để xác ựịnh các begomovirus gây hại trên các mẫu cà chua mà chúng tôi thu thập ựược và các mẫu sẵn có, một loạt phản ứng PCR dựa trên các mồi chung và mồi ựặc hiệu ựã ựược thực hiện. Tổng số mẫu thử gồm 42 mẫu, phần lớn biểu hiện triệu chứng xoăn vàng lá ựược thu thập từ 15 tỉnh thành trong cả nước. Trình tự và vai trò các mồi ựược thể hiện ở bảng 3.11. Các virus thử nghiệm bao gồm:
1. Begomovirus. Tất cả các begomovirus có thể có mặt trong mẫụ 2. Tomato leaf curl Hainan virus (ToLCHnV). ToLCHnV là một virus mới phát hiện gần ựây tại Việt Nam (Hà Viết Cường et al., 2011)
3. Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV). ToLCVV là một begomovirus ựược phát hiện ựầu tiên trên cà chua Việt Nam (Green et al., 2001).
4. Tomato yellow leaf curl Kanchanabury virus (TYLCKaV). TYLCKaV là một virus khá phổ biến trên cà chua và cây họ cà tại miền Nam Việt Nam (Hà Viết Cương ét al., 2008)
5. VNP93. Một begomovirus chưa ựịnh danh, mới ựược phân lập trên cà chua và ớt tại đà Nẵng năm 2012.
Bảng 3.11. Các mồi chung và mồi ựặc hiệu phát hiện begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua
TT Mồi Trình tự Virus phát hiện
1 ToLCHnV-F1 TCAGTTATTCGTGCTAAGGAC
2 ToLCHnV-R2 CAACGCCAAGAAAGCAACG
Tomato leaf curl Hainan virus (ToLCHnV)
To-F4 CGTTTTCAAGTTCTTCGTCGA
2
To-R4 AAAACAGGCCCTTCCTATCG
Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV)
TYKa-A-F1 CCTTTTCCAGAGAGTTTGCAC
3
TYKa-A-R1 GATGCTGAGAAACGATGAAGC
Tomato yellow leaf curl Kanchanabury virus (TYLCKaV) VNP93-A-F CATGCTAGTAATCCAGTGTATGC 4 VNP93-A-R ATCTGCCAACGACGCATATGC VNP93, một begomovirus chưa ựịnh danh (phân lập từ cà chua/ớt tại đà Nẵng)
BegoAFor1 TGYGARGGiCCiTGYAARGTYCARTC
5
BegoARev1 ATHCCMDCHATCKTBCTiTGCAATCC
Phát hiện Begomovirus
3.4.3.1 Kết quả kiểm tra PCR xác ựịnh các begomovirus gây hại cà chua bằng cặp mồi chung
để phát hiện các begomovirus trên cà chua, chúng tôi sử dụng cặp mồi chung BegoAFor1/BegoARev1. Cặp mồi này rất hiệu quả và cho phép phát hiện DNA-A của tất cả các begomovirus. Kết quả kiểm tra ựược thể hiện ở Bảng 3.12, hình 3.9, hình 3.10
Kết quả kiểm tra PCR cho thấy có tới 31/42 (73.8%) mẫu thử có phản ứng dương tắnh chứng tỏ nhiễm begomovirus. đáng chú ý các mẫu âm tắnh ựều không biểu hiện triệu chứng bệnh xoăn vàng lá ựặc trưng.
