3.7.1. Kiểm tra vô trùng của chế phẩm.
Chỉ tiêu vô trùng là chỉ tiêu quan trọng của mỗi chế phẩm vì vậy chúng tôi tiến hành kiểm tra vô trùng của chế phẩm này.
Lấy mẫu hai loại chế phẩm dạng uống và dạng tiêm cấy gạt trên 4 loại môi trường là: thạch máu, thạch dinh dưỡng, nước thịt gan yếm khí và thạch
nấm. Sau khi cấy để tủ ấm 370C. Qua kiểm tra cho thấy các lô chế phẩm đều vô
trùng, không nhiễm các loại vi khuẩn bất lợi.
Bảng 8: Bảng kết quả kiểm tra độ vô trùng của chế phẩm.
Dạng chế phẩm
Thời gian bảo quản
(tháng)
Kiểm tra vô trùng
Thạch máu Nước thịt Yếm khí Thạch nấm
Chế phẩm dạng tiêm cúm A/H5N1 1 - - - - 2 - - - - 3 - - - - 4 - - - - 5 - - - - 6 - - - -
Qua bảng trên ta thấy chế phẩm qua thời gian bảo quản từ tháng thứ nhất tới tháng thứ 6. Sau khi cấy chế phẩm cần kiểm tra vào các môi trường trên, hàng ngày theo dõi sự phát triển của vi khuẩn và nấm trên các môi trường, chúng tôi không thấy môi trường bị biến đổi như: vẩn đục, dung huyết, sinh khí, nấm mọc,…Điều đó chứng tỏ rằng chế phẩm đã đạt độ vô trùng cần thiết.
3.7.2. Kiểm tra độ an toàn.
Nói đến chỉ tiêu an toàn, tức là nói đến mức độ không độc hại của chế phẩm kháng thể như là không phát bệnh do có lẫn các mầm bệnh hoặc ngộ độc do hóa chất hay một yếu tố nào khác khi sử dụng cho vật nuôi. Như vậy cơ thể vật nuôi sau khi nhận được chế phẩm không được phép có những triệu chứng bệnh tích của bệnh, không có những thay đổi các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa bình thường. Con vật ăn uống, hoạt động và mọi phản xạ tốt. Chế phẩm kháng thể được sản xuất từ những Protein (cùng loài không được gây phản ứng với cơ thể, các chất bổ trợ, dung môi pha loãng không được gây độc cho vật nuôi).
Phôi trứng gà 9 đến 10 ngày tuổi rất mẫn cảm với các tác nhân bất lợi. Do vậy chúng tôi tiêm vacxin cúm vào trứng để đánh giá độ an toàn của vacxin trước khi dùng để gây miễn dịch trên gà.
65 quả trứng có phôi được ấp trong tủ ấm 370C, đến khi phôi trứng được 9
ngày tuổi kiểm tra thì 100% phôi khỏe. Chia làm 4 lô từ lô 1 đến lô 3 tiến hành tiêm chế phẩm kháng thể cúm A/H5N1 mỗi lô 20 phôi mỗi phôi tiêm 0,2ml, còn
lại 5 phôi lô đối chứng không tiêm gì. Tiếp tục ấp trong tủ ấm 370C. Sau 24 giờ
Bảng 9: Bảng kết quả kiểm tra độ an toàn của chế phẩm cúm A/H5N1
Loại chế phẩm
Lô thí nghiệm
Thời gian kiểm tra
24h 48h 72h 96h 108h C S C S C S C S C S Chế phẩm dạng tiêm cúm A/H5N1 1 1 9 0 9 0 9 0 9 0 9 2 0 10 0 10 0 10 0 10 0 10 3 0 10 0 10 0 10 0 10 0 10 ĐC 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 Chú thích: C : phôi chết S : phôi sống
Sau 24 giờ có 1 phôi chết. Mổ khám phôi chết thấy dịch trứng đục, mùi thối. Chúng tôi tiếp tục theo dõi các phôi ở trong 3 lô thí nghiệm trong 108 giờ thấy các phôi đều sống khỏe và đạt tỷ lệ sống là 100%. Do vậy chúng tôi đưa ra kết luận phôi trứng đó chết do nhiễm khuẩn hoặc do tiêm sai kỹ thuật. Các chất bổ trợ có trong chế phẩm không gây mẫn cảm với phôi, đạt độ an toàn cao.
