2. Nguyễn Thị Lệ Thu 1106
2.2 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC
2.2.1 Nghiên cứu trong nƣớc
- Năm 2006, Lê Xuân Thám và cộng sự đã phát hiện và định danh loài Linh Chi Đen Amauroderma Subresinosum đầu tiên của Việt Nam ở Vƣờn Quốc gia Cát Tiên.
- Năm 2010, Đặng Ngọc Quang và cộng sự đã nghiên cứu hoạt chất kháng tế bào ung thƣ từ ba loài nấm Linh Chi Đen (Amauroderma Subresinosum), Linh Chi Đỏ (Ganoderma lucidum) và Linh Chi Vàng (Tomophagus cattienensis) từ vƣờn quốc gia Cát Tiên, Lâm Đồng. Kết quả tác giả đã tinh sạch đƣợc 12 hợp chất từ 5 loài nấm Linh Chi trong đó nấm Linh Chi Đen A. subresinosum tách đƣợc hợp chất ergosterol peroxide có khả năng kháng 4 dòng tế bào ung thƣ biểu mô, gan, phổi và vú.
- Năm 2011, Đặng Ngọc Quang và các cộng sự tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học của nấm Linh Chi Đen Việt Nam Amauroderma Subresinosum Murr. Kết quả xác
định đƣợc 14 loại acid béo thiết yếu từ nấm Linh Chi Đen Amauroderma Subresinosum - Năm 2013, Nguyễn Thị Thu Hƣơng và cộng sự nghiên cứu hoạt động chống oxy hóa của các Polysaccharides thô chiết xuất từ nấm Linh Chi Đen Ganoderma subresinosum.
2.2.2 Nghiên cứu ngoài nƣớc
- Năm 2014, Huey Jen Lin và cộng sự, nghiên cứu một loại protein điều hòa miễn dịch (Linh Chi-8) từ nấm Linh Chi Ganoderma lucidum có khả năng chữa lành nhanh vết thƣơng sau khi phẫu thuật điện ở mô gan chuột.
- Năm 2015, Hsu HA và cộng sự nghiên cứu sự khác nhau giữa Protein-2 tái tổ hợp từ xƣơng ngƣời và Ling zhi-8 có nguồn gốc từ Linh Chi trong việc tái tạo xƣơng ở thỏ.
CHƢƠNG 3: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 3.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 3.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu sử dụng trong đề tài là nấm Linh Chi Đen (Amauroderma
Subresinosum), thu thập từ trại nấm Bảy Yết, ấp Tân Lập, xã Tân Thới Nhì, Huyện Hóc
Môn, thành phố Hồ Chí Minh. Nấm đƣợc giữ giống trên gỗ khúc, trên mặt mũ nấm có vân gợn đồng tâm và những rãnh nhỏ lồi lõm nhấp nhô không đồng nhất. Mũ nấm rộng khoảng 6 cm, dày 1.5cm.
Hình 3.1 Quả thể nấm Linh Chi Đen sử dụng để phân lập
3.1.2 Hóa chất - dụng cụ - trang thiết bị
Trong quá trình thực hiện đề tài, nhóm nghiên cứu có sử dụng một số dụng cụ cũng nhƣ các trang thiết bị tại phòng thí nghiệm.
Bảng 3.1: Dụng cụ phục vụ trong quá trình nghiên cứu Tên dụng cụ Số lƣợng Tên dụng cụ Số lƣợng
Tủ cấy vô trùng 1 Bếp gas 1
Tủ sấy 1 Bếp diện 1
Nồi hấp 1 Đĩa thủy tinh 1
Cân phân tích 1 Phễu lọc 1
Máy đo pH 1 Nồi nấu 1
Kính hiển vi 1 Đĩa petri 1
Máy chụp ảnh kỹ thuật
số 1 Giá mút và nắp đậy 1
Erlen 250 ml 1 Cán dao 1
Becker 250 ml và
1000ml 1 Bông không thấm 1
Chai thủy tinh 300 ml 1 Bông thấm 1 Ống đong 1000 ml, 1 Dây thun 400 gram Bình định mức 100 ml 1 Cổ nút 150 cái Nilong loại PP với kích
Hóa chất
- Đƣờng Saccarose
- Kalidyhydro phosphate (KH2PO4). - Magie sunphate (MgSO4.7H2O). - Amoni sunphate ((NH4)2SO4).