Bảng 3.12. Kết quả kiểm tra PCR phát hiện begomovirus bằng cặp mồi ccung BegoAFor1/BegoARev1 trên các mẫu cà chua
STT Mẫu Triệu chứng
địa ựiểm
(huyện) địa ựiểm (Tỉnh) Begomovirus
1 VNP1 Khảm, cuốn lá Gia Lâm Hà Nội +
2 VNP2 Khảm, cuốn lá Gia Lâm Hà Nội +
3 VNP28 Xoăn vàng lá Lạng Giang Bắc Giang +
4 VNP51 Khảm lá? Nam Sách Hải Dương -
5 VNP55 Khảm lá? đoan Hùng Phú Thọ + (mờ)
6 VNP71 Khảm lá? Bình Lục Hà Nam -
7 VNP97 Xoăn vàng lá Hòa Vang đà Nẵng +
8 VNP106 Xoăn vàng lá Hòa Vang đà Nẵng +
9 VNP164 Xoăn vàng lá đắc Pơ Gia Lai +
10 VNP165 Xoăn vàng lá đắc Pơ Gia Lai +
11 VNP254 Xoăn vàng lá đắc Pơ Phú Thọ +
12 VNP262 Khảm vàng đoan Hùng Phú Thọ +
13 VNP263 Xoăn vàng lá đoan Hùng Phú Thọ +
14 VNP274 Xoăn vàng lá Phổ Yên Thái Nguyên +
15 VNP275 Xoăn vàng lá Phổ Yên Thái Nguyên +
16 VNP286 Xoăn vàng lá Vĩnh Tường Vĩnh Phúc +
17 VNP298 Xoăn vàng lá Sóc Sơn Hà Nội +
18 VNP339 Biến vàng (tospovirus?) Nam Sách Hải Dương - 19 VNP342 Biến vàng (tospovirus?) Nam Sách Hải Dương - 20 VNP346 ựốm thân, ựen gân (tospovirus?) Nam Sách Hải Dương -
21 VNP356 Xoăn vàng lá Nam Sách Hải Dương +
22 VNP357 Xoăn vàng lá Nam Sách Hải Dương +
23 VNP358 Xoăn vàng lá Nam Sách Hải Dương -
24 VNP359
Xoăn vàng lá
(nhẹ) Nam Sách Hải Dương + (mờ)
25 VNP360 Khảm Nam Sách Hải Dương -
26 VNP361 Xoăn vàng lá Nam Sách Hải Dương +
28 VNP519 ựốm thân, ựen gân (tospovirus?) Tp Cao Bằng Cao Bằng - 29 VNP522 Xoăn vàng lá Tp Cao Bằng Cao Bằng + 30 VNP529 Xoăn vàng lá Tp Cao Bằng Cao Bằng +
31 VNP575 Xoăn vàng lá Phổ Yên Thái Nguyên +
32 VNP576 ựốm thân, ựen gân (tospovirus?) Phổ Yên Thái Nguyên + 33 VNP584 ựốm thân, ựen gân (tospovirus?) TP. Lào Cai Lào Cai -
34 VNP585 Xoăn vàng lá TP. Lào Cai Lào Cai +
35 VNP611
Xoăn vàng lá, ựốm thân
(tospovirrus?) Hải Hậu Nam định +
36 VNP612 Xoăn vàng lá Hải Hậu Nam định +
37 VNP616 Xoăn vàng lá Lý nhân Hà Nam +
38 VNP617 Xoăn vàng lá Lý nhân Hà Nam +
39 VNP777 Xoăn vàng lá Hoài đức Hà Nội +
40 TVN4 Xoăn vàng lá đức Trọng Lâm đồng +
41 TVN11 Xoăn vàng lá đơn Dương Lâm đồng +
42 TVN41 Xoăn vàng lá Châu Thành Trà Vinh +
Số mẫu (+) 33
Tỷ lệ
31/42 (78,6%)
Hình 3.9: Chiết DNA và thực hiện phản ứng PCR phát hiện begomovirus trên cà chua
Hình 3.10: Kiểm tra PCR phát hiện các begomovirus từ mẫu cà chua bằng cặp mồi chung BegoAfor1/BegoARev1.