3.7.3. Kiểm tra hiệu lực của chế phẩm kháng thể.
Để khẳng định chế phẩm khi đưa vào cơ thể vật nuôi có tác dụng bảo hộ chống vi rút cúm A/H5N1 chúng tôi sử dụng phương pháp công cường độc để đánh giá.
Thỏ được chia làm 8 lô, chúng tôi sử dụng 3 lô tiêm chế phẩm với liều lượng 1ml, 2ml, 3ml, 1 lô đối chứng không tiêm chế phẩm, còn lại 4 lô,3 lô đầu chúng tôi tiến hành đưa chế phẩm vào cơ thể động vật thí nghiệm qua đường tiêu hóa còn lại ô cuối cùng là lô đối chứng không tiêm chế phẩm. Sau 3 ngày chúng tôi tiến hành công cường độc vi rút cúm A/H5N1 chủng NIBRG - 14 trên tất cả
các lô thí nghiệm. Theo dõi và quan sát biểu hiện lâm sàng và mổ khám sau 5 ngày công cường độc. Kết quả được chúng tôi tổng kết ở bảng dưới đây:
Bảng 10: Bảng Kết quả kiểm tra hiệu lực chế phẩm.
Lô TN Liều chế phẩm tiêm dưới da (ml)
Tiêm kháng thể, sau 5 ngày thử thách cường độc Liều virus cường độc (ml) Đường gây nhiễm
Thân nhiệt Lâmsàng Bệnh
tích I(n=5) 1,0 0,4 Tiêm dưới da Sốt + + II(n=5) 2,0 0,4 Bình thường - - III(n=5 3,0 0,4 Bình thường - - ĐC(n=5) - 0,4 Sốt cao + + Ghi chú: n: số con
Qua quá trình chúng tôi theo dõi sau khi tiến hành công cường độc chúng tôi thấy. Lô 1 tiêm chế phẩm với liều 1 ml chế phẩm/1 thỏ có 2 con có biểu hiện sốt nhẹ với triệu chứng lâm sàng như kém ăn, chảy nước mũi, phân có màu xanh trắng, chân có xung huyết... Sau khi mổ khám thấy ở lô 1 này nội tạng thỏ có biểu hiện bất thường như: phổi xuất huyết, có dịch màu trắng và đặc ở phế quản,.... Lô 2 và lô 3 không thấy có những biểu hiện của bệnh, kết quả mổ khám 2 lô này cũng cho thấy thỏ dược tiêm với liều lượng 2ml và 3ml có khả năng bảo hộ hoàn toàn với liều công cường độc. Lô đối chứng không được tiêm kháng thể thì vi rút xâm nhập cơ thể thỏ và gây bệnh tích rõ rệt như sốt cao, các biệu hiện lâm sàng nhiễm virus cúm A/H5N1, như : kém ăn, chảy nước mũi, khó thở, nằm lì một chỗ, phân loãng màu xanh trắng, chân tụ huyết...Mổ khám thấy phổi có
biểu hiện bệnh rõ là xuất huyết cơ ngực và tim, hoại tử, thâm nhiễm, thận xuất huyết lấm tấm, tụ huyết, lách sưng tụ huyết.
Qua kết quả trên cho thấy tiêm chế phẩm với liều lượng 2-3 ml là có thể có hiệu lực cao, không có hiện tượng bệnh tích vì vậy chúng tôi dùng liều lượng tiêm chế phẩm cho vật nuôi là 2ml.
3.8. Ứng dụng chế phẩm kháng thể thụ động để điều trị thăm dò bệnh cúm gia cầm A/H5N1.
3.8.1. Ứng dụng kháng thể thụ động điều trị thăm dò bệnh.
