2.5.4.1. Khảo sát thời gian lên men.
Chuẩn bị sữa đậu nành giống mục 2.4.2 và ứng dụng kết quả các thí nghiệm trên
Theo dõi pH, đặc điểm sản phẩm theo thời gian và kết hợp với đường cong sinh trưởng của vi khuẩn trong sữa đậu nành, từ đó chọn thời gian lên men thích hợp sao cho sản phẩm đảm bảo lượng vi khuẩn cần thiết để nó đóng vai trò như là probiotic
2.5.4.2. Khảo sát tỷ lệ phối chế giữa sữa đậu nành và sữa tươi tiệt trùng không đường. đường.
a/ Mục đích
Phối chế giữa sữa đậu nành và sữa tươi nhằm tạo ra dịch sữa tăng hàm lượng protein và làm cho sản phẩm sữa chua tạo ra có mùi thơm hơn, vị béo hơn.
b/ Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm một yếu tố gồm 3 nghiệm thức
Yếu tố thí nghiệm là tỉ lệ phối chế giữa sữa đậu nành và sữa tươi UHT như sau : 4:6, 5:5, 6:4.
Số lần lặp lại: 3 lần
c/ Chỉ tiêu theo dõi
-pH của sản phẩm.
-Kết quả đánh giá cảm quan về cấu trúc, mùi và vị sản phẩm theo phương pháp so hàng.
d/ Phương pháp thực hiện
Mỗi thí nghiệm thực hiện theo quy trình đã nêu. Nhưng tỉ lệ phối chế giữa sữa đậu nành và sữa tươi UHT thay đổi theo các thông số đã nêu như trên.
2.5.4.3. Khảo sát hàm lượng đường saccharose bổ sung.
Chuẩn bị sữa đậu nành giống mục 2.4.2 và ứng dụng kết quả các thí nghiệm trên
Lần lượt bổ sung đường saccharose vào sữa theo các tỉ lệ khảo sát khác nhau 6%, 8%, 10%(w/v)
Theo dõi pH và đánh giá cảm quan sản phẩm theo phương pháp so hàng. Từ đó chọn hàm lượng đường thích hợp bổ sung vào sữa.
2.5.4.4.Khảo sát tỉ lệ giống cấy.
Chuẩn bị sữa đậu nành giống mục 2.4.2 và ứng dụng kết quả các thí nghiệm trên
Thay đổi tỉ lệ giống cấy tỉ lệ giữa Lactobacillus acidophilus và Lactobacillus bulgaricus thay đổi như sau 6:4, 5:5, 4:6 (v/v).
Theo dõi pH và đánh giá cảm quan sản phẩm theo phương pháp so hàng. Từ đó chọn tỉ lệ giống cấy thích hợp bổ sung vào sữa để lên men.
2.5.5. Khảo sát tỉ lệ phối chế giữa dịch sữa ( sữa tươi UHT + sữa đậu nành) với dịch tảo spirulina. dịch tảo spirulina.
a/ Mục đích
Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng tảo phối chế hưởng lớn đến màu, mùi và vị sản phẩm.
b/ Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm một yếu tố gồm 3 nghiệm thức
Yếu tố thí nghiệm là tỉ lệ phối chế giữa dịch tảo spirulina và dịch sữa (sữa đậu nành + sữa tươi UHT) với các tỉ lệ như sau:6%, 8%, 10%(v/v)
Số lần lặp lại: 3 lần
c/ Chỉ tiêu theo dõi.
-Kết quả đánh giá cảm quan về cấu trúc, màu, mùi và vị sản phẩm.
d/ Phương pháp thực hiện
Mỗi thí nghiệm thực hiện theo quy trình đã nêu. Nhưng tỉ lệ phối chế giữa dịch tảo và dịch sữa (sữa đậu nành + sữa tươi UHT) thay đổi theo các thông số đã nêu như trên. Ứng dụng kết quả các thí nghiệm trên.