3.4.3.2 Kết quả kiểm tra PCR phát hiện Tomato leaf curl Hainan virus (ToLCHnV) băng mồi ựặc hiệụ
Tomato leaf curl Hainan virus (ToLCHnV) là một begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cag chua mới ựược xác ựịnh từ ựảo Hải Nam (Trung Quốc năm 2010). Năm 2011, virus này cũng ựược phát hiện tại miền Bắc Việt Nam. (Hà Viết Cường et al., 2011). Các nghiên cứu sơ bộ cho thấy virus tạo triệu chứng rất ựiển hình. để xác ựịnh mức ựộ phổ biến của virus ToLCHnV, chúng tôi ựã thiết kế một cặp mồi ựặc hiệu dựa trên trình tự bộ gen của virus nàyvới ký hiệu là ToLCHnVFor1 vàToLCHnVRev2.
Kiểm tra PCR bằng cặp mồi chung ở trên ựã xác ựịnh ựược 31 mẫu cà chua nhiễm begomovirus. Tất cả 31 mẫu này ựã ựược kiểm tra sự có mặt của ToLCHnV bằng PCR dùng mồi ựặc hiệụ Kết quả kiểm tra PCR ựược thể hiện ở bảng 3.13 và hình 3.11
Kết quả kiểm tra cho thấy tất cả 31 mẫu ựều không hình thành băng PCR ựặc hiệụ Chúng tôi khó ựánh giá kết này vì ựây là lần ựầu tiên cặp mồi
này ựược sử dụng. Mặc dù cặp mồi này có thể phát hiện ựược plasmid mang cấu trúc xâm nhiễm của virus này nhưng ựiều kiện phản ứng PCR vẫn chưa ựược tối ưụ
Bảng 3.13. Kết quả kiểm tra PCR phát hiện Tomato leaf curl Hainan virus bằng cặp mồi ựặc hiệu ToLCHnVFor1 và ToLCHnVRev2 trên các mẫu cà
chua dương tắnh với begomovirus
STT Mẫu Triệu chứng
địa ựiểm
(huyện) địa ựiểm (Tỉnh) ToLCHnV
1 VNP1 Khảm, cuốn lá Gia Lâm Hà Nội -
2 VNP2 Khảm, cuốn lá Gia Lâm Hà Nội -
3 VNP28 Xoăn vàng lá Lạng Giang Bắc Giang -
4 VNP97 Xoăn vàng lá Hòa Vang đà Nẵng -
5 VNP106 Xoăn vàng lá Hòa Vang đà Nẵng -
6 VNP164 Xoăn vàng lá đắc Pơ Gia Lai -
7 VNP165 Xoăn vàng lá đắc Pơ Gia Lai -
8 VNP254 Xoăn vàng lá đắc Pơ Gia Lai -
9 VNP262 Khảm vàng đoan Hùng Phú Thọ -
10 VNP263 Xoăn vàng lá đoan Hùng Phú Thọ -
11 VNP274 Xoăn vàng lá Phổ Yên Thái Nguyên -
12 VNP275 Xoăn vàng lá Phổ Yên Thái Nguyên -
13 VNP286 Xoăn vàng lá Vĩnh Tường Vĩnh Phúc -
14 VNP298 Xoăn vàng lá Sóc Sơn Hà Nội -
15 VNP356 Xoăn vàng lá Nam Sách Hải Dương -
16 VNP357 Xoăn vàng lá Nam Sách Hải Dương -
17 VNP359 Xoăn vàng lá
(nhẹ) Nam Sách Hải Dương -
18 VNP361 Xoăn vàng lá Nam Sách Hải Dương -
19 VNP362 Xoăn vàng lá Nam Sách Hải Dương -
20 VNP522 Xoăn vàng lá Tp Cao Bằng Cao Bằng -
21 VNP529 Xoăn vàng lá Tp Cao Bằng Cao Bằng -
22 VNP575 Xoăn vàng lá Phổ Yên Thái Nguyên -
24 VNP611
Xoăn vàng lá, ựốm thân
(tospovirrus?) Hải Hậu Nam định -
25 VNP612 Xoăn vàng lá Hải Hậu Nam định -
26 VNP616 Xoăn vàng lá Lý nhân Hà Nam -
27 VNP617 Xoăn vàng lá Lý nhân Hà Nam -
28 VNP777 Xoăn vàng lá Hoài đức Hà Nội -
29 TVN4 Xoăn vàng lá đức Trọng Lâm đồng -
30 TVN11 Xoăn vàng lá đơn Dương Lâm đồng -
31 TVN41 Xoăn vàng lá Châu Thành Trà Vinh -
Số mẫu (+) 0
Tỷ lệ 0/31 (0%)
3.4.3.3 Kết quả kiểm tra PCR phát hiện Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV) băng mồi ựặc hiệụ
Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV) là một begomovirus ựược phát hiện ựầu tiên trên cà chua Việt Nam (Green et al., 2001, Ha Viet Cuong et al., 2008). Tuy nhiên hiện vẫn chưa rõ mức ựộ phổ biến của virus này tại Việt Nam.
