5. Điểm mới của đề tài
2.2.Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái và cách sắp xếp tế bào trên tiêu bản nhuộm kép
Lấy các khuẩn lạc trong các ống thạch nghiêng, làm vết bôi trên lam kính, cố định vết bôi bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn, nhuộm tế bào bằng phƣơng pháp nhuộm Gram [1]:
2. Rửa nƣớc. 3. Dung dịch Lugol: 1 phút. 4. Rửa nƣớc. 5. Cồn 95o: 1 phút. 6. Rửa nƣớc. 7. Dung dịch Fucshin: 1 phút. 8. Rửa nƣớc.
9. Hong khô trên ngọn lửa đèn cồn.
Sau đó soi tiêu bản dƣới vật kính dầu và kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần. Nếu tế bào vi khuẩn nhuộm màu hồng (Gram âm), đó chính là vi khuẩn Gluconacetobacter.
2.2.2. Phương pháp bảo quản chủng giống trên môi trường thạch nghiêng
Các chủng giống sau khi phân lập và sơ bộ xác định là
Gluconacetobacter đƣợc cấy trên môi trƣờng thạch nghiêng (MT1 đã loại bỏ CaCO3), nuôi trong tủ ấm 3 - 4 ngày ở 30oC. Sau đó, giữ lạnh ở tủ 4oC để bảo quản giống. Cấy truyền giữ giống trên môi trƣờng thạch nghiêng hai tháng một lần.
2.2.3. Phương pháp xử lí màng
2.2.3.1. Phương pháp làm trắng và loại bỏ các chất dư thừa của môi trường nuôi cấy.
Rửa sạch màng với nƣớc máy khoảng 3 - 4 lần sau đó dùng dung dịch NaOH để loại bỏ các chất dƣ thừa còn sót lại trên màng.
2.2.3.2. Phương pháp chuẩn độ PH của màng BC
Màng BC sau khi đƣợc làm sạch, trắng và khử mùi và làm sạch các tế bào vi khuẩn trên màng thƣờng có pH kiềm, cần sử dụng acid giúp trung hòa lƣợng kiềm dƣ trong quá trình xử lý trƣớc đó để đƣa pH màng về trung tính.
2.2.3.3. Phương pháp làm sạch tế bào trên màng BC
Dùng bức xạ (radiation)
Dùng hóa chất: NaOH, H2O2, NaCl…
2.2.4. Đánh giá màng sau xử lý
Màng sau khi xử lý đƣợc đánh giá bằng các chỉ tiêu là: màu sắc, mùi vị, độ dai, khả năng dính bám, pH màng.
2.2.5. Phương pháp bảo quản màng
2.2.5.1. Phương pháp sấy khô
Màng sau khi xử lí làm trắng và khử trùng sẽ đƣợc sấy khô trong tủ sấy ở các nhiệt độ khác nhau và thời gian phù hợp với từng mức nhiệt độ. Lúc này màng BC mỏng và dai, sau đó màng đƣợc đóng gói bằng máy hút chân không trong các túi nilon ở điều kiện vô trùng.
2.2.5.2. Bảo quản với dịch chiết thực vật
Màng sau khi sấy xong đƣợc ngâm tẩm với dịch chiết lá chè xanh trong 12h, sau đó mới đƣợc đóng gói bằng máy hút chân không.
Dụng cụ ngâm tẩm màng BC là hộp lồng nhựa, kích thƣớc 10×15 cm2, ngâm 1 màng với 100ml dịch chiết lá chè xanh.
Ở phƣơng pháp này, dịch chiết lá chè xanh sẽ có khả năng ngăn cản sự xâm nhiễm của các vi sinh vật gây mốc, hỏng màng.
2.2.5.3. Phương pháp đóng gói màng BC
Màng sau khi sấy khô hoặc ngâm tẩm với các chất phụ gia sẽ đƣợc đóng gói thủ công trong các túi nilon thông thƣờng hoặc đóng gói bằng máy hút chân không bằng túi nilon chuyên dụng.