- Pepton, Cao Nấm Men (yeast extract). - Sắt sunphate (FeSO4.7H2O).
- Clorua kali (KCl). - Natri nitrat (NaNO3). - Cám gạo, cám ngô. - CaCO3.
- NPK 16-16-8. - Cồn 960. - Agar
3.1.3 Các môi trƣờng sử dụng trong thí nghiệm 3.1.3.1 Môi trƣờng phân lập 3.1.3.1 Môi trƣờng phân lập
Nhóm đề tài sử dụng môi trƣờng phân lập PSA (phụ lục A).
3.1.3.2 Môi trƣờng hạt
Môi trƣờng hạt sử dụng khảo sát trong đề tài là môi trƣờng sử dụng lúa gạo có bổ sung các chất khác nhau theo từng nghiệm thức thí nghiệm.
3.1.3.3 Môi trƣờng giá môi
Môi trƣờng giá môi sử dụng trong đề tài là mạc cƣa cao su và lõi bắp đƣợc phối trộn các thành phần dinh dƣỡng khác nhau theo từng nghiệm thức thí nghiệm.
3.1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 9/2014 đến 02/2015 tại phòng thí nghiệm Viện Công nghệ sinh học và thực phẩm, Trƣờng Đại học Công Nghiệp TPHCM số 12 Nguyễn Văn Bảo, P.4, Q. Gò Vấp, TP.HCM và trại thực nghiệm Trƣờng Trung Cấp Kỹ Thuật Nông Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh tại 52 đƣờng 400, P.Tân Phú, Q.9, Tp.HCM.
3.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 3.2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
3.2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hƣởng của thành phần dinh dƣỡng đến sinh trƣởng và phát triển của hệ sợi nấm Linh Chi Đen trên môi trƣờng thạch
Mục đích thí nghiệm
Xác định thành phần môi trƣờng thạch thích hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển của hệ sợi nấm Linh Chi Đen.
Cách tiến hành
Hệ sợi nấm Linh Chi Đen sau quá trình phân lập đƣợc cấy sang môi trƣờng thạch. Môi trƣờng thạch xây dựng trên nền tảng môi trƣờng PSA bổ sung thêm các nguồn dinh dƣỡng khác nhau nhƣ bảng 3.2. Môi trƣờng sau khi pha chế đƣợc hấp khử trùng ở 1210
C trong vòng 25 phút. Môi trƣờng tiếp tục đƣợc chuyển sang đĩa petri vô trùng, để nguội, cấy giống và ủ ở điều kiện phòng thí nghiệm.
Bảng 3.2 Khảo sát sự ảnh hƣởng của thành phần dinh dƣỡng đến sinh trƣởng và phát triển của hệ sợi nấm
Linh Chi Đen trên môi trƣờng thạch
Nghiệm thức Thành phần
NT 1 PSA
NT 2 PSA + 10% nƣớc chiết giá NT 3 PSA + 10% nƣớc dừa
NT 4 PSA + Na2HPO4 2g + Mg.SO4.7H2O 0.5g + Pepton 2g NT 5 PSA + 10% nƣớc chiết cà rốt
Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức trong đó có 1 nghiệm thức đối chứng, mỗi nghiệm thức 10 ống nghiệm với 3 lần lặp lại.
Chỉ tiêu theo dõi
Chiều dài tơ lan của nấm (cm) định kỳ hai ngày một lần. Màu sắc và độ dày của tơ.
3.2.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hƣởng của thành phần dinh dƣỡng đến sinh trƣởng và phát triển của hệ sợi nấm Linh Chi Đen trên môi trƣờng hạt
Mục đích thí nghiệm
Xác định thành phần môi trƣờng môi trƣờng thích hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển của hệ sợi nấm Linh Chi Đen.
Cách tiến hành
Phối trộn môi trƣờng theo các nghiệm thức thí nghiệm (bảng 3.3) sao đó điều chỉnh độ ẩm đạt khoảng 60%, cho môi trƣờng vào khoảng 2/3 chiều dài ống nghiệm đƣờng kính 1.5cm, dài 18cm, hấp khử trùng 121oC trong 60 phút, để nguội và cấy giống. Tiến hành theo dõi và đo độ lan sâu của sợi nấm theo định kỳ 3 ngày một lần.
