5. Điểm mới của đề tài
3.2.1. Xử lí màng sau lên men
Màng BC sau khi vớt ra khỏi dịch lên men chƣa nhiều sản phẩm dƣ thừa, chƣa phù hợp để sử dụng ngay nên màng cần phải trải qua khâu xử lí làm sạch và khử khuẩn để có thể sử dụng cho nhiều mục đích. Tôi tiến hành xử lí theo phƣơng pháp 2.2.3 sau khi thu nhận màng từ dịch lên men.
3.2.1.1. Giai đoạn làm trắng và loại bỏ các chất dư thừa của môi trường nuôi cấy
Tiêu chí đánh giá sản phẩm sau khi xử lý làm sạch màng BC: màng mỏng, dai, khả năng dính bám tốt. Màng BC thu nhận từ quá trình lên men có màu vàngnhạt, nhớt và có mùi chua gắt khó chịu tôi tiến hành rửa với nƣớc nhiều lần để làm sạch bên ngoài màng, sau đó xử lý màng với dung dịch NaOH 0,5N ở các mức nhiệt độ phòng, 70oC và 100oC. Thời gian xử lí từ 5 - 10 phút.Mỗi mức nhiệt độ đƣợc lặp lại 3 lần, mỗi lần xử lí với số lƣợng 15 màng để đảm bảo độ tin cậy. Kết quả đƣợc dẫn ra ở bảng sau:
Bảng 3.2. Kết quả xử lí màng BC với NaOH
Nhiệt độ xử lí (oC)
Đặc tính của màng sau khi xử lí
22-27 Màng trắng đục, hơi dai, mùi khó chịu, pH 8 - 9 70 Màng có màu trắng đục, hơi dai, mùi hơi khét, pH 9,5 - 10,5 100 Màng trắng trong, dai, mùi khét, pH 9,5 - 10,5
Màng BC sau khi xử lí cần mỏng, dai, trắng trong, dính bám tốt. Để đạt đƣợc tiêu chí đó, tôi chọn mức nhiệt độ 100oC để xử lí màng.
Hình 3.6. Màng BC chưa xử lí
Màng BC thu đƣợc sau khi lên men có khối lƣợng trung bình khoảng 17,28g, có màu trắng đục, dày, nhầy nhớt, mùi chua gắt, do còn chứa nhiều tạp chất từ môi trƣờng nuôi cấy.
Hình 3.7. Màng BC qua xử lí NaOH
Dung dịch NaOH đƣợc sử dụng phổ biến trong các phòng thí nghiệm, đây là một loại kiềm mạnh, vừa có tác dụng tẩy rửa các tạp chất bám trên màng, vừa có tác dụng làm chết các tế bào trên màng. Màng BC sau khi xử lí
với NaOH có chất lƣợng khá tốt về mặt cảm quan và lí hóa, nồng độ NaOH sử dụng đem lại hiệu quả tối ƣu nhất là 0,5N.
Nồng độ NaOH dùng trong xử lí màng là 0,5N 3.2.1.2. Giai đoạn trung h a pH màng BC
Màng BC sau khi đun với NaOH có pH kiềm (9,5 - 10,5) cần phải dùng acid để trung hòa. Với điều kiện phòng thí nghiệm, tôi sử dụng 2 loại acid là acid citric 5% và acid acetic 5% để trung hòa pH màng BC. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.3 Bảng 3.3. Kết quả trung h a pH màng BC pH màng 2h 4h 6h 8h Acid citric 5% 6,0 - 6,5 6,0 4,5 - 5 4,0 Acid acectic 5% 6,0 - 7,2 5,5 - 6 4,5 - 5 4,5
Kết quả thu đƣợc tại bảng 3.3 cho thấy, thời gian ngâm màng càng lâu, pH màng càng giảm. Màng BC sau khi trung h a cần có pH trung tính, sau 2h 2 loại acid sử dụng để trung h a đều cho kết quả tốt. Vậy có thể sử dụng cả 2 loại acid này để trung h a pH màng. Acid acetic và acid citric đều phổ biến trong phòng thí nghiệm, tuy nhiên xét về giá thành, acid acetic lại rẻ hơn nên tôi quyết định chọn loại acid này để trung h a pH màng.