2.2.6. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả
Chúng tôi xử lý các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phƣơng pháp nhƣ:
Số trung bình cộng: dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm: 1 n i X X n
Trung bình bình phƣơng các sai lệch: 1 ) ( 1 2 n X X n i i (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sai số đại diện của trung bình cộng: m n
Trong đó: n là số lần thí nghiệm
M là sai số đại diện của trung bình cộng lƣợng axit tạo thành X là chỉ số acid tạo thành trong các lần thí nghiệm
C ƢƠN 3
KẾT QUẢ N ÊN CỨU V T ẢO LUẬN
3.1. Lên men tạo màng BC
3.1.1. Hình thái chủng vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2
3.1.1.1. Hình thái chủng Gluconacetobacter BHN2 trên môi trường thạch đĩa
Hình 3.1. Khuẩn lạc Gluconacetobacter BHN2 trên môi trường thạch đĩa
Trên môi trƣờng thạch đĩa, vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 hình thành khuẩn lạc nhỏ, nhầy nhớt, bằng phẳng hoặc có khuẩn lạc lồi hẳn lên, dễ tách khỏi môi trƣờng. Khuẩn lạc của vi khuẩn có dạng tròn, trắng, đục, đa số bề mặt khuẩn lạc trơn bóng, và cấu trúc khuẩn lạc khá đồng nhất, kích thƣớc trung bình của khuẩn lạc 1 - 2 mm (hình 3.1).
3.1.1.2. Hình thái chủng Gluconacetobacter BHN2 trên ống thạch nghiêng
Hình 3.2. Vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2
trên môi trường thạch nghiêng
Trên môi trƣờng thạch nghiêng khi cấy theo đƣờng zích zắc, vi khuẩn
Gluconacetobacter BHN2 sinh trƣởng thành đƣờng trơn, nhẵn, màu trắng đục.
3.1.1.3. Kết quả nhuộm Gram vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2
Hình 3.3. Kết quả nhuộm Gram của Gluconacetobacter BHN2
Các tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 xếp đơn lẻ, thành đôi, hoặc chuỗi dài, kích thƣớc trung bình khoảng 1,5 - 2µm, bắt màu hồng thuốc nhuộm fucshin.
3.1.2. Nghiên cứu khả năng lên men tạo màng BC của vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2
Bước 1: Chuẩn bị giống
Nhận giống Gluconacetobacter BHN2 thuần chủng từ phòng thí nghiệm Vi sinh, Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2. Tiến hành nhân giống bằng phƣơng pháp cấy truyền.
Bước 2: Nhân giống cấp 1
Hình 3.4. Nhân giống Gluconacetobacter BHN2 cấp 1
Giống thuần chủng đƣợc cấy vào môi trƣờng nhân giống cấp 1 (3 ống giống/250ml môi trƣờng nhân giống), nuôi cấy trên máy lắc ổn nhiệt ( 35oC, lắc 160 vòng/ phút trong vòng 24 - 30 giờ). Các tế bào chủng vi khuẩn
Gluconacetobacter BHN2 hình thành các dạng hạt nhỏ, phân tán trong môi trƣờng, có khi liên kết với nhau tạo thành các sợi cellulose nhỏ, có thể quan sát bằng mắt thƣờng.
Bước 3: Lên men tạo màng
Dùng micro pipet cấy dịch cấp 1 vào môi trƣờng lên men nhân giống cấp 2 (20ml dịch cấp 1/200ml môi trƣờng).
Tiến hành lên men tĩnh trong v ng 5 ngày để tạo màng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bước 4: Thu màng
Trong thực tế nghiên cứu quá trình hình hành màng, tôi nhận thấy ở điều kiện nhiệt độ phòng từ 22 - 27o
C ( tháng 3 - 5/2013), trong 2 ngày đầu lên men, màng BC chƣa hình thành, các sợi cellulose lơ lửng trong dịch lên men. Tới ngày thứ tƣ màng đƣợc hình hành, có màu trắng đục và nổi lên trên
nhất, tới ngày thứ 7 màng bắt đầu chìm xuống đáy dịch lên men và ngả sang màu vàng nhạt.