Một số cặp mồi ựặc hiệu ToLCVV ựã ựược thiết kế từ bộ gen của ToLCVV phân lập từ Việt Nam như To-F1/To-R1, To-F2/To-R2 To-F3/To- R3. Các nghiên cứu trước ựây sử dụng các cặp mồi này ựã cho thấy nhiều mẫu cà chua bị bệnh xoăn vàng lá có phản ứng (+) tắnh với các cặp mồi trên. Tuy nhiên giải trình tự sản phẩm PCR thu ựược cho thấy một số mẫu virus là ToLCHnV hoặc TYLCVNV chứng tỏ các mồi trên chưa ựủ ựặc hiệụ
Trong nghiên cứu này, chúng tôi ựã sử dụng một cặp mồi mới với trình tự ựược lựa chọn cẩn thận từ vùng biến ựộng của một loạt các begomovirus hại cà chua có quan hệ gần gũi với TLCVV. Cặp mồi này ựược ký hiệu là To- F4/To-R4.
PCR phát hiện ToLCVV ựã ựược thực hiện với tất cả 31 mẫu cà chua nhiễm begomovirus ựã ựược xác ựịnh ở trên. Kết quả kiểm tra PCR ựược thể hiện ở bảng 3.14 và hình 3.11.
Kết quả kiểm tra cho thấy tới 21/31 (67.7 %) mẫu thử có phản ứng PCR (+) chứng tỏ ToLCVV là begomovirus phổ biến nhất gây bệnh xoăn vàng lá cà chuạ đáng chú ý, ToLCVV phân bố khá rộng, ngoài ựồng bằng sông Hồng, virus còn ựược phát hiện thấy tại Lào Cai, Cao Bằng, thậm chắ tại Gia Lai (mẫu VNP164).
Bảng 3.14. Kết quả kiểm tra PCR phát hiện Tomato leaf curl Vietnam (ToLCVV) bằng cặp mồi ựặc hiệu To-F4 và To-R4 trên các mẫu cà chua
dương tắnh với begomovirus
STT Mẫu Triệu chứng
địa ựiểm
(huyện) địa ựiểm (Tỉnh) ToLCVV
1 VNP1 Khảm, cuốn lá Gia Lâm Hà Nội +
2 VNP2 Khảm, cuốn lá Gia Lâm Hà Nội -
3 VNP28 Xoăn vàng lá Lạng Giang Bắc Giang -
4 VNP97 Xoăn vàng lá Hòa Vang đà Nẵng -
5 VNP106 Xoăn vàng lá Hòa Vang đà Nẵng -
6 VNP164 Xoăn vàng lá đắc Pơ Gia Lai +
7 VNP165 Xoăn vàng lá đắc Pơ Gia Lai -
8 VNP254 Xoăn vàng lá đắc Pơ Gia Lai +
9 VNP262 Khảm vàng đoan Hùng Phú Thọ +
10 VNP263 Xoăn vàng lá đoan Hùng Phú Thọ +
11 VNP274 Xoăn vàng lá Phổ Yên Thái Nguyên +
12 VNP275 Xoăn vàng lá Phổ Yên Thái Nguyên +
13 VNP286 Xoăn vàng lá Vĩnh Tường Vĩnh Phúc +
14 VNP298 Xoăn vàng lá Sóc Sơn Hà Nội +