Theo dõi một số đàn gà bị bệnh ở các địa phương: Đa Tốn – Gia Lâm – Hà Nội, Gốt – Chương Mỹ - Hà Nội, Minh Tân – Vụ Bản – Nam Định. Trung bình mỗi đàn gà trong các nông hộ nuôi khoảng 200 con gà chủ yếu là giống Tam Hoàng (TH), Lương Phượng (LP), và gà ISA. Tuổi gà bệnh là từ 20 - 40 ngày tuổi. Sau khi gà bị bệnh 2 ngày và đã có gà chết chúng tôi tiêm chế phẩm kháng thể để điều trị lần 1 với liều lượng 1ml/con. Sau 3 ngày chúng tôi lại tiêm chế phẩm lần 2 với liều 1ml/con. Kết quả được trình bày ở Bảng 11. Sau khi điều trị lần 1 tỉ lệ gà chết giẩm, cụ thể là trước khi điều trị gà chết 10,33% sau khi điều trị thì tỉ lệ này giảm xuống còn 3,72%.
Bảng 11: Kết quả điều trị bệnh bằng chế phẩm sinh học(sau 2 ngày)
Giốn g gà Số lượng (con) Tuổi gà (ngày) Liều lượng (ml/con) Chết trước
điều trị(con) Sau điều trị
Lần 1 Lần 2 n % Chết Sống n % n % TH 200 24 0,5 0,5 18 9,00 6 3,30 176 96,70 LP 200 32 0,5 0,5 20 10,0 6 3,33 174 96,67
0
ISA 200 25 0,5 0,5 12 12,0
0
4 4,54 84 95,45
Trung bình: 10,33 3,72 96,28 Ngày thứ 2 sau điều trị đã không còn gà chết, gà nhanh nhẹn, ăn nhiều, không có hiện tượng xệ cánh hay vẹo cổ, các triệu chứng giảm. Ngày 3 sau điều trị lần 1, tiêm chế phẩm điều trị liều 2 (0,5ml/con) theo dõi trong 10 ngày thấy đàn gà khỏe mạnh, ăn uống bình thường. Sau khi điều trị tỉ lệ gà khỏi bệnh là 96,28%. Nên chế phẩm kháng thể có tác dụng điều trị bệnh.
3.8.2. Ứng dụng kháng thể thụ động thăm dò bệnh trong khu vực dịch bệnh.
Trong khu vực dịch bệnh trên, cùng với việc sử dụng chế phẩm kháng thể để điều trị bệnh chúng tôi tiến hành thăm dò phòng bệnh cúm A/H5N1 cho các đàn gà nằm trong khu vực dịch bệnh bằng chế phẩm kháng thể. Liệu trình phòng 2 đợt và cách nhau 10 ngày, khi gà được 20 ngày tuổi và 30 ngày tuổi, liều phòng là 5ml/con/lần. Kết quả được trình bày ở Bảng 12
Bảng 12: Kết quả thăm dò bệnh trong khu vực dịch bệnh.
Địa điểm Giống gà Số Gà (con) Liều chế phẩm (ml)
Ngày tuổi Theo dõi 15 ngày sau khi tiêm
lần 2 Lần 1 Lần 2 Chết Sống n % n % Đa Tốn TH 100 1,0 20 30 - - 100 100 LP 100 1,0 20 30 - - 100 100 ASI 100 1,0 20 30 1 1,00 99 99,00
Gốt TH 100 1,0 20 30 1 1,00 99 99,00 LP 100 1,0 20 30 1 1,00 99 99,00 ASI 100 1,0 20 30 2 2,00 98 98,00 Minh Tân TH 100 1,0 20 30 1 1,00 99 99,00 LP 100 1,0 20 30 2 2,00 98 98,00 ASI 100 1,0 20 30 3 3,00 97 97,00
Qua bảng 13 cho thấy sau khi tiêm chế phẩm kháng thể cho những đàn gà của các gia đình gần với đàn gà bị bệnh của gia đình khác ta thấy đàn gà ăn uống bình thường, khỏe mạnh, tăng trọng nhanh, tỉ lệ chết chiếm rất nhỏ chỉ từ 1% - 3%. Mặc dù trong khu vực đó vào thời gian thử nghiệm vẫn có dịch bệnh xảy ra. Như vậy bước đầu thử nghiệm kháng thể có đã có khả năng phòng bệnh cúm A/H5N1.