2.5.6. Khảo sát thời gian bảo quản sản phẩm
Sản phẩm được bảo quản ở nhiệt độ 4OC
Theo dõi PH, độ acid và số lượng vi khuẩn lactic trong sản phẩm theo các ngày bảo quản để chọn ra được thời gian bảo quản tối ưu cho sản phẩm ( sản phẩm vừa đạt về giá trị cảm quan vừa đạt được giá trị dinh dưỡng về probiotic).
Sau thời gian bảo quản tối ưu, tiến hành đánh giá cảm quan sản phẩm theo phương pháp cho điểm thị hiếu nhằm xác định mức độ chấp nhận sản phẩm của người tiêu dùng.
2.6. Phương Pháp Phân Tích Các Chỉ Tiêu 2.6.1. Mật độ tế bào vi sinh vật: 2.6.1. Mật độ tế bào vi sinh vật:
Được xác định theo công thức sau:
Trong đó: C (CFU/g) là số tế bào vi khuẩn trong 1g mẫu n1xV1xf1 +…+ n1xV1xf1
N C (CFU/g) =
N ( CFU) là tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa ni là số đĩa cấy ở nồng độ thứ i
Vi (ml) là thể tích mẫu cấy trong mỗi đĩa fi là độ pha loãng thứ i
2.6.2. Xác định pH của sản phẩm:
Đo bằng máy đo pH Hanna 210.
2.6.3. Phương pháp chuẩn độ acid
Cho 10ml sữa vào bình tam giác 100ml, sau đó cho vào khoảng 3 giọt
phenoltalein 1%. Dùng NaOH 0,1N chuẩn độ ( dung dịch xuất hiện màu hồng phấn trong 10 giây).
% acid= n. 0,09 n: số ml NaOH 0,1N
2.6.4. Phương pháp đánh giá cảm quan sản phẩm
3Phương pháp so hàng. ( phụ lục 1.3.1 ) 3Phương pháp cho điểm. (phụ lục 1.3.2 )
2.6.5. Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý kết quả
3Bố trí thí nghiệm 1 yếu tố.
Chương 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Đường cong tăng trưởng của Lactobacillus acidophilus, Lactobacillusbulgaricus trên môi trường MRS broth bulgaricus trên môi trường MRS broth
4.1.1. Hình thái khuẩn lạc trên môi trường MRS agar
Hình 4.1: L. acidophilus Hình 4.2: L. bulgaricus
Khuẩn lạc L. acidophilus trên môi trường MRS agar có dạng hình tròn, kích thước 2 - 5 mm, lồi,màu trắng đục, đều và không sinh chất tạo màu.
Khuẩn lạc L. bulgaricus trên môi trường MRS agar phẳng, hơi vàng, đường kính 2 - 3mm.
4.1.2. Đường cong tăng trưởng của Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus trên môi trường MRS broth bulgaricus trên môi trường MRS broth
Chúng tôi tiến hành dựng đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus trên môi trường MRS broth, nhằm mục đích nghiên cứu định tính vi sinh vật theo thời gian và xác định thời điểm mật độ tế bào đạt cực đại để từ đó tiếp tục tăng sinh trong môi trường sữa đậu nành.
Vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường MRS ở nhiệt độ 370C, pH = 5,7. Giống được cấy trực tiếp từ ống giữ giống thạch nghiêng.