15 VNP356 Xoăn vàng lá Nam Sách Hải Dương -
16 VNP357 Xoăn vàng lá Nam Sách Hải Dương +
17 VNP359
Xoăn vàng lá
(nhẹ) Nam Sách Hải Dương
18 VNP361 Xoăn vàng lá Nam Sách Hải Dương +
19 VNP362 Xoăn vàng lá Nam Sách Hải Dương +
20 VNP522 Xoăn vàng lá Tp Cao Bằng Cao Bằng +
21 VNP529 Xoăn vàng lá Tp Cao Bằng Cao Bằng +
22 VNP575 Xoăn vàng lá Phổ Yên Thái Nguyên +
23 VNP585 Xoăn vàng lá TP. Lào Cai Lào Cai
24 VNP611
Xoăn vàng lá, ựốm thân
(tospovirrus?) Hải Hậu Nam định
+
25 VNP612 Xoăn vàng lá Hải Hậu Nam định -
26 VNP616 Xoăn vàng lá Lý nhân Hà Nam +
27 VNP617 Xoăn vàng lá Lý nhân Hà Nam +
28 VNP777 Xoăn vàng lá Hoài đức Hà Nội +
29 TVN4 Xoăn vàng lá đức Trọng Lâm đồng -
30 TVN11 Xoăn vàng lá đơn Dương Lâm đồng -
31 TVN41 Xoăn vàng lá Châu Thành Trà Vinh -
Số mẫu (+) 21
Tỷ lệ 21/31
(67.7%)
Hình 3.11: PCR phát hiện Tomato leaf curl Vietnam (ToLCVV) bằng cặp mồi ựặc hiệu To-F4 và To-R4 trên các mẫu cà chua dương tắnh với
begomovirus
3.4.3.4 Kết quả kiểm tra PCR phát hiện Tomato yellow leaf curl Kanchanabury virus (TYLCKaV) bằng mồi ựặc hiệụ
Tomato yellow leaf curl Kanchanabury virus (TYLCKaV) là một begomovirus có bộ gen kép gây bệnh xoăn vàng lá cà chua và khảm vàng cà
bát, cà pháo tại miền Nam (Ha Viêt Cuong et al., 2008). Cho tới nay, chưa có công bố nào cho thấy virus này xuất hiện ở miền Bắc.
để tìm hiệu liệu virus này có mặt tại miền Bắc không, chúng tôi ựã thiết kế một cặp mồi ựặc hiệu dựa trên trình tự bộ gen của virus nàyvới ký hiệu là TYKa-A-F1 và TYKa-A-R1.
PCR phát hiện TYLCKa ựã ựược thực hiện với tất cả 31 mẫu cà chua nhiễm begomovirus ựã ựược xác ựịnh ở trên. Kết quả kiểm tra PCR ựược thể hiện ở bảng 3.15 và Hình 3.12.
Kết quả kiểm tra cho thấy chỉ 2/31 (6.4%) mẫu có phản ứng PCR (+). Cả 2 mẫu dương này ựều là các mẫu thu tại miền Nam (VNP4 và VNP11). Cả 2 mẫu này ựã ựược xác ựịnh trình tự từ trước và nhiễm TYLCKaV. Kết quả thắ nghiệm cho thấy TYLCKaV chưa xuất hiện tại miền Bắc.