Bảng 3.3 Khảo sát sự ảnh hƣởng của thành phần dinh dƣỡng đến sinh trƣởng và phát triển của hệ sợi nấm Linh Chi Đen trên môi trƣờng hạt
Nghiệm thức Thành phần
NT 1 Lúa 100%
NT 2 Lúa 95% Cám ngô 5%
NT 3 Lúa 98% Cám ngô 2%
Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức trong đó có 1 nghiệm thức đối chứng, mỗi nghiệm thức 10 ống nghiệm với 3 lần lặp lại.
Chỉ tiêu theo dõi
Chiều dài tơ lan của nấm (cm). Màu sắc và độ dày sợi tơ.
3.2.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng giá môi đến sự sinh trƣởng và phát triển của nấm Linh Chi Đen
Mục đích thí nghiệm
Xác định đƣợc môi trƣờng tối ƣu trong quá trình sinh trƣởng và phát triễn của quả thể nấm Linh Chi Đen.
Cách tiến hành
Mạc cƣa cao su đƣợc ủ với vôi 1% trong 3 ngày, cùi bắp đƣợc đập vụn thành hạt có kích thƣớc khoảng 1cm3, ngâm nƣớc vôi 1% trong 8 giờ sau đó vớt ra và ủ trong 7 ngày. Sau đó phối trộn theo từng nghiệm thức nhƣ bảng 3.4 cùng với các thành phần (cám gạo 5%, cám ngô 5%, NPK (16 - 16 – 8) 0.5%, vôi 1%), điều chỉnh độ ẩm đến 65% và đóng vào các bịch PE, hấp thanh trùng bằng hơi nƣớc nóng 1000 C trong 12 giờ.
Bảng 3.4: Khảo sát sự ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣỡng đến sự sinh trƣởng và phát triển của nấm Linh Chi Đen trên môi trƣờng giá môi
Nghiệm thức Lõi bắp đập vụn Mùn cƣa
NT 1 0 % 100%
NT 2 25 % 75 %
NT 3 50% 50 %
NT 4 75 % 25 %
NT 5 100 % 0 %
Tốc độ lan tơ của hệ sợi tơ nấm trên cơ chất trồng nấm (cm) Màu sắc và độ dày của hệ sợi nấm.
3.2.3 Phƣơng pháp phân tích kết quả thí nghiệm
Tất cả thí nghiệm đƣợc thực hiện 03 lần lặp lại và đƣợc xử lý bằng phần mềm IBM SPSS statistics 2.0.
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
4.1 Sự ảnh hƣởng của thành phần dinh dƣỡng đến sinh trƣởng và phát triển của hệ sợi nấm Linh Chi Đen trên môi trƣờng thạch của hệ sợi nấm Linh Chi Đen trên môi trƣờng thạch
Trên môi trƣờng thạch, hệ sợi nấm Linh Chi Đen phát triển dƣới dạng hình rễ khá sớm với tốc độ nhanh dần. Trong quá trình theo dõi sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm Linh Chi Đen, chúng tôi nhận thấy trong 2 ngày đầu hệ sợi tăng trƣởng chậm, nhƣng sau đó hệ sợi tăng trƣởng nhanh dần. Trên các môi trƣờng dinh dƣỡng khác nhau, tốc độ tăng trƣởng của sợi nấm Linh Chi Đen khác nhau, kết quả đƣợc thể hiện qua bảng 4.1.
Bảng 4.1 Chiều dài trung bình tơ lan trên các môi trƣờng thạch thí nghiệm
Nghiệm thức
Chiều dài tơ lan (cm)
2 ngày 4 ngày 5 ngày
NT 1 0.307 e 1.453 e 2.29 e
NT 2 0.45 c 2.062 c 3.05 c
NT 3 0.44 d 1.989 d 2.78 d
NT 4 0.59 a 2.542 a 3.5 a
NT 5 0.4 b 1.822 b 2.643 b
Ghi chú: các ký tự a,b,c,… trong bảng thể hiện sự khác biệt rất có ý nghĩa với độ tin cậy 95%.
NT 1: PSA
NT2: PSA + 10% nước chiết giá
NT 4: PSA + Na2HPO4 2g + Mg.SO4.7H2O 0.5g + Pepton 2g NT 5: PSA + 10% nước chiết cà rốt.