Sử dụng acid acetic 5% để trung h a pH màng BC về mức trung tính (pH: 7) 3.2.1.3. Giai đoạn làm sạch tế bào trên màng BC
Màng BC sau khi tẩy rửa, làm trắng sẽ đƣợc diệt khuẩn 2 lần
Lần 1. Dùng nhiệt độ và áp suất cao: Màng BC sau khi xử lí về pH trung tính đƣợc tiến hành hấp thanh trùng ở 121o
C trong 20 phút để tiêu diệt hết vi khuẩn còn bám trên màng.
Lần 2. Dùng bức xạ: Màng BC sau khi hấp tiếp tục đƣợc khử trùng lần 2 bằng cách đƣa vào buồng kín, chiếu tia UV trong 15 phút để đảm bảo sạch khuẩn.
Acid
Màng BC sau giai đoạn làm sạch trên màng hoàn toàn vô khuẩn, màng này có thể sử dụng cho nhiều mục đích nhƣ dùng trị bỏng hay sấy tới độ ẩm thích hợp để làm màng bao gói thực phẩm.
3.2.1.4. Đánh giá màng sau xử lí
Bảng 3.4. Đánh giá màng BC sau xử lí
Tiêu chí đánh giá Màng sau xử lí Màu sắc Màu trắng trong
Mùi vị Không mùi
Độ dai Màng dai
Khả năng dính bám Màng có khả năng dính bám tốt pH màng Trung tính 6 - 7,5
Màng BC sau khi xử lí đã đạt đƣợc các tiêu chí về cảm quan cũng nhƣ tính chất vật lí, có thể sử dụng ngay hoặc sấy khô để bảo quản.
3.2.2. Bảo quản màng BC
3.2.2.1. Sấy khô
Màng BC sau khi xử lí đƣợc sấy khô để bảo quản. Tôi tiến hành sấy màng ở 3 mức nhiệt độ 30oC, 50oC, 70oC cho tới khi khối lƣợng màng không đổi. Mỗi mức nhiệt độ đƣợc lặp lại 3 lần, mỗi lần 15 màng để đảm bảo độ tin cậy. Kết quả đƣợc dẫn ra trong bảng sau:
Bảng 3.5. Kết quả màng BC đã sấy
Nhiệt độ(oC) Thời gian sấy, tính chất màng
30 36h, màng đồng nhất, khi ngâm với nƣớc có khả năng trở lại khối lƣợng tƣơi ban đầu
50 20h, màng tƣơng đối đồng nhất, khi ngâm với nƣớc có khả năng trở lại khối lƣợng tƣơi ban đầu
70 8,5h, màng không đồng nhất, không có khả năng trở lại khối lƣợng tƣơi ban đầu
Màng BC sấy ở 30oC tuy thời gian sấy màng khá dài nhƣng thu đƣợc màng có chất lƣợng tốt nhất. Tôi chọn nhiệt độ sấy màng là 30oC.
Màng BC sau khi xử lí được sấy khô ở 30oC trong 36h để bảo quản
Hình 3.8. Màng BC sấy ở 30oC
Màng BC không bị thay đổi về kích thƣớc, màng trong suốt, độ đồng nhất cao, độ đàn hồi tốt.
Hình 3.9. Màng BC sấy ở 50oC
Màng BC sấy ở 50oC tuy kích thƣớc không thay đổi so với ban đầu nhƣng màng có độ đồng nhất và độ đàn hồi cũng thấp hơn.
Hình 3.10. Màng BC sấy ở 70oC
Màng BC sấy ở 70oC kích thƣớc đã thay đổi so với ban đầu, tỉ lệ về diện tích giữa màng BC sau khi sấy với màng BC ban đầu là 88,75%.
3.2.2.2. Bảo quản với dịch chiết lá ch xanh
Có nhiều phƣơng pháp để bảo quản màng BC, ngoài phƣơng pháp sấy khô, tôi sử dụng phƣơng pháp bảo quản ƣớt với dịch chiết thực vật. Dịch chiết lá chè xanh có khả năng kháng khuẩn rất tốt nên tôi đã sử dụng để làm dịch bảo quản màng BC. Kết quả cho thấy thời gian bảo quản màng lâu hơn so với thông thƣờng.