Hình 3.5. Màng BC sau 5 ngày lên men
Tôi tiến hành thu màng ở ngày thứ 4, thứ 5 và ngày thứ 6 sau khi lên men và so sánh, nhận thấy kết quả sau:
Bảng 3.1. Kết quả thu nhận màng BC
Thời gian Tính chất màng BC
Ngày thứ 4 Màng mỏng, màu trắng đục, mùi chua dịu Ngày thứ 5 Màng dày, trơn bóng, màu trắng ngà đục, mùi chua gắt Ngày thứ 6 Màng dày, mủn, màu ngả vàng, mùi chua nồng
Màng BC thu đƣợc ở ngày thứ 5 có chất lƣợng tốt hơn, vậy tôi tiến hành thu màng ở ngày thứ 5 kể từ khi lên men ở các lần lên men tạo màng sau đó. Màng này sẽ là nguyên liệu cho các khâu xử lí tiếp theo.
Màng BC được thu từ ngày thứ 5 kể từ khi lên men có chất lượng tốt nhất, phù hợp sử dụng làm nguyên liệu cho các khâu xử lí và bảo quản màng.
3. . Quy trình xử lí và bảo quản màng BC ở quy mô phòng thí nghiệm
3.2.1. Xử lí màng sau lên men
Màng BC sau khi vớt ra khỏi dịch lên men chƣa nhiều sản phẩm dƣ thừa, chƣa phù hợp để sử dụng ngay nên màng cần phải trải qua khâu xử lí làm sạch và khử khuẩn để có thể sử dụng cho nhiều mục đích. Tôi tiến hành xử lí theo phƣơng pháp 2.2.3 sau khi thu nhận màng từ dịch lên men.
3.2.1.1. Giai đoạn làm trắng và loại bỏ các chất dư thừa của môi trường nuôi cấy
Tiêu chí đánh giá sản phẩm sau khi xử lý làm sạch màng BC: màng mỏng, dai, khả năng dính bám tốt. Màng BC thu nhận từ quá trình lên men có màu vàngnhạt, nhớt và có mùi chua gắt khó chịu tôi tiến hành rửa với nƣớc nhiều lần để làm sạch bên ngoài màng, sau đó xử lý màng với dung dịch NaOH 0,5N ở các mức nhiệt độ phòng, 70oC và 100oC. Thời gian xử lí từ 5 - 10 phút.Mỗi mức nhiệt độ đƣợc lặp lại 3 lần, mỗi lần xử lí với số lƣợng 15 màng để đảm bảo độ tin cậy. Kết quả đƣợc dẫn ra ở bảng sau:
Bảng 3.2. Kết quả xử lí màng BC với NaOH
Nhiệt độ xử lí (oC)
Đặc tính của màng sau khi xử lí
22-27 Màng trắng đục, hơi dai, mùi khó chịu, pH 8 - 9 70 Màng có màu trắng đục, hơi dai, mùi hơi khét, pH 9,5 - 10,5 100 Màng trắng trong, dai, mùi khét, pH 9,5 - 10,5
Màng BC sau khi xử lí cần mỏng, dai, trắng trong, dính bám tốt. Để đạt đƣợc tiêu chí đó, tôi chọn mức nhiệt độ 100oC để xử lí màng.
Hình 3.6. Màng BC chưa xử lí
Màng BC thu đƣợc sau khi lên men có khối lƣợng trung bình khoảng 17,28g, có màu trắng đục, dày, nhầy nhớt, mùi chua gắt, do còn chứa nhiều tạp chất từ môi trƣờng nuôi cấy.
Hình 3.7. Màng BC qua xử lí NaOH
Dung dịch NaOH đƣợc sử dụng phổ biến trong các phòng thí nghiệm, đây là một loại kiềm mạnh, vừa có tác dụng tẩy rửa các tạp chất bám trên màng, vừa có tác dụng làm chết các tế bào trên màng. Màng BC sau khi xử lí
với NaOH có chất lƣợng khá tốt về mặt cảm quan và lí hóa, nồng độ NaOH sử dụng đem lại hiệu quả tối ƣu nhất là 0,5N.
