*Nguyên lý
Blocking ELISA dựa trên nguyên lý cạnh tranh vị trí kết hợp với kháng nguyên. Trường hợp trong mẫu huyết thanh chẩn đoán không có kháng thể
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21 đặc hiệu kháng PCV2, kháng thể chuẩn kháng PCV2 gắn enzyme sẽ kết hợp được với kháng nguyên. Trường hợp trong mẫu huyết thanh chẩn đoán có kháng thể đặc hiệu, kháng thể này sẽ kết hợp với kháng nguyên PCV2 phủ đĩa, do đó một phần hoặc toàn bộ epitop sẽ bị khóa (blocking).
Kết quả dương tính: có kháng thể đặc hiệu trong mẫu chẩn đoán, phản ứng sẽ không chuyển màu khi thêm cơ chất.
Kết quả âm tính: không có kháng thể đặc hiệu, phản ứng sẽ chuyển màu khi thêm cơ chất.
* Các bước thực hiện
a. Pha loãng huyết thanh: huyết thanh chẩn đoán được pha loãng 1/100 trong
dung dịch pha loãng mẫu. Để xác định hiệu giá kháng thể tiếp tục pha loãng theo cơ số 2 (1/2, 1/4 , 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128)
BƯỚC 1. Pha loãng huyết thanh 1/10 bằng dung dịch sample diluent buffer trong đĩa 96 giếng đáy chữ U:
B1.1. Chia 90 µl sample diluent buffer vào các giếng B1.2. Cho 10 µl huyết thanh/ giếng
B1.3. Vỗ nhẹ đĩa (mixing) để trộn đều
BƯỚC 2. Pha loãng huyết thanh 1/100 bằng dung dịch sample diluent buffer trong đĩa phản ứng:
B2.1. Cho đối chứng âm (-) vào giếng A1, B1: 100 µl /giếng B2.2. Cho đối chứng dương (+) vào giếng C1, D1: 100 µl /giếng B2.3. Chia 90 µl sample diluent buffer vào các giếng làm phản ứng B2.4. Cho 10 µl huyết thanh đã pha loãng 1/10 vào mỗi giếng B2.5. Vỗ nhẹ đĩa (mixing) để trộn đều
B2.6. Dán đĩa bằng tấm dán chuyên dụng
b. Ủ mẫu
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22 Rửa 4 lần, 300 µl /lần bằng dung dịch rửa (washing solution 1X)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23
c. Cho kháng thểđặc hiệu gắn enzyme
BƯỚC 1. Pha loãng conjugate (kháng thể đặc hiệu kháng PCV2 gắn enzyme)
B1.1. Tính toán lượng conjugate cần dùng
Lượng cần pha = (số giếng phản ứng + 4) x 100ul B1.2. Pha conjugate 1/100
- Dùng một ống ly tâm 15ml mớiđể pha loãng
- Dùng piptte hút chính xác conjugate diluent buffercần dùng - Bỏ đi một lượng conjugate diluent buffer bằng với lượng conjugate cần cho vào.
- Đảo đều (inverting) vài lần
- Giữ ống dung dịch đã pha trong tối (tránh ánh sáng).
BƯỚC 2. Ủ conjugate và mẫu
B2.1. Cho vào các giếng phản ứng (kể cả đối chứng âm và đối chứng dương) conjugate đã pha loãng: 100ul/giếng
B2.2. Vỗ nhẹ đĩa để trộn đều
B2.3. Ủ 37oC trong 60 phút (± 5 phút), tránh ánh sáng
B2.4. Rửa 4 lần, 300ul/lần bằng dung dịch rửa (washing solution 1X)
d. Cho cơ chất/chất màu (Buffered peroxidase substrate) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cho 100ul cơ chất/ chất màu vào mỗi giếng Để ở nhiệt độ phòng 20 phút
Lưu ý: trong trường hợp đối chứng âm chưa chuyển màu rõ, có thể để
đĩa phản ứng thêm khoảng 10 phút trong tủ ấm 37oC để tăng tốc độ phản ứng. Cần đạy đĩa để tránh bay hơi dung dịch phản ứng.
