệt độ xuống khoảng 50 ºC, đổ vào khuôn đã đặt sẵn lược điện di có độ dày răng lược thích hợp. Để gel đông và ổn định hoàn toàn trong khoảng 1 giờ.
- Đặt gel vào bể điện di, đổ dung dịch TBE 1X ngập mặt gel và nhẹ nhàng rút răng lược ra.
- Tra mẫu: mẫu DNA được trộn với dung dịch loading dye theo tỷ lệ 5:1 và tra mỗi mẫu vào một giếng điện di theo thứ tự mẫu.
- Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với hiệu điện thế 100 V. Các phân tử DNA sẽ chạy từ cực âm sang cực dương.
- Gel sau khi chạy điện di được lấy ra và ngâm vào dung dịch Ethidium Bromide nồng độ 0,05 μg/ml trong khoảng 15 phút để nhuộm DNA. Băng DNA trong gel có thể nhìn thấy trên máy soi gel bằng tia tử ngoại có bước sóng 302 nm.
Tinh sạch sản phẩm PCR
Sử dụng bộ kit MinElute của hãng QIAgen để tinh sạch sản phẩm PCR. Các bước tinh sạch sản phẩm PCR theo hướng dẫn của nhà sản xuất kít và tóm tắt như sau:
Bước 1: Chạy điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1 %.
Bước 2: Cắt đoạn gel chứa băng DNA đặc hiệu của từng mẫu bằng dao nhỏ, sắc, sạch. Cho băng DNA đã cắt vào ống eppendorf 1,5 ml.
Bước 3: Cân đoạn gel từng mẫu đã cắt. Thêm 3 lần thể tích dung dịch QG theo trọng lượng từng mẫu (1g gel tương đương 1000 µl dung dịch QG).
Bước 4: Ủ ở 50 ºC trong 10 phút cho tới khi gel tan hoàn toàn. Để làm tan gel tốt, lắc đều các ống eppendorf vài lần trong quá trình ủ, mỗi lần cách nhau 2 - 3 phút.
Bước 5: Khi gel đã tan hoàn toàn, kiểm tra màu của dung dịch mẫu. Màu của dung dịch tốt là màu vàng của QG ban đầu.
28
Bước 6: Hút toàn bộ dung dịch cho vào cột MinElute (gọi tắt là cột) đặt trong ống thu dịch ly tâm (collection tube) của Kit và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 7: Chuyển cột sang ống thu dịch ly tâm khác, cho 700l dung dịch PE vào cột, để mẫu ở nhiệt độ phòng khoảng 5 phút, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 8: Chuyển cột sang ống thu dịch ly tâm khác và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 9: Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml đã ghi kí hiệu mẫu, cho 10l EB vào cột và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 10: Bỏ cột, bảo quản sản phẩm PCR trong ống eppendorf ở - 20 oC.
Xác định trình tự gen bằng máy tự động
Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng xác đinh trình tự DNA với thành phần như sau: Bảng 2.4: Thành phần hỗn hợp phản ứng xác định trình tự DNA TT Thành phần Nồng độ Số lượng (µl) 1 Sản phẩm PCR 20 ng/μl 1 2 Mồi giải trình tự 1 mM 3 3 Dung dịch BigDye 2,5X 4 4 Nước cất khử ion - 2 Tổng 10
Tổng thể tích là 10 µl, bao gồm các thành phần: nước khử ion 2 l, primer (xuôi hoặc ngược) 1 l, dung dịch BigDye 2,5X 4 l, DNA đích 1 l.
Phản ứng xác định trình tự về cơ bản có các thành phần tham gia giống như phản ứng PCR, nhưng có khác biệt là: trong phản ứng xác định trình tự, ta có thể sử dụng 2 mồi là mồi xuôi và mồi ngược nhưng chỉ có một mồi tham gia phản ứng.