Qua hai đợt điều trị với tổng đàn gà 1500 con gà ở 3 giống gà khác nhau là Lương Phượng, Tam Hoàng và ISA ở 3 địa phương khác nhau là : Đa Tốn – Gia Lâm – Hà Nội, Gốt – Chương Mỹ - Hà Nội, Minh Tân – Vụ Bản – Nam Định chế phẩm tỏ ra có hiệu lực phòng trị bệnh tốt.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận.
Từ kết quả thu được trong quá trình nghiên cứu chúng tôi rút ra những kết luận sau:
Đàn gà được gây miễn dịch cơ sở bằng vacxin cúm A/H5N1 vô hoạt nhũ dầu có đáp ứng miễn dịch tốt, hàm lượng kháng thể trong máu cao.
Giữa lượng kháng thể trong máu và trong lòng đỏ trứng có sẹ tương quan chặt chẽ đồng biến, lượng kháng thể trong máu cao thì trong lòng đỏ trứng cũng cao với hệ số tương quan đạt 0,921.
Đã chế tạo được chế phẩm gây miễn dịch với kháng nguyên là virus cúm gia cầm A/H5N1chủng NIBRG - 14, chế phẩm này đạt các chỉ tiêu về độ thuần khiết, độ an toàn, độ vô trùng cũng như hiệu lực của nó.
Sử dụng chế phẩm dạng nhũ dầu có đáp ứng miễn dịch tốt cho cả gà và thỏ. Nghiên cứu, hoàn thiện quy trình sản xuất kháng thể, các chỉ tiêu chất lượng đảm bảo đúng tiêu chuẩn về độ vô trùng, độ thuần khiết, độ an toàn và hiệu lực của nó.
Sử dụng kháng thể kháng virus cúm A/H5N1 với liều trình như sau:
Tiêm 2 đợt, mỗi đợt cách nhau 10 ngày. Tiêm lần 1 cho gà ở tuổi ngày 20, lần 2 với gà 30 ngày tuổi với liều 1ml/con/lần.
Qua thời gian nghiên cứu chúng tôi thấy chế phẩm kháng thể thụ động kháng virus cúm gia cầm A/H5N1 có tác dụng phòng trị bệnh. Vì vậy chúng tôi đề nghị kiểm nghiệm chế phẩm để sử dụng rộng rãi cho chăn nuôi gia cầm đặc biệt là những đàn gia cầm có số lượng lớn như gà, vịt… nhằm phòng trị bệnh cúm A/H5N1giảm rủi ro cho người chăn nuôi.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt.
[33].GS.TSKH. Phan Thanh Phượng – TS. Phạm Công Hoạt, PGS.TS.
Trương Văn Dung – TS. Vũ Dũng Tiến, Miễn dịch học thú y và ứng dụng, Nhà
xuất bản nông nghiệp, 2007.
[1]. Bùi Quang Anh, Văn Đăng Kỳ, Bệnh cúm gia cầm: Lưu hành bệnh, chẩn
đoán và kiểm soát dịch bệnh, Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XI, số 3, 2004, 69 - 75.
[2]. Trần Hữu Cổn, Bùi Quang Anh, Bệnh cúm ở gia cầm và biện pháp phòng
chống, NXB Nông Nghiệp - Hà Nội, 2004, 8 - 33.
[3]. Ban chỉ đạo quốc gia phòng chống dịch cúm gia cầm, Sổ tay giám sát bệnh
cúm gia cầm, NXB Nông Nghiệp - Hà Nội, 2007, 11 - 12.
[4]. Bùi Bá Bổng, Bùi Quang Anh, Trần Kim Anh, Lê Văn Bầm, Trương Văn Dung, Phạm Văn Đông, Đậu Ngọc Hào, Văn Đăng Kỳ, Hoàng Văn Năm, Lê Thị
Kim Oanh, Nguyễn Thanh Sơn, Cẩm nang phòng chống bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao (H5N1), NXB Nông Nghiệp - Hà Nội, 2007, 5 - 9, 25 - 30.