e. Dừng phản ứng
Thêm 50ul dung dịch H2SO4 2N để dừng phản ứng. Vỗ nhẹ đĩa để trộn đều. Đĩa phản ứng sau khi dừng phản ứng cần được đo ngay giá trị OD.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24
f. Đo giá trị OD, tính toán kết quả
Giá trị OD đo ở bước sóng 450nm
Phản ứng được đánh giá hợp cách nếu giá trị OD trung bình của đối chứng âm >0,800, và giá trị OD trung bình của đối chứng dương <0,500.
Tính giá trị S/N (OD giữa mẫu và đối chứng âm). Các bước tính toán được thực hiện trên phần mềm Excel cung cấp bởi nhà sản xuất.
Nếu S/N ≤ 0,5, mẫu được coi dương tính huyết thanh học. Ngược lại nếu S/N >0,5, mẫu được coi âm tính huyết thanh học.
* Một số lưu ý
- Để bộ kít cân bằng ở nhiệt độ phòng (25oC) trước khi thực hiện phản ứng. Những đĩa ELISA không làm phản ứng cần được bảo quản ở 4oC.
- Các dung dịch cần được trộn đều trước khi lấy ra thực hiện pha loãng - Không nhầm lẫn dung dịch pha loãng mẫu (sample diluent buffer) với dung dịch pha loãng conjugate (conjugate diluent buffer).
- Không dùng dung dịch rửa của những bộ kít khác để rửa đĩa - Dùng nước cất 3 lần để pha dung dịch của phản ứng.
2.4.4. Phương pháp theo dõi một số chỉ tiêu sinh trưởng, phát triển của đàn lợn con
Sau khi lợn nái ở 2 lô thí nghiệm và đối chứng đẻ, tiến hành đỡ đẻ cho lợn nái và cân khối lượng đàn lợn con lúc sơ sinh.
- Khi lợn nái sinh, ghi lại số lượng lợn con sinh ra, số lượng lợn con còn sống, số lượng lợn con bị chết sau khi lợn mẹ đẻ ở 2 lô thí nghiệm và đối chứng.
- Tiến hành cân khối lượng đàn lợn con thí nghiệm lúc sơ sinh; khi lợn cai sữa ( lợn con được 21 ngày tuổi sau khi sinh); lợn được 60 ngày tuổi; khi lợn được 90 ngày tuổi.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25 -Theo dõi tốc độ sinh trưởng của đàn lợn con ở 2 lô thí nghiệm và đối chứng từ sơ sinh – cai sữa – 60 ngày tuổi – 90 ngày tuổi.
2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phần mềm MS Excel 2007; so sánh sự sai khác giữa các yếu tố bằng phép thử χ2 (phần mềm Minitab 14.0) và phép thử Fisher Exact Test (phần mềm SAS 9.1).
Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm: - Số con mắc, tỷ lệ mắc.
-Số con chết, tỷ lệ chết
-Số con sinh ra,số con chết, tỷ lệ sống, chết, trọng lượng của đàn lợn. -Tốc độ sinh trưởng, phát triển của đàn lợn
Phương pháp xác định các chỉ tiêu đang theo dõi Tỷ lệ mắc = Số con mắc
Số con theo dõi X 100
Tỷ lệ chết =
Số con chết
Số con theo dõi X 100 *Phương pháp cân khối lượng đàn lợn: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Với đàn lợn con do mỗi lợn nái sinh ra, tiến hành cân trọng lượng của 4 lợn con trong đàn. Cân trọng lượng của 1 lợn con lớn nhất, 1 lợn con nhỏ nhất trong đàn, cân 2 lợn con có trọng lượng trung bình.