29
Bảng 2.5: Chu trình nhiệt của phản ứng xác định trình tự DNA Các giai đoạn Nhiệt độ (ºC) Thời gian (giây) Số chu kì
Biến tính ban đầu 96 60 1
Biến tính 96 10
25
Gắn mồi 50 5
Kéo dài 60 240
Giữ mẫu 4 Đến khi lấy mẫu 1
Tinh sạch sản phẩm để xác định trình tự
Sản phẩm của phản ứng xác định trình tự được tinh sạch bằng phương pháp cột sephadex theo hướng dẫn của nhà sản xuất theo qui trình sau:
Bước 1: Cho cột sephadex vào ống thu dịch ly tâm 2 ml và ly tâm 3.000 vòng/phút trong 2 phút.
Bước 2: Chuyển cột sephadex sang ống eppendorf 1,5 ml.
Bước 3: Chuyển toàn bộ dung dịch của phản ứng giải trình tự của mỗi mẫu vào một cột sephadex và ly tâm 3.000 vòng/phút trong 2 phút.
Bước 4: Bỏ cột sephadex. Sấy khô dung dịch của phản ứng giải trình tự trong ống eppendorf bằng máy ly tâm chân không tại 1.500 vòng/phút trong 10 phút ở 45
o
C.
Sản phẩm sau tinh sạch được đọc kết quả trên máy phân tích trình tự tự động ABI 3100 Avant Genetic Analyzer.
2.4.3. Phƣơng pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của EPN
Sinh trưởng và phát triển của tuyến trong trùng trong vật chủ ấu trùng BSL: được tiến hành dựa trên phương pháp đã được mô tả bởi Cabanillas & Rraulston (1994) và Elawad et al. (1999)]. Một ấu trùng BSL, cùng với 60 ấu trùng cảm nhiễm của mỗi chủng tuyến trùng được cho vào từng đĩa petri (3.5 cm x 1.5 cm) có lót giấy lọc ẩm. Giữ ẩm cho các đĩa petri và đặt chúng trong tủ định ôn ở nhiệt độ 27oC. Sau khoảng thời gian 12h từ 1 – 10 ngày tùy từng chủng tuyến trùng, ấu trùng BSL chết sẽ được lấy ra để mổ và kiểm tra trực tiếp dưới kính hiển vi soi nổi. Các giai đoạn phát triển của tuyến trùng được xác định dựa vào các đặc điểm đã được
30
môt tả. Thí nghiệm tiến hành cho đến khi ấu trùng cảm nhiễm mới xuất hiện trên bề mặt ấu trùngBSL chết.
Sinh sản của tuyến trùng: dựa trên phương pháp đã được mô tả bởi Cabanillas & Rraulston (1994) và Elawad et al. (1999) :Thí nghiệm tiến hành trên 10 công thức ở 10 nồng độ ấu trùng cảm nhiễm khác nhau theo mật độ từ 10 đến 100 IJs/ ấu trùng BSL. Mỗi công thức gây nhiễm trên 15 ấu trùngBSL. Thí nghiệm được nhắc lại 3 lần. Sau khi gây nhiễm đặt các đĩa petri vào tủ định ôn ở nhiệt độ 27 oC. Theo dõi số ấu trùng BSL chết sau 48h. Mỗi ấu trùng BSL chết được đặt vào White trap trong thời gian từ 2 - 10 ngày tùy từng chủng. Ấu trùng cảm nhiễm mới xuất hiện được thu mỗi ngày cho đến khi số lượng giảm đến hết. Ấu trùng cảm nhiễm được rửa sạch và đếm số lượng trực tiếp dưới kính hiển vi soi nổi [6].
2.4.4. Phƣơng pháp xác định độc lực của EPN
Thí nghiệm xác định độc lực của một chủng tuyến trùng được tiến hành dựa trên nghiên cứu của Cabanillas & Rraulston (1994) với 12 công thức ấu trùng cảm nhiễm khác nhau: 0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60,70, 80, 90, 100 IJs. Mỗi công thức gồm 15 ấu trùngBSL, thí nghiệm nhắc lại 3 lần.