Nồng độ NaOH dùng trong xử lí màng là 0,5N 3.2.1.2. Giai đoạn trung h a pH màng BC
Màng BC sau khi đun với NaOH có pH kiềm (9,5 - 10,5) cần phải dùng acid để trung hòa. Với điều kiện phòng thí nghiệm, tôi sử dụng 2 loại acid là acid citric 5% và acid acetic 5% để trung hòa pH màng BC. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.3 Bảng 3.3. Kết quả trung h a pH màng BC pH màng 2h 4h 6h 8h Acid citric 5% 6,0 - 6,5 6,0 4,5 - 5 4,0 Acid acectic 5% 6,0 - 7,2 5,5 - 6 4,5 - 5 4,5
Kết quả thu đƣợc tại bảng 3.3 cho thấy, thời gian ngâm màng càng lâu, pH màng càng giảm. Màng BC sau khi trung h a cần có pH trung tính, sau 2h 2 loại acid sử dụng để trung h a đều cho kết quả tốt. Vậy có thể sử dụng cả 2 loại acid này để trung h a pH màng. Acid acetic và acid citric đều phổ biến trong phòng thí nghiệm, tuy nhiên xét về giá thành, acid acetic lại rẻ hơn nên tôi quyết định chọn loại acid này để trung h a pH màng.
Sử dụng acid acetic 5% để trung h a pH màng BC về mức trung tính (pH: 7) 3.2.1.3. Giai đoạn làm sạch tế bào trên màng BC (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Màng BC sau khi tẩy rửa, làm trắng sẽ đƣợc diệt khuẩn 2 lần
Lần 1. Dùng nhiệt độ và áp suất cao: Màng BC sau khi xử lí về pH trung tính đƣợc tiến hành hấp thanh trùng ở 121o
C trong 20 phút để tiêu diệt hết vi khuẩn còn bám trên màng.
Lần 2. Dùng bức xạ: Màng BC sau khi hấp tiếp tục đƣợc khử trùng lần 2 bằng cách đƣa vào buồng kín, chiếu tia UV trong 15 phút để đảm bảo sạch khuẩn.
Acid
Màng BC sau giai đoạn làm sạch trên màng hoàn toàn vô khuẩn, màng này có thể sử dụng cho nhiều mục đích nhƣ dùng trị bỏng hay sấy tới độ ẩm thích hợp để làm màng bao gói thực phẩm.
3.2.1.4. Đánh giá màng sau xử lí
Bảng 3.4. Đánh giá màng BC sau xử lí
Tiêu chí đánh giá Màng sau xử lí Màu sắc Màu trắng trong
Mùi vị Không mùi
Độ dai Màng dai
Khả năng dính bám Màng có khả năng dính bám tốt pH màng Trung tính 6 - 7,5
Màng BC sau khi xử lí đã đạt đƣợc các tiêu chí về cảm quan cũng nhƣ tính chất vật lí, có thể sử dụng ngay hoặc sấy khô để bảo quản.
3.2.2. Bảo quản màng BC
3.2.2.1. Sấy khô
Màng BC sau khi xử lí đƣợc sấy khô để bảo quản. Tôi tiến hành sấy màng ở 3 mức nhiệt độ 30oC, 50oC, 70oC cho tới khi khối lƣợng màng không đổi. Mỗi mức nhiệt độ đƣợc lặp lại 3 lần, mỗi lần 15 màng để đảm bảo độ tin cậy. Kết quả đƣợc dẫn ra trong bảng sau:
Bảng 3.5. Kết quả màng BC đã sấy
Nhiệt độ(oC) Thời gian sấy, tính chất màng
30 36h, màng đồng nhất, khi ngâm với nƣớc có khả năng trở lại khối lƣợng tƣơi ban đầu
50 20h, màng tƣơng đối đồng nhất, khi ngâm với nƣớc có khả năng trở lại khối lƣợng tƣơi ban đầu
70 8,5h, màng không đồng nhất, không có khả năng trở lại khối lƣợng tƣơi ban đầu
Màng BC sấy ở 30oC tuy thời gian sấy màng khá dài nhƣng thu đƣợc màng có chất lƣợng tốt nhất. Tôi chọn nhiệt độ sấy màng là 30oC.
