Sự hoạt hoá matrix chứa hydroxyl bằng N-hydroxysuccinimide ester (NHS) có thể được tiến hành bằng cách sử dụng N,N’-disuccinimidyl carbonate trong một môi trường không có nuớc. Hoạt hoá bằng NHS là một phương pháp khá đơn giản và có thể dễ dàng thực hiện trong phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, hai loại matrix agarose có liên kết ngang được hoạt hoá bằng NHS (Affi-gel 10 và Affi- gel 15) có sẵn chế phẩm thưong mại (Bio-Rad, Hercules, CA). Affi-gel 10 chứa spacer không tích điện và được khuyến cáo dùng để liên kết với những protein base hoặc gần trung tính, với pI khoảng 6.5 – 11. Affi-gel 15 chứa spacer arm có nitrogen tích điện dương, nên thích hợp cho liên kết với protein acid.
Liên kết của ligand với matrix được hoạt hoá bằng NHS có thể tiến hành trong cả môit trưòng nuớc và môi trường không có nứoc. Sự lựa chọn tuỳ thuộc vào khả năng hoà tan của ligand. Đối với protein hoặc các phân tử sinh học, một hệ nuớc thì thích hợp hơn, vì chúng có xu hướng biến tính trong môi truờng không có nứoc. Liên kết ligand có chứa amine cơ bản với matrix hoạt hoá bằng NHS cần những nhóm amine cơ bản không tích điện, và do đó việc liên kết được tiến hành ở pH 7.5 -8. Để ưu tiên cho liên kết xảy ra, matrix hoạt hoá đựoc mang từ dung
môi hữu cơ sang một hệ nuớc. Tại điểm này, nên thêm ligand vào ngay bởi vì matrix hoạt hoá dễ dàng bị thuỷ phân trong môi truờng có nuớc.
Phản ứng:
N,N’-disuccinimidyl carbonate phản ứng với matrix chứa hydroxyl. Matrix hoạt hoá sau đó có thể tạo liên kết amide với các amine cơ bản.
Ưu điểm:
Liên kết amide không tích điện.
Nhược điểm:
Ở pH kiềm, liên kết amide không ổn định.
* Ngoài những matrix và ligand thông dụng ở trên, trong tinh sạch protease còn sử dụng một số matrix khác với ligand tương ứng:
Ví dụ Silica matrix với ligand n-butanol.
Silica matrix:
Silicon tetrachloride (25 ml) cho phản ứng với amyl alcohol (120ml) tạo thành tetraamyl orthosilicate. Trộn hỗn hợp 24 giờ và sản phẩm thu được khi tetraamyl orthosilicate thu được bằng phương pháp chưng cất Tetraamyl orthosilicate bão hòa với ammonia trong hỗn hợp nước:methanol:isopropanol (1:2:6), khuấy 300 v/phút 24 giờ . Silica thu được rửa với nước cất và methanol, đem sấy 1500C 24 giờ. Kích thước và hình dạng silica matrix dùng máy Scaning electron microscope (SEM).
Huyền phù Silica matrix (4g) trong aceton khô (150 ml) tạo thành silanized với 3- aminopropyl triethoxysilane dưới áp suất khí quyển. Khuấy trộn cho phản ứng trong 16 giờ . Cho huyền phù Silica lần nữa trong aceton khô và rửa bằng phương pháp trích ly Soxhlet với methanol, aceton, và diethylether. Quá trình trích ly ngừng khi không có phản ứng silane với 0.5 % ninhydrin (cho ninhydrin vào dung dịch màu không thay đổi sau 30-60 phút). Thu nhận Aminopropyl silica matrix và rửa, làm khô. Một số nhóm amino bao bọc ngòai silica matrix được phá vỡ bằng HCl.
Hình 11: Mẫu silica nhân tạo quang sát trên máy scanning electron microscope (SEM) , đường kính (a) 12 µm,(b) 5µm, (c) 14 µm
Gắn n-butanol ligand lên aminopropyl silica matrix:
Aminopropyl silica matrix (0.15 g) phản ứng với n-butanol 10% (10 ml) và EDC (0.02 g) trong dung dịch đệm MES pH 4.78( 15ml), lắc 170 v/phút trong 90 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó đem lọc. Gel nhận được rửa với nước, NaCl 1N, và nước. Dùng NaOH 0.05 N để phá vỡ ligand không liên kết nổi lên trên.