+ Cách tính khối lượng đàn lợn:
Khối lượng lợn con trung bình trong 1 đàn lợn: PTB Đàn =( Pmax + Pmin + PTB1 + PTB2)/4 (kg)
Khối lượng đàn lợn : PĐàn = PTB Đànx Số con trong đàn (kg) Khối lượng đàn lợn lô thí nghiệm:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26 Khối lượng lợn con trung bình lô thí nghiệm:
PTBTN = ∑PTN/ Số con lô thí nghiệm (kg) Khối lượng đàn lợn lô đối chứng:
∑PĐànĐC = PĐàn6+PĐàn7+PĐàn8+PĐàn9+PĐàn10 Khối lượng lợn con trung bình lô đối chứng :
PTBĐC = ∑PĐC/ Số con lô đối chứng (kg). *Cách tích tốc độ tăng trọng của đàn lợn:
Khối lượng tăng trọng của đàn lợn từ sơ sinh – cai sữa: ∆PĐàn(sơ sinh –cai sữa) = PĐàn cai sữa – PĐàn sơ sinh (kg).
Khối lượng tăng trọng trung bình của lợn con từ sơ sinh – cai sữa: ∆PTB = ∆PĐàn(sơ sinh –cai sữa)/Số con trong đàn (kg/con).
Tổng khối lượng tăng trọng của đàn lợn lô thí nghiệm: ∆PĐànTN = ∆PĐàn1+∆PĐàn2+∆PĐàn3+∆PĐàn4+∆PĐàn5 (kg)
Khối lượng tăng trọng trung bình của lợn con từ sơ sinh – cai sữa ở lô thí nghiệm:
∆PTBTN = ∆PĐàn TN(sơ sinh –cai sữa)/Số con lô thí nghiệm (kg/con). Tổng khối lượng tăng trọng của đàn lợn lô đối chứng:
∆PĐànĐC = ∆PĐàn6+∆PĐàn7+∆PĐàn8+∆PĐàn9+∆PĐàn10 (kg)
Khối lượng tăng trọng trung bình của lợn con từ sơ sinh – cai sữa ở lô đối chứng:
∆PTBĐC = ∆PĐàn ĐC(sơ sinh –cai sữa)/Số con lô đối chứng (kg/con).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Điều tra tình hình một số bệnh thường gặp ở lợn tại trại
3.1.1. Tình hình chăn nuôi của trại
3.1.1.1. Một số nét về trại lợn Thành Long – Cư Yên – Lương Sơn – Hòa Bình.
Trại Thành Long, nằm trên địa bàn xã Cư Yên – Lương Sơn – Hòa Bình. Trại được xây dựng trên một ngọn đồi, xa khu dân cư, cách đường quốc lộ 6A khoảng 7km. Trại được xây dựng năm 2002 với tổng diện tích 22.000m2. Trong đó diện tích sử dụng chăn nuôi khoảng 7000m2, diện tích vườn cây và khu xử lý nước thải khoảng 6000m2, còn lại là khu hành chính và khu nhà ở của công nhân. Hiện nay diện tích sử dụng chăn nuôi được mở rộng thêm 7000m2 nữa.
Chủ trại là bà: Nguyễn Thị Kim Anh.
Quản lý kinh doanh là ông: Phạm Hùng Triệu. Trại gồm có 20 công nhân và một nhân viên bảo vệ.
Trại được chia thành nhiều khu chuồng nuôi khác nhau bao gồm: 2 chuồng bầu ( nái mang thai), 2 chuồng đẻ, 1 chuồng cách ly, cùng với một số công trình phụ phục vụ cho chăn nuôi như: khu nhà kho chứa cám, phòng sát trùng, phòng pha tinh, khu nhà ở và nhà bếp. Xung quanh trại là hệ thống hàng rào cây cối bảo vệ, cách ly với bên ngoài nhằm mục đích hạn chế sự lây lan mầm bệnh.