Màng BC sau khi xử lí được sấy khô ở 30oC trong 36h để bảo quản
Hình 3.8. Màng BC sấy ở 30oC
Màng BC không bị thay đổi về kích thƣớc, màng trong suốt, độ đồng nhất cao, độ đàn hồi tốt.
Hình 3.9. Màng BC sấy ở 50oC
Màng BC sấy ở 50oC tuy kích thƣớc không thay đổi so với ban đầu nhƣng màng có độ đồng nhất và độ đàn hồi cũng thấp hơn.
Hình 3.10. Màng BC sấy ở 70oC
Màng BC sấy ở 70oC kích thƣớc đã thay đổi so với ban đầu, tỉ lệ về diện tích giữa màng BC sau khi sấy với màng BC ban đầu là 88,75%.
3.2.2.2. Bảo quản với dịch chiết lá ch xanh (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Có nhiều phƣơng pháp để bảo quản màng BC, ngoài phƣơng pháp sấy khô, tôi sử dụng phƣơng pháp bảo quản ƣớt với dịch chiết thực vật. Dịch chiết lá chè xanh có khả năng kháng khuẩn rất tốt nên tôi đã sử dụng để làm dịch bảo quản màng BC. Kết quả cho thấy thời gian bảo quản màng lâu hơn so với thông thƣờng.
Hình 3.11. Màng BC ngâm với dịch chiết lá ch xanh
Màng BC sau thời gian ngâm tẩm màng có màng vàng nâu, pH không thay đổi so với trƣớc khi ngâm màng.
Ngâm màng BC đã xử lí với dịch chiết lá ch xanh trong 12h để bảo quản.
3.2.2.3. Đóng gói màng BC
Mục đích của phƣơng pháp đóng gói màng BC là làm tăng thời gian bảo quản màng, tránh bị nhiễm các vi sinh vật từ môi trƣờng gây mốc hỏng màng. Với điều kiện phòng thí nghiệm, tôi sử dụng phƣơng pháp đóng gói bằng máy hút chân không AmeraR- V100 và túi nilon chuyên dụng. Tất cả các thao tác trên đƣợc thực hiện trong box cấy vô trùng đảm bảo màng không bị nhiễm các vi sinh vật trong không khí.
Hình 3.12. Màng BC đóng gói thủ công và nấm mốc xuất hiện trên màng
Khi sử dụng phƣơng pháp đóng gói thủ công, thời gian bảo quản màng khoảng 15 ngày, trên bề mặt màng đã xuất hiện nấm mốc.
Hình 3.13. Màng BC đóng gói bằng máy hút chân không
Đối với phƣơng pháp sử dụng máy hút chân không để đóng gói màng BC, thời gian bảo quản màng lâu hơn. Qua quan sát thực tế, sau 2 tháng màng vẫn không có dấu hiệu mốc hỏng.
Nên dùng máy hút chân không để đóng gói màng BC
3.2.3. Khả năng ngăn cản vi vi sinh vật của màng BC
Dùng màng BC đã qua xử lí che phủ lên bản thạch dinh dƣỡng, quan sát đối chiếu với bản thạch không đƣợc che phủ và bản thạch che phủ bởi gạc vô trùng ở trong không khí kết quả đƣợc dẫn ra ở bảng sau:
Bảng 3.6. Khả năng ngăn cản vi sinh vật của màng BC
Thời gian xuất hiện khuẩn lạc Bản thạch che phủ bằng màng BC Bản thạch che phủ bằng gạc vô trùng Bản thạch không đƣợc che phủ Ngày thứ nhất - - - Ngày thứ 2 - - + Ngày thứ 3 - - + Ngày thứ4 - - + Ngày thứ 5 - + + Ngày thứ 6 - + + Ngày thứ 7 - + + Chú thích: ( - )Không có khuẩn lạc (+ )Xuất hiện khuẩn lạc
Màng BC sau khi xử lí có khả năng ngăn cản tốt các loại vi sinh vật, có