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
2 ngày 4 ngày 5 ngày
cm
Thời gian
NT 1 NT 2 NT 3 NT 4 NT 5
Đồ thị 4.1 Chiều dài trung bình tơ lan của tơ nấm Linh Chi Đen
C h iề u dài tơ lan
Hình 4.1 Tơ nấm Linh Chi Đen lan trên các môi trƣờng thạch
Kết quả thí nghiệm ở bảng 4.1 và đồ thị 4.1 cho thấy sự sinh trƣởng và phát triển của hệ sợi nấm khác nhau ở từng nghiệm thức. Trong đó, NT4 (PSA + Na2HPO4 2g + Mg.SO4.7H2O 0.5g + Pepton 2g) có hệ sợi nấm sinh trƣởng và phát triển nhanh nhất (hình 4.1), tơ nấm trung bình đạt đƣợc sau 5 ngày là 3.5cm, tơ nấm dày, có màu trắng, dày. Ở NT1 (PSA) hệ sợi tơ nấm sinh trƣởng và phát triển chậm nhất, chỉ lan đƣợc 2.29cm.
Nguyên nhân của vấn đề này là do NT4 trong thành phần môi trƣờng có bổ sung thêm các chất Na2HPO4 2g + Mg.SO4.7H2O 0.5g. Những ion khoáng này đƣợc hệ sợi tơ nấm hấp thu, kích thích tế bào sinh tổng hợp các enzyme và các chất cần thiết, các hợp chất hữu cơ quan trọng cho sự sinh trƣởng và phát triển của hệ sợi nấm. Ngoài ra, tốc độ lan tơ ở NT2 (PSA + 10% nƣớc dừa), NT3 (PSA + 10% nƣớc chiết giá), NT5 (PSA + 10% nƣớc chiết cà rốt) chậm hơn NT4 vì hệ sợi nấm Linh Chi Đen hấp thu nhiều ion khoáng hơn các thành phần khác. Tuy nhiên, tốc độ lan tơ ở những nghiệm thức trên nhanh hơn NT1 vì ở NT2 có bổ sung nƣớc dừa, NT3 bổ sung thêm nƣớc chiết giá, NT5
bổ sung thêm nƣớc chiết cà rốt, nhờ đó, cung cấp thêm nhiều acid amin hay các vitamine, các chất khoáng khác giúp sợi nấm phát triển tốt hơn.
Nhƣ vậy, môi trƣờng có công thức: PSA + Na2HPO4 2g + MgSO4.7H2O 0.5g + Pepton 2g là môi trƣờng thạch thích hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển của hệ sợi tơ nấm Linh Chi Đen.
4.2 Sự ảnh hƣởng của thành phần dinh dƣỡng đến sinh trƣởng và phát triển của hệ sợi nấm Linh Chi Đen trên môi trƣờng hạt của hệ sợi nấm Linh Chi Đen trên môi trƣờng hạt
Trên môi trƣờng nhân giống cấp 2, sau khi cấy giống, hệ sợi nấm Linh Chi Đen lan sâu vào khối cơ chất trong ống nghiệm với tốc độ tƣơng đối chậm nhƣng đồng đều mọi phía. Ban đầu hệ sợi mảnh, thƣa, màu trắng, sau đó hệ sợi lan đều, mật độ tăng dần theo thời gian, hệ sợi bện kết dày hơn. Sau 11 ngày hệ sợi lan hết khối cơ chất trong ống nghiệm. Chiều dài tơ lan của hệ sợi đo đƣợc trong các ống nghiệm chứa khối cơ chất có sự khác nhau và đƣợc thể hiện cụ thể trong bảng 4.2.
Bảng 4.2 Chiều dài lan sâu của hệ sợi nấm Amauroderma Subresinosum
trên môi trƣờng hạt thí nghiệm Nghiệm
thức
Chiều dài tơ lan (cm)
Ngày 5 Ngày 7 Ngày 9 Ngày 11
NT1 2.4 e 4.08 e 6.7 e 9.65e
NT2 2.6 c 4.5 c 7.43 c 10.84c
NT3 2.5 d 4.25 d 6.96 d 10.05 d
NT4 2.8 a 5.1 a 8.6 a 12.7 a
NT5 2.6 b 4.74 b 8.01 b 11.81 b
Ghi chú:các ký tự a,b,c,… trong bảng thể hiện sự khác biệt rất có ý nghĩa với độ tin cậy 95%.