[5]. Trương Văn Dung, Những kết quả đã đạt được về bệnh cúm gia cầm ở Việt
Nam, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XV, số 4, 2008, 5 - 8.
[6]. Nguyễn Tiến Dũng, Vài nét về virus cúm gia cầm H5N1, Tạp chí khoa học
kỹ thuật Thú y, Tập XV, số 4, 2008, 80 - 86.
[7]. Marie Edan, Thomas Delquigny, Hoàng Hải Hóa, Patrice Gautier, Điều tra
dịch tễ, NXB Nông Nghiệp - Hà Nội, 2007, 18.
[8]. Marie Edan , Thomas Delquigny, Hoàng Hải Hóa, Patrice Gautier, Chẩn
đoán cúm gia cầm, NXB Nông Nghiệp - Hà Nội, 2007, 8 - 21, 27 - 28.
[9]. Trần Xuân Hạnh, Một vài vấn đề phòng bệnh virus cúm gia cầm bằng
vaccine, Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XI, số 3, 2004, 84 - 85.
[10]. Trần Thị Hoài, Thông tin chăn nuôi - thú y - Hội chăn nuôi Thừa Thiên
Huế, 2003, 30 - 31.
[11]. Văn Đăng Kỳ, Diễn biến tình hình dịch cúm gia cầm ở Việt Nam và những
giải pháp phòng chống, Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XV, số 4, 2008, 87 - 89.
[12]. Lê Văn Năm, Kết quả khảo sát các biểu hiện lâm sàng và bệnh tích đại thể
bệnh cúm gia cầm ở một số cơ sở chăn nuôi các tỉnh phía Bắc, Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XI, số 3, 2004, 87 - 89.
[13]. Phạm Hồng Sơn, Nghiên cứu tạo kháng nguyên ngưng kết hồng cầu gián
tiếp gắn virus cúm A và vận dụng mới trong chẩn đoán bệnh cúm ở gia cầm, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XVI, số 2, 2009, 12 - 22.
[14]. Tô Long Thành, Miễn dịch chống virus, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XVI, số 2, 2009, 77 - 89.
[15]. Tô Long Thành, Các loại vaccine cúm gia cầm và đánh giá hiệu quả tiêm
phòng, Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XIV, số 2, 2007, 84 - 90.
[16]. Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài, Nguyễn Văn Tó, Bệnh cúm H5N1 ở gà và
chim, NXB Lao động, Hà Nội, 2006.
[17]. Tin khoa học kỹ thuật về cúm gia cầm, Tại sao virus cúm có tính lây nhiễm
cao hơn ở nhiệt độ lạnh mùa đông?, Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XV, số 4, 2008, 92 - 93.
[18]. Trung tâm chẩn đoán thú y trung ương, Các phương pháp chẩn đoán, xét
nghiệm bệnh cúm gia cầm, NXB Nông Nghiệp - Hà Nội, 2004, 5, 33 - 38.
[19]. Trung tâm chẩn đoán thú y trung ương, Tài liệu giám sát bệnh cúm gia
cầm, NXB Nông Nghiệp - Hà Nội, 2004, 5 - 7.
Các trang web tiếng việt
[20]. Cục thú y, 2009. Báo cáo dịch cúm gia cầm và các biện pháp phòng dịch.
http://www.cucthuy.gov.vn .
[21]. Cục thú y, 2005, Quy trình chẩn đoán bệnh cúm gia cầm.
http://www.cucthuy.gov.vn.
[22].http://www.benhcum.com/kien-thuc-ve-benh-cum/240-benh-cum-gia-cam- h5n1.htm/.
[23]. Nguyễn Quốc Bình, Vũ Thủy Tiên, Thông tin chung và hướng giải pháp về
TrungtmcngnghsinhhcThnhPhHChMinh_htm.zip - ZIP archive, unpacked size 12,681 bytes
[24]. Le Thanh Hoa*, Dinh Duy Khang, Phan Văn Chi, Nong Van Hai, Truong