- Ảnh hưởng của các ligand khác nhau
D-tryptophan methyl ester là một chất ức chế α -Chymotrypsin, được cặp đôi với Sepharose (hình 14). Khi chất ức chế được gắn trực tiếp lên Sepharose, thì enzym sẽ không thể dung giải hoàn toàn và đạt yêu cầu (hình 14B). Tuy nhiên, enzym sẽ được hấp phụ mạnh nếu có một chuỗi 6-cacbon (α -amino caproic acid) xen giữa matrix Sepharose và chất ức chế (hình 14C). Điều này cho thấy ảnh hưởng rõ rệt của sự khác nhau về cấu hình không gian. Khi chất ức chế được gắn quá gần với gel hỗ trợ, sự hấp phụ sẽ kém. Tầm quan trọng về ái lực đặc hiệu cho vị trí liên kết với enzym được minh họa bằng sự vắng mặt của chất hấp phụ DFP-treated- α -Chymotrypsin (hình 14D). Kết quả cho hoạt tính enzym giảm mạnh.
Hình 14: Sắc ký ái lực α -chymotrypsin trên cột Sepharose có gắn chất ức chế. Cột (0.5 x 5cm) được cân bằng trong dung dịch đệm tris-Cl 0.05 M, pH8. Mỗi mẫu (2.5 mg) được chạy trong 0.5 ml dung dịch đệm trên. 1 ml mỗi phân đoạn được thu nhận, vận tốc chảy khoảng 40 ml/h, các thí nghiệm được tiến hành ở nhiệt độ phòng. α -chymotrypsin được rửa giải bằng acid acetic 0.1 M, pH3. Các Peak trước dấu mũi tên trong hình B, C, D là không có hoạt tính enzym.
Sử dụng các chất hấp phụ ái lực khác nhau để loại bỏ/tinh sạch serine protease, kết quả cho thấy sự tăng liên kết đặc hiệu với serine (hình 15).
Trong đó, control gel là một matrix rắn ưa nước, có chứa nhóm hydroxyl. Modified gel là gel ưa nước trên gắn thêm các nhóm phosphorous hữu cơ.
Chúng có dạng: Matrix – O – POF – OR
Trong đó, O là oxygen, P là phosphorous, F là fluoride, và R là một nhóm alkyl. Matrix có thể là bất cứ polymer nào có nhóm OH-, như agarose, dextran cellulose, hydroxyappetite hoặc các polyacrilamide thay thế.
Hình 15: Ảnh hưởng của các loại matrix khác nhau lên khả năng liên kết với protease
- Ảnh hưởng của vị trí liên kết ligand lên matrix:
Tinh sạch enzym protease thủy phân insulin (ISP – Insulin Specific Protease) phân lập từ tế bào xương của chuột, sử dụng sắc ký ái lực trên agarose được liên kết với insulin:
Insulin nếu liên kết với agarose ở gốc phenylalanin sẽ là một cơ chất cho enzym và bị enzym thủy phân, trong khi nếu insulin gắn với agarose ở gốc lysine không bị enzym thủy phân. Do đó, chỉ có agarose liên kết với insulin tại vị trí đầu NH2
của phenylalanin trên chuỗi B mới được dùng để tính sạch, còn insulin liên kết với agarose ở gốc lysine B-29 thì không.
Tổng hợp Insulin-agarose theo 3 cách:
Cách 1 và 2: Hoạt hóa trước agarose với cyanogen bromide. Sau đó cho phản ứng với insulin ở 2 điều kiện khác nhau: dd đệm NaHCO3 0.2M ở pH 9 hoặc natri citrate 0.2M ở pH 5. Ở điều kiện acid, đầu N của phenylalanin của chuỗi B của insulin sẽ liên kết với agarose. Ở điều kiện base, phản ứng sẽ diễn ra với gốc lysine ở vị trí 29 của chuỗi B.
Cách 3: Insulin được diacetyl hóa cho phản ứng với agarose đã hoạt hóa ở pH 9. Ba loai insulin-agarose thu được đem ủ với ISP trong dung dịch đệm borate 0.13M (pH 7.5), ở 37oC trong những khoảng thời gian nhất định. ISP sử dụng đã được tinh sạch một phần bằng phương pháp tách phân đoạn với ammonium sulfate.
Dùng N-ethylmaleimide 0.1mM để dừng phản ứng. Kết quả phân tích cho thấy mức độ liên kết với enzym ISP se khác nhau, thể hiện qua lượng cơ chất bị enzym thuỷ phân (bảng 6).
Bảng 6: Sự thủy phân insulin lợn và những dẫn xuất insulin-agarose khác nhau bằng ISP
- Ảnh hưởng của nồng độ ligand lên số ligand được liên kết:
Tinh sạch α -Chymotrypsin bằng Sepharose có gắn D-tryptophan methyl ester. Ta thấy, D-tryptophan methyl ester là một chất ức chế tương đối yếu, nhưng kết quả α -Chymotrypsin được giữ lại trong cột khá đáng kể. Như vậy, hằng số ái lực mạnh không phải là yêu cầu thiết yếu cho kĩ thuật này. Hằng số ái lực tương đối yếu của α -Chymotrypsin với D-tryptophan methyl ester được hỗ trợ bởi số lượng lớn chất ức chế gắn lên Sepharose.
Có khoảng 6.5 µ mol hợp chất gắn trên 1ml Sepharose trong quá trình cặp đôi, và có khoảng 10µ mol/1ml cột, dùng chất ức chế với một nồng độ thích hợp khoảng 10mM. Quá trình cặp đôi diễn ra trong đệm NaHCO3 0.1M, pH 9.0.
Số ligand được cặp đôi lên matrix phụ thuộc nhiều vào nồng độ của nó lúc tiến hành quá trình liên kết. Hình 16 minh hoạ ảnh hưởng của nồng độ protein lên số protein được cặp đôi lên 2ml CNBr-activated Sepharose 4B trong NaHCO3, dung dịch NaCl, pH 8.
Hình 16: Hiệu suất gắn n-butanol ligand lên aminopropyl silica matrix
Khi sử dụng n-butanol 10%hiệu suất gắn là 99.96 % cao hơn những nồng độ n- butanol khác như hình 3.