NT2: lúa 95% + cám ngô 5% NT3: lúa 98% + cám ngô 2% NT4: lúa 95% + cám gạo 5% NT5: lúa 98% + cám gạo 2% 0 2 4 6 8 10 12 14
Ngày 5 Ngày 7 Ngày 9 Ngày 11
cm
Thời gian
NT1 NT2 NT3 NT4 NT5
Đồ thị 4.2 Tốc độ lan tơ của tơ nấm Linh Chi Đen trên môi trƣờng hạt
Kết quả thí nghiệm ở bảng 4.2 và đồ thị 4.2 cho thấy tốc độ lan tơ hệ sợi nấm ở các nghiệm thức khác nhau. Tốc độ lan tơ ở NT4 (lúa 95% + cám gạo 5%) nhanh nhất, chiều dài đạt đƣợc là 12.7 cm sau 11 ngày. Ngƣợc lại, NT1 (lúa 100%) có tốc độ lan chậm nhất, chiều dài lan tơ trung bình chỉ đạt 9.65 cm. Vì trong môi trƣờng NT4 có bổ sung thêm 5% cám gạo, cung cấp thêm vitamin và các nguồn dƣỡng chất thiết yếu giúp tơ nấm phát triển hơn.
Bên cạnh đó, ở NT5 (lúa 98% + cám gạo 2%), NT2 (lúa 95% + cám ngô 5%) và NT3 (lúa 98% + cám ngô 2%) có bổ sung thêm cám gạo, cám ngô nhƣng với nồng độ chƣa thích hợp bằng NT4 nên có tốc độ lan tơ vẫn nhanh hơn NT1 nhƣng chậm hơn NT4
C h iề u dài tơ lan
(bảng 4.2 và hình 4.2).
Hình 4.2 Tơ nấm Linh Chi Đen trên các môi trƣờng hạt
Nhƣ vậy nguồn dinh dƣỡng bổ sung từ bên ngoài rất quan trọng cho sự sinh trƣởng và phát triển của tơ nấm Linh Chi Đen. Trong đó, môi trƣờng meo hạt với các thành phần 95% lúa + 5% cám gạo là thích hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển của nấm Linh Chi Đen.
4.3 Kết quả thí nghiệm khảo sát sự ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣỡng đến sự sinh trƣởng và phát triển của nấm Linh Chi Đen trên môi trƣờng giá môi sinh trƣởng và phát triển của nấm Linh Chi Đen trên môi trƣờng giá môi
Đối với nấm Linh Chi Đen, thời gian nuôi tơ kéo dài khoảng 28 ngày. Trên môi trƣờng cơ chất, hệ sợi nấm Linh Chi lan sâu trong khối cơ chất trong túi với tốc độ tƣơng đối chậm ở giai đoạn đầu nhƣng có chiều hƣớng nhanh hơn và lan đều về mọi phía ở giai đoạn sau. Hệ sợi nấm lúc ban đầu có màu trắng hơi nhạt về sau phát triển trắng đậm dày hơn. Mật độ hệ sợi tăng dần tỷ lệ thuận với thời gian cho đến khi
nấm bắt đầu ra quả thể. Sự khác nhau về tốc độ lan tơ hệ sợi nấm thể hiện ở bảng 4.3.
Bảng 4.3 Ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣỡng đến sự sinh trƣởng và phát triển của nấm Linh Chi Đen trên các
môi trƣờng giá môi
Nghiệm thức Chiều dài tơ lan (cm)
7 ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày
NT1 1.06e 5.6c 9.5c 13c
NT 2 1.1 d 5.8b 10b 15b
NT 3 1.3a 6.62a 12a 19a
NT 4 1.23c 5.4 d 8.9 d 11.9 d
NT 5 1.25b 5.35e 8.5e 11e
Ghi chú: các ký tự a,b,c,… trong bảng thể hiện sự khác biệt rất có ý nghĩa với độ tin cậy 95%. NT1: 100% mùn cưa NT2: 25% lõi bắp đập vụn + 75% mùn cưa NT3: 50% lõi bắp đập vụn + 50% mùn cưa NT4: 75% lõi bắp đập vụn + 25% mùn cưa