Sử dụng kắt ELISA thương mại do viện DSMZ (đức) cung cấp. Kỹ thuật ELISA là TAS-ELISA (Triple Antibody Sandwich ỜELISA). Qui trình ựược thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất như sau:
Bước 1: Cố ựịnh kháng thể ựa dòng ựặc hiệu virus (IgG) vào bản. Hòa IgG trong ựệm Carbonate 0,05M pH 9,6 với tỷ lệ 1:1000 (hướng dẫn của nhà sản xuất). Nhỏ vào bản ELISA với lượng 100 ộl/giếng. Sau ựó ựể bản ELISA vào hộp ẩm và ủ 2-4 giờ ở 37 o C. Rửa bản 3x bằng ựệm PBST.
Bước 2. Khóa bản ELISA bằng ựệm sữa tách béo 2 % hòa trong ựệm PBST. Ủ 37 oC 30 phút. Rửa bản 3x bằng ựệm PBST.
Bước 3: Cố ựịnh dịch câỵ Nghiền mẫu cây ựệm (PBST-PVP) theo tỷ lệ 1 g lá/ 5 mL ựêm. Nhỏ dich cây vào bản và ủ qua ựêm ở 4 oC. Rửa bản 3x bằng ựệm PBST.
Bước 5. Cố ựịnh kháng thể ựơn dòng ựặc hiệu virus. Hòa kháng thể ựơn dòng trong ựệm PBST-PVP-Ovalbumin theo tỷ lệ 1:1000 (hướng dẫn của nhà
sản xuất). Nhỏ vào bản ELISA với lượng 100 ộl/giếng. Ủ bản ELISA ở 37ỨC 2-4 giờ. Rửa bản ELISA với ựệm PBST 3 lần.
Bước 6: Cố ựịnh kháng thể ựặc hiệu kháng thể liên kết AP. Hòa kháng thể liên kết AP trong ựệm ựặc PBST-PVP-Ovalbumin theo tỷ lệ 1:1000 (hươnga dẫn của nhà sản xuất). Ủ bản ELISA ở 37ỨC 2-4 giờ. Rửa bản ELISA với ựệm PBST 3 lần.
Bước 7: Cố ựịnh chất nền và ựánh giá kết quả: Pha 0,5 mg NPP (p - nitrophenyl phosphate)/1ml ựệm substratẹ Ngay lập tức, nhỏ dung dịch trên vào bản ELISA, nhỏ 100 ộl/giếng. đưa bản ELISA vào hộp ẩm và ựể trong bóng tối ở ựiều kiện nhiệt ựộ phòng thắ nghiệm với thời gian từ 60 - 90 phút.
Bước 8: đọc kết quả: Các giếng có màu vàng là các giếng có phản ứng (+) tức là cây nhiễm bệnh. Giếng không màu là cây không bị nhiễm bệnh. đọc kết quả tiếp bằng cách ựưa vào máy ựọc ELISA ở bước sóng 405 nm. Dừng phản ứng bằng NaOH 3M với lượng 50 ộl/giếng.