Bảng 3.15. Kết quả kiểm tra PCR phát hiện Tomato yellow leaf curl Kanchanabury virus (TYLCKaV) bằng cặp mồi ựặc hiệu TYKa-A-F1 và
TYKa-A-R1 trên các mẫu cà chua dương tắnh với begomovirus
STT Mẫu Triệu chứng
địa ựiểm
(huyện) địa ựiểm (Tỉnh) TYLCKaV
1 VNP1 Khảm, cuốn lá Gia Lâm Hà Nội -
2 VNP2 Khảm, cuốn lá Gia Lâm Hà Nội -
3 VNP28 Xoăn vàng lá Lạng Giang Bắc Giang -
4 VNP97 Xoăn vàng lá Hòa Vang đà Nẵng -
5 VNP106 Xoăn vàng lá Hòa Vang đà Nẵng -
6 VNP164 Xoăn vàng lá đắc Pơ Gia Lai -
7 VNP165 Xoăn vàng lá đắc Pơ Gia Lai -
8 VNP254 Xoăn vàng lá đắc Pơ Gia Lai -
9 VNP262 Khảm vàng đoan Hùng Phú Thọ -
10 VNP263 Xoăn vàng lá đoan Hùng Phú Thọ -
11 VNP274 Xoăn vàng lá Phổ Yên Thái Nguyên - 12 VNP275 Xoăn vàng lá Phổ Yên Thái Nguyên - 13 VNP286 Xoăn vàng lá Vĩnh Tường Vĩnh Phúc -
14 VNP298 Xoăn vàng lá Sóc Sơn Hà Nội - 15 VNP356 Xoăn vàng lá Nam Sách Hải Dương - 16 VNP357 Xoăn vàng lá Nam Sách Hải Dương -
17 VNP359
Xoăn vàng lá
(nhẹ) Nam Sách Hải Dương -
18 VNP361 Xoăn vàng lá Nam Sách Hải Dương - 19 VNP362 Xoăn vàng lá Nam Sách Hải Dương - 20 VNP522 Xoăn vàng lá Tp Cao Bằng Cao Bằng - 21 VNP529 Xoăn vàng lá Tp Cao Bằng Cao Bằng - 22 VNP575 Xoăn vàng lá Phổ Yên Thái Nguyên - 23 VNP585 Xoăn vàng lá TP. Lào Cai Lào Cai -
24 VNP611
Xoăn vàng lá, ựốm thân
(tospovirrus?) Hải Hậu Nam định -
25 VNP612 Xoăn vàng lá Hải Hậu Nam định -
26 VNP616 Xoăn vàng lá Lý nhân Hà Nam -
27 VNP617 Xoăn vàng lá Lý nhân Hà Nam -
28 VNP777 Xoăn vàng lá Hoài đức Hà Nội -
29 TVN4 Xoăn vàng lá đức Trọng Lâm đồng +
30 TVN11 Xoăn vàng lá đơn Dương Lâm đồng +
31 TVN41 Xoăn vàng lá Châu Thành Trà Vinh -
Số mẫu (+) 6
Tỷ lệ 2/31 (6.4
%)
Hình 3.12: PCR phát hiện Tomato yellow leaf curl Kanchanabury virus (TYLCKaV) bằng cặp mồi ựặc hiệu TYKa-A-F1 và TYKa-A-R1 trên các
3.4.3.5 Kết quả kiểm tra PCR phát hiện một begomovirus mới phân lập từ ớt và cà chua miền Trung bằng mồi ựặc hiệụ
Trong năm 2012, Trung tâm nghiên cứu Bệnh cây nhiệt ựới ựã phát hiện thấy một begomovirus mới phân lập từ cây ớt và cà chua biểu hiện bệnh xoăn vàng lá tại đà Nẵng (mẫu VNP93). Giải trình tự khoảng 1/3 bộ gen của mẫu virus này cho thấy virus giống 96% với Pepper leaf curl virus (PepLCV). Do trình tự toàn bộ bộ gen của virus chưa sẵn có nên chúng tôi tạm ựặt tên mẫu virus này là VNP93.
Do virus này cũng ựã ựược phát hiện thấy trên cà chua tại đà Nẵng nên ựể tìm hiệu liệu virus này có mặt tại miền Bắc không, chúng tôi ựã thiết kế một cặp mồi ựặc hiệu virus VNP93 dựa trên trình tự ựoạn gen ựã ựược giải với ký hiệu là VNP93-A-F và VNP93-A-R.
PCR phát hiện virus VNP93 ựã ựược thực hiện với tất cả 31 mẫu cà chua nhiễm begomovirus ựã ựược xác ựịnh ở trên. Kết quả kiểm tra PCR