Khu chuồng bầu: là khu chuồng chứa lợn đực và nái lên giống, nái đang chờ phối, nái mang thai ở giai đoạn đầu đến tuần 14 -15. Khu chuồng bầu 1 với 4 dãy chuồng, mỗi dãy 60 lồng, mỗi ô lồng chỉ chứa 1 lợn nái và được sắp xếp lần lượt theo tuần phối. Việc sắp xếp như vậy giúp người chăn nuôi quản lý và chăm sóc tốt đàn lợn của mình trong việc tiêm vacxin, điều chỉnh khẩu phần ăn, theo dõi quá trình mang thai dễ dàng. Ở đầu mỗi dãy là
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28 các ô chuồng nuôi lợn đực giống. Khu chuồng bầu 2 với 3 dãy chuồng, mỗi dãy 114 lồng, đầu mỗi dãy là các ô chuồng nuôi lợn đực giống.
Khu chuồng đẻ: là khu chuồng chứa nái mang thai đã được 14 – 15 tuần trở lên, nái đẻ và nái đang trong giai đoạn nuôi con. Khu chuồng đẻ giáp ranh với khu chuồng mang thai, chung một tường vách, khu 1 gồm 72 lồng đẻ, 20 lồng chờ đẻ; khu 2 gồm 108 lồng đẻ.
Tiếp đó đến các khu chuồng nuôi hậu bị cách chuồng đẻ 1 vườn cây rộng 20m, gồm 2 dãy với 18 ô chuồng, mỗi ô chuồng rộng 30m2. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chuồng nái chửa và chờ phối, nái đẻ, lợn cai sữa các ô chuồng được làm bằng khung thép, sàn chuồng được lắp ghép bằng các tấm sàn bê tông, đan sắt, cách nền chuồng một khoảng nhất định (khoảng 40 cm). Chuồng nuôi lợn thịt tường được xây bằng gạch, nền láng xi măng. Nền chuồng, rãnh thoát nước đều có độ dốc thích hợp, dễ vệ sinh.
Khu cách ly: đây là khu chuồng dùng để nuôi cách ly đàn hậu bị mới nhập về trại, nuôi nái sau khi cai sữa trong thời gian chờ lên phối và nái loại thải. Chuồng cách ly gồm có 5 ô chuồng, mỗi ô chuồng có thể chứa 20 nái. Khu này được đặt gần khu chuồng bầu, có lối đi thông với nhau, thuận tiện cho việc luân chuyển lợn trong quá trình phối.
Phòng pha tinh: được trang bị các dụng cụ hiện đại như: kính hiển vi, các dụng cụ đóng liều tinh, nồi hấp cách thủy dụng cụ và một số thiết bị khác.
Các khu chuồng được xây dựng theo hướng Đông – Nam, chuồng được xây dựng là chuồng kín, phía đầu chuồng là hệ thống giàn mát, cuối chuồng là hệ thống quạt hút gió, mái được căng phủ 1 lớp bạt, cách nền chuồng 2,2m, hai bên tường có hệ thống cửa sổ lắp kính, chiều rộng 1,5m, chiều cao cách mặt nền chuồng 1,2m. Trong khu chăn nuôi, đường đi lại giữa các ô chuồng, các khu khác nhau đều được đổ bê tông và ngoài các cửa các khu chuồng đều có hố sát trùng ủng trước khi vào chuồng.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29 Hệ thống máng ăn, máng uống được thiết kế rất phù hợp bao gồm: Máng ăn tự động bằng inox, nước uống được dẫn từ hệ thống lọc nước tới từng ô chuồng bằng đường ống dẫn, ở đó có lắp các van uống tự động.
Hệ thống xử lý nước thải được xây dựng ở cuối các dãy chuồng. Hệ thống xử lý nước thải được thiết kế theo mô hình hầm Bioga đảm bảo yếu tố vệ sinh môi trường.
3.1.1.2. Tình hình chăn nuôi của trại
Khi mới xây dựng năm 2002 trang trại chỉ có 60 nái sinh sản và 4 đực giống. Đến năm 2010, số nái của trại lên tới 314 con và 10 đực giống. Hiện nay, quy mô của trại là 589 nái và khoảng 7926 lợn thịt. Với mục đích cung cấp lợn con cai sữa, lợn thịt thương phẩm và lợn hậu bị hai máu cho thị trường và người chăn nuôi
Cơ cấu đàn lợn của trại.