Hình 3.11. Màng BC ngâm với dịch chiết lá ch xanh
Màng BC sau thời gian ngâm tẩm màng có màng vàng nâu, pH không thay đổi so với trƣớc khi ngâm màng.
Ngâm màng BC đã xử lí với dịch chiết lá ch xanh trong 12h để bảo quản.
3.2.2.3. Đóng gói màng BC
Mục đích của phƣơng pháp đóng gói màng BC là làm tăng thời gian bảo quản màng, tránh bị nhiễm các vi sinh vật từ môi trƣờng gây mốc hỏng màng. Với điều kiện phòng thí nghiệm, tôi sử dụng phƣơng pháp đóng gói bằng máy hút chân không AmeraR- V100 và túi nilon chuyên dụng. Tất cả các thao tác trên đƣợc thực hiện trong box cấy vô trùng đảm bảo màng không bị nhiễm các vi sinh vật trong không khí.
Hình 3.12. Màng BC đóng gói thủ công và nấm mốc xuất hiện trên màng
Khi sử dụng phƣơng pháp đóng gói thủ công, thời gian bảo quản màng khoảng 15 ngày, trên bề mặt màng đã xuất hiện nấm mốc.
Hình 3.13. Màng BC đóng gói bằng máy hút chân không
Đối với phƣơng pháp sử dụng máy hút chân không để đóng gói màng BC, thời gian bảo quản màng lâu hơn. Qua quan sát thực tế, sau 2 tháng màng vẫn không có dấu hiệu mốc hỏng.
Nên dùng máy hút chân không để đóng gói màng BC
3.2.3. Khả năng ngăn cản vi vi sinh vật của màng BC
Dùng màng BC đã qua xử lí che phủ lên bản thạch dinh dƣỡng, quan sát đối chiếu với bản thạch không đƣợc che phủ và bản thạch che phủ bởi gạc vô trùng ở trong không khí kết quả đƣợc dẫn ra ở bảng sau:
Bảng 3.6. Khả năng ngăn cản vi sinh vật của màng BC
Thời gian xuất hiện khuẩn lạc Bản thạch che phủ bằng màng BC Bản thạch che phủ bằng gạc vô trùng Bản thạch không đƣợc che phủ Ngày thứ nhất - - - Ngày thứ 2 - - + Ngày thứ 3 - - + Ngày thứ4 - - + Ngày thứ 5 - + + Ngày thứ 6 - + + Ngày thứ 7 - + + Chú thích: ( - )Không có khuẩn lạc (+ )Xuất hiện khuẩn lạc
Màng BC sau khi xử lí có khả năng ngăn cản tốt các loại vi sinh vật, có thể ứng dụng ngay trong điều trị bỏng hoặc bao gói trái cây, thực phẩm…
3.2.4. Hoàn thiện quy trình xử lí và bảo quản màng BC ở quy mô phòng thí nghiệm nghiệm
Mô hình xử lí của tác giả Nguyễn Thi Tuyết K33C Sinh, Khoa Sinh KTNN, trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 tƣơng đối hoàn thiện, tuy nhiên màng BC sau khi xử lí vẫn rất mỏng, độ dai kém. Trên cơ sở đó, tôi tiến hành xây dựng và hoàn thiện quy trình xử lí màng BC mới, khắc phục nhƣợc điểm của màng sau xử lí, nhằm tạo ra chế phẩm màng BC có chất lƣợng tốt nhất.
Quy trình hoàn thiện đƣợc trình bày nhƣ sau: Màng BC chƣa xử lí Rửa sạch với nƣớc máy Đun với NaOH 0,5N ở 100o
C trong 5-10 phút
Trung hòa bằng acid acetic 5% ở nhiệt độ phòng
Rửa sạch với nƣớc máy Thử lại bằng giấy quỳ
Hấp thanh trùng ở 121oC trong 20 phút
Chiếu xạ tia UV trong 20 phút
Ngâm với dịch chiết lá chè xanh trong 12h Sấy khô ở 30oC trong 36h Chiếu xạ tia UV Trong 20 phút Chiếu xạ tia UV Trong 20 phút Đóng gói bằng máy hút chân không
Đóng gói bằng máy hút chân không
Chế phẩm màng BC dạng ƣớt
dạng ƣớt
Chế phẩm màng BC dạng sấy khô
Màng BC thu đƣợc từ quá trình nuôi cấy chủng vi khuẩn
Gluconacetobacter BHN2, tôi đã nghiên cứu cải tiến quy trình xử lí và bảo quản màng BC ở giai đoạn trung h a pH màng và sử dụng dịch chiết thực vật để bảo quản thay cho dùng dung dịch kháng sinh của các tác giả đi trƣớc.