Thí nghiệm được theo dõi trong 48h ở nhiệt độ 27 oC. Sau đó, thống kê số lượng sâu chết do tuyến trùng. Các sâu bị chết do tuyến trùng chỉ được xác nhận khi có đầy đủ các yếu tố sau: Có tuyến trùng trong sâu, sâu chết do tổ hợp tuyến trùng/vi khuẩn phải có màu vàng nhạt, gạch, nâu hoặc đen, không có mùi thối do vi sinh vật khác phân giải, số lượng tuyến trùng tăng do IJs đã được sinh sản trong ấu trùng.
Sau khi ấu trùng BSL chết tiến hành làm Whitetrap khoảng 7 - 10 ngày tùy từng chủng để thu ấu trùng cảm nhiễm.
2.4.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu
- Giá trị sản lượng trung bình ấu trùng cảm nhiễm thu được trên mối ấu trùng BSL được xử lý theo thống kê Anon (1988b) [13].
- Trên cơ sở số liệu ấu trùng BSL chết ở các nồng độ ấu trùng cảm nhiễm gây nhiễm ban đầu khác nhau có thể tính được chỉ số LC50 theo quy trình xử lý PROBIT
31 (Anon, 1988a) trong phần mềm SPSS 11.0 [12].
- Các số liệu kết quả thu được của các thí nghiệm đều được xử lý thống kê theo ANOVA trong chương trình thống kê SPSS 20.0. Số lượng tuyến trùng thu được đều được chuyển sang log(x+1) trước khi cho vào xử lý.
- Sử dụng chương trình BLAST để tìm kiếm các trình tự tương đồng đã được các tác giả khác công bố trên ngân hàng ADN (GenBank).
- So sánh sự khác nhau về vị trí nucleotit giữa các cặp loài dùng phần mềm ClustalW.103 . Phần mềm MEGA 4.0 được dùng để phân tích khoảng cách di truyền và xây dựng cây phát sinh chủng loại theo phương pháp Minimum Evolution (ME) .
32
Chƣơng 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Sau quá trình khảo sát, thu mẫu và phân lập các chủng EPN từ các tỉnh Tây Nguyên, chúng tôi đã thu được 3 mẫu tuyến trùng thuộc giống Steinernema từ 314 mẫu đất. Như vậy, tỷ lệ hiện diện của tuyến trùng trong mẫu đất cà phê Tây Nguyên chỉ là 0,95 %. Sau khi phân lập và phân tích đặc điểm hình thái, hình thái lượng (morphometrics) và đặc trưng sinh học phân tử có thể kết luận 3 mẫu tuyến trùng thu được là cùng một loài Steinernema siamkayai Stock, Somsook & Reid, 1998. Đây là loài tuyến trùng đã được mô tả từ Thái Lan và lần đầu được ghi nhận ở Việt Nam nên đây là ghi nhận mới cho Việt Nam.
Ngoài các đặc điểm hình thái và số đo phù hợp với hình thái và số đo mô tả gốc của S. siamkayai, chủng này ở Việt Nam cũng có các đặc điểm riêng, đặc biệt một số sai khác về hệ số đo, đặc thù cho tính bản địa của chúng. Ký hiệu chủng tuyến trùng thu được là S-DL13.Những đặc điểm đó thể hiện sự đa dạng của loài sẽ được trình bày dưới đây.
3.1. Đặc điểm hình thái
Con đực : Kích thước cơ thể nhỏ hơn con cái. Cơ thể cong về phía bụng khi xử lý nhiệt. Thế hệ 1(trung bình 1312 µm) lớn hơn thế hệ 2 (trung bình 973 µm). Vỏ cutin mịn khi quan sát dưới kính hiển vi quang học, vùng bên và phasmid không rõ. Đầu tròn và ngắn, liên tục với cơ thể. Đỉnh đầu có 6 nhú môi ở vòng trong và 4 nhú đầu ở vòng ngoài nhô lên. Hai cơ quan thụ cảm hóa học (amphids) nhỏ, nằm phía sau bên nhú môi. Xoang miệng nông, ngắn và rộng. Thực quản cơ, phần trước thực quản hình ống, phần giữa hơi phình rộng, phần sau thực quản dạng qủa lê và