Trại Thành Long cơ cấu đàn bao gồm: lợn nái sinh sản, lợn đực giống và lợn con theo mẹ, lợn con cai sữa, lợn thịt thương phẩm. Cụ thể cơ cấu đàn của trại được thể hiện qua bảng 3.1:
Bảng 3.1 . Cơ cấu đàn lợn của trại Thành Long. Tổng số lợn (con) Loại lợn Giống lợn Năm 2010 Năm 2011 Năm 2012 Năm 2013 Năm 2014 Đực giống Yorkshise 3 3 7 8 9 Duroc 2 0 4 5 6 Landrace 5 8 10 11 13 Nái sinh sản Landrace 194 194 250 317 327 Yorkshise 100 100 205 216 231 Duroc 0 0 0 27 31 Nái hậu bị Landrace 10 27 55 56 29 Yorkshise 10 23 45 50 23 Duroc 0 0 0 10 11
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30 Lợn con cai sữa Con lai 2 máu 6867 6844 10793 11374 13012 Lợn hậu bị Con lai 2 máu 2664 2655 4797 5063 5080
Lợn thịt Hậu bị loại 3997 3983 5785 6201 7926
( N g uồn : p h ò n g kỹ t h uật )
Qua bảng 3.1 cho thấy quy mô đàn lợn của trại ngày càng tăng, cơ cấu đàn lợn của trại gồm các giống lợn ngoại có năng suất cao trên thị trường hiện nay. Tổng đàn lợn sinh sản khoảng 589 nái sinh sản với 2 giống lợn ngoại chủ yếu là Landrace và Yorkshire, có 28 đực giống thuộc 3 giống Duroc, Yorkshire, Landrace dùng để khai thác tinh dịch cung cấp cho trại và bán cho nhân dân ở các vùng xung quanh. Như vậy cứ 1 đực giống kiêm 21 nái, thực tế ở trại tỷ lệ này tương đối phù hợp.
Hiện nay, trung bình một nái sinh sản của trại sản xuất được 2,5 lứa/năm. Tỷ lệ sơ sinh trung bình 10,1 con/nái, tỷ lệ sống sót đạt 95%, tỷ lệ lợn con cai sữa đạt 99%.
Đàn lợn con sinh ra là con lai mang 2 máu ( 1 máu của con bố và 1 máu của con mẹ). Riêng đối với đàn lợn hậu bị được nuôi từ những lợn con đẻ ra từ những lợn mẹ Landrace có những chỉ tiêu sinh sản tốt cho phối với lợn đực Landrace và mang 1 máu Landrace. Lợn con đa phần là lợn lai 2 máu của 2 giống bố mẹ dùng để nuôi thịt thương phẩm hoặc bán cai sữa cho dân. Bình quân mỗi tháng có khoảng 570 lợn con cai sữa với số lượng này được cân đối với khu chuồng cai sữa và khu thịt để có quyết định bán lợn cai sữa. Đối với đàn lợn nuôi thịt thương phẩm đa phần là những lợn lai 2 máu nên mang những đặc điểm tốt về tăng trọng, tỷ lệ nạc, khả năng chống chịu với bệnh tật,…
Phương thức chăn nuôi và công tác phòng bệnh của trại.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31 Trại được chăn nuôi theo hướng sản xuất con giống và chăn nuôi lợn thịt thương phẩm.
Chuồng trại được xây dựng theo hệ thống khép kín, việc điều chỉnh tiểu khí hậu trong chuồng là hoàn toàn tự động đảm bảo sao cho phù hợp nhất với điều kiện sinh trưởng và phát triển của đàn lợn. Hệ thống lồng chuồng, máng ăn, máng uống, độ dốc nền chuồng được thiết kế hợp lý đảm bảo điều kiện vệ sinh trong chuồng. Lợn ở các lứa tuổi được nuôi ở các khu vực riêng biệt, các khu chuồng được thiết kế lần lượt từ khu chuồng lợn chờ phối và