Hình 3.14. Màng BC xử lí theo quy trình mới và đối chứng
So với các quy trình đƣợc đƣa ra của các tác giả trƣớc, quy trình xử lí và bảo quản này đã rút ngắn thời gian xử lí màng, thời gian xử lí <24h, màng sau xử lí độ dày không giảm nhiều, không bị biến đổi tính chất.
3.6. Cải tiến xử lý bảo quản màng BC
Trong quy trình trên, tôi đã cải tiến bƣớc trung h a pH màng bằng acid acetic 5%, kết quả thu đƣợc pH màng ở mức trung tính, không gây kích ứng khi sử dụng. Acid acetic khá phổ biến trong phòng thí nghiệm, việc sử dụng trong trung h a đem lại hiệu quả cao nên tôi quyết định lựa chọn loại acid này.
Màng BC sau hi trung h a có pH khoảng 6 - 7, pH ở mức trung tính, không gây kích ứng khi sử dụng.
Trong khâu bảo quản màng BC, tôi đã sử dụng dịch chiết lá chè xanh để bảo quản (bảo quản ƣớt), kết quả cho thấy sau 2 tháng màng vẫn không có dấu hiệu mốc hỏng.
Hình 3.16. Màng BC ngâm với dịch chiết lá ch xanh
Hình 3.17. Màng BC ngâm dịch chiết sau 2 tháng
Kết quả ngâm màng BC với dịch chiết lá chè xanh cho thấy màng BC vẫn giữ đƣợc tính chất về độ dai và độ pH, đây là dịch chiết có tính kháng khuẩn rất tốt, có thể ứng dụng bảo quản màng BC dạng ƣớt, khi dùng trong điều trị bỏng không cần phải ngâm tẩm lại.
KẾT LUẬN V K ẾN N Ị
4.1. Kết luận
Màng BC thu đƣợc từ quá trình nuôi cấy chủng vi khuẩn
Gluconacetobacter BHN2, tôi đã nghiên cứu quy trình xử lí và bảo quản ở quy
mô phòng thí nghiệm. Màng BC sau khi thu nhận ở ngày thứ 5 kể từ khi lên
men. Sau đó màng BC sẽ đƣợc xử lí với NaOH 0,5N ở 100o
C trong 5 - 10 phút, trung h a pH màng bằng acid acetic 5%. Điểm mới trong đề tài này là tôi đã sử dụng acid acetic 5% trong trung h a pH màng và sử dụng dịch chiết lá chè xanh trong bảo quản màng BC đều thu đƣợc kết quả tốt. Dịch chiết lá chè xanh có tính kháng khuẩn rất cao, phù hợp sử dụng làm dung dịch bảo quản màng BC. Việc bảo quản màng bằng dịch chiết sẽ giúp tiết kiệm chi phí so với sử dụng các dịch kháng sinh khác.
. . Kiến nghị
Trên đây là kết quả nghiên cứu bƣớc đầu của chúng tôi về quy trình xử lí màng BC trong phòng thí nghiệm với mục đích tạo ra một mô hình xử lí chung cho màng BC. Tôi mong rằng, các nghiên cứu về quy trình này tiếp tục đƣợc thực hiện nhằm đƣa ra một quy trình xử lí hiệu quả và hoàn thiện nhất, kéo dài thời gian bảo quản màng BC. Đây là hƣớng nghiên cứu rất có triển vọng.
T L ỆU T AM K ẢO
[1]. Mai Thị Hằng, Đinh Thị Kim Nhung, Vƣơng Trọng Hào (2011). Thực hành vi sinh vật. Nxb Đại học Sư Phạm Hà Nội.
[2].Đặng Thị Hồng. (2007). Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Acetobacter xylinum chế tạo màng sinh học. Luận văn thạc sĩ sinhhọc, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội.
[3].Đặng Thị Hồng, Đinh Thị Kim Nhung.(2007). Tuyển chọn chủng
Acetobacter xylinum tạo màng sinh học (BC). Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học và sự sống. Hội nghị khoa học cơ bản toàn quốc lần 5 tại Qui Nhơn 2007, trang 728-731.
[4].Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh.(2006). Nghiên cứu các đặc tính màng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng. Tạp chí dược học, số 5, năm 2006.
[5]. Lô Thị Bảo Khánh, Đinh Thị Kim Nhung, Dƣơng Minh Lam.( 2011). Nghiên cứu xử lý và bảo quản màng Bacterial cellulose (BC) từ chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2. Kỷ yếu Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ 4 về sinh thái và tài nguyên sinh vật. Hà Nội, ngày 21/10/2011, trang 1181-1184.
[6]. Lô Thị Bảo Khánh.(2011). Nghiên cứu xử lý và bảo quản màng Bacterial Cellulose từ chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2. Luận văn Thạc sỹ sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội.
[7]. Lê Năm, Lâm Thị Đan Chi, Chu Anh Tuấn, Huỳnh Thị Ngọc Lan (2010). Tác dụng điều trị tại chỗ vết thƣơng bỏng nông của màng Acetul. Tạp chí Y học thảm họa và bỏng, số 4, 2010, trang 77-137.
[8]. Nguyễn Thị Nguyệt, (2008) Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng Bacterial cellulose làm mặt nạ dƣỡng da. Luận văn Thạc sỹ sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội.
[9]. Tạ Thị Mai Anh, Nguyễn Thị Lan, Vũ Văn Khoan, Đào Văn Kiên, Nguyễn Thị Thùy Vân, Đinh Thị Kim Nhung. (2010). Nghiên cứu các phƣơng pháp xử lý màng BC và ứng dụng trong điều trị bỏng của vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2. Kỷ yếu Hội nghị Sinh viên nghiên cứu khoa học Các trường ĐHSP toàn quốc lần thứ V, năm 2010 tại Đại học Đồng Tháp, Bộ Giáo dục và Đào tạo.
[10]. Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Hoàng Thị Thảo. (2011). Nghiên cứu vi khuẩnAcetorbacter xylinum sinh tổng hợp màng Bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị bỏng. Tạp chí y học thảm họa & bỏng.
Viện bỏng Quốc Gia, Hội bỏng Việt Nam, trang 122-127.
[11]. Trần Thị Mai, Nguyễn Thị An, Nguyễn Thị Ngọc Mai, Đoàn Thị Thủy, Bùi Thị Thủy, Đinh Thị Kim Nhung. (2012). Nghiên cứu khả năng tạo màng BC cho chủng Gluconacetobacter bằng phƣơng pháp gây đột biến tia UV. Kỷ yếu toàn văn Hội nghị Sinh viên nghiên cứu khoa học Các trường ĐHSP toàn quốc lần thứ VI, năm 2012. Bộ Giáo dục và Đào tạo, Trường ĐHSP Hà nội 2, Nxb Đại học Sư Phạm Hà Nội, trang 590-597. [12]. Đinh Thị Kim Nhung, Trần Thị Mai, Phạm Thị Hƣơng, Đỗ Thị Nga,
(2012). Nghiên cứu một số đặc tính của màng BC tạo ra từ chủng
Bacterial cellulose. Kỷ yếu Hội nghị khoa học trẻ lần thứ VII năm 2012. Bộ Giáo dục và Đào tạo, Trường ĐHSP Hà nội 2, Nxb ĐH Sư Phạm, trang 193-198.
[13]. Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân. (2012). Tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy cho vi khuẩn Acetobacter xylinum D9. Tạp chí sinh học 2012, 34(3). trang 337 - 342.
[14]. Đinh Thị Kim Nhung, Dƣơng Minh Lam. (2012). Nghiên cứu định danh chủng vi khuẩn BHN2_21 có khả năng tạo màng Bacterial cellulose (BC)