Bảng 4.1: Kết quả tăng trưởng của vi khuẩn L. acidophilus theo thời gian nuôi cấy trong môi trường MRS
Thời gian (giờ) Mật độ vi khuẩn L. acidophilus Log (CFU/ml) Mật độ vi khuẩn L. bulgaricus Log (CFU/ml) 0 1,89 5 3 2,33 5,3 6 4,81 6 9 6,08 6,95 12 7,3 7,08 15 8,33 7,15 18 8,37 8,2 21 8,34 8,08 24 8,3 8,18 27 8,28 8 30 8,22 7,7 33 7,8 6,96 36 7,31 6 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 10 20 30 4 Thời gian( giờ) Log( C F U /ml ) 0
Hình 4.3: Đường cong sinh trưởng của L. acidophilus
Nhận xét:
Từ đường cong sinh trưởng của vi khuẩn L. acidophilus chúng tôi nhận thấy: pha tiềm phát kéo dài trong khoảng 2 - 3 giờ đầu do số lượng tế bào vi khuẩn tăng lên không đáng kể. Độ dài pha tiềm phát tương đối ngắn chứng tỏ các tế bào vi khuẩn còn trẻ, nhanh chóng thích nghi với môi trường MRS broth. Từ 3 - 15 giờ, vi khuẩn sinh trưởng và phát triển theo lũy thừa, vi khuẩn sinh sản mạnh, sinh khối tăng nhanh, đây là pha cấp số của vi khuẩn. Số lượng tế bào vi khuẩn đạt cực đại ở 15 giờ, là thời điểm bắt đầu pha cân bằng. Pha cân bằng kéo dài từ 18 - 30 giờ, trong pha này sự sinh sản vẫn tiếp tục diễn ra ở một số tế bào trong môi trường nuôi cấy, tổng số tế bào mới được sinh ra bằng với tổng số tế bào chết bị mất đi, các chất dinh dưỡng trong môi trường bắt đầu cạn kiệt, cùng với sự tích lũy nhiều acid lactic có thể gây ức chế sự phát triển của chính vi khuẩn. Sau 30 giờ mật độ tế bào giảm dần, bắt đầu pha suy vong, do hàm lượng chất dinh dưỡng trong môi trường cạn kiệt, sự cạnh tranh các chất dinh dưỡng của vi khuẩn diễn ra, cùng với sản phẩm của quá trình trao đổi chất đã ức chế sự phát triển của vi khuẩn nên số lượng tế bào sinh ra ít hơn số lượng tế bào mất đi.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 10 20 30 4 Thời gian( giờ) Log( C F U /m l) 0
Hình 4.4: Đường cong sinh trưởng của L. bulgaricus
trong môi trường MRS broth
Nhận xét:
Từ đường cong sinh trưởng của vi khuẩn L. acidophilus chúng tôi nhận thấy: pha tiềm phát của L. bulgaricus cũng kéo dài trong khoảng 2 - 3 giờ đầu. Trong 3 - 18
giờ tiếp theo là pha cấp số. Và số lượng tế bào đạt cực đại ở 18 giờ. Pha cân bằng diễn ra trong 18 - 30 giờ. Sau 30 giờ là pha suy vong của vi khuẩn.
Kết luận:
Chúng tôi thu nhận sinh khối vi khuẩn L. acidophilus sau 15 giờ nuôi cấy và thu nhận sinh khối L. bulgaricus sau 18 giờ nuôi cấy trong môi trường MRS broth.
4.2. Đường cong tăng trưởng của Lactobacillus acidophilus, Lactobacillusbulgaricus trên môi trường dịch sữa (sữa đậu nành và sữa tươi với tỷ lệ 1:1) bulgaricus trên môi trường dịch sữa (sữa đậu nành và sữa tươi với tỷ lệ 1:1)
Chúng tôi tiến hành xây dựng đường cong tăng trưởng của Lactobacillus acidophilus,Lactobacillus bulgaricus trong môi trường dịch sữa nhằm khảo sát số lượng vi sinh vật trong môi trường dịch sữa trong các khoảng trong thời gian nuôi cấy để ứng dụng vào làm men cái cho quá trình sản xuất sữa chua.
Bảng 4.2: Kết quả tăng trưởng của vi khuẩn L. acidophilus theo thời gian nuôi cấy trong môi trường dịch sữa
Thời gian (giờ) Mật độ vi khuẩn L. acidophilus Log (CFU/mL) pH 0 7,86 6,35 5 8,92 5,9 10 10,69 5,1 15 11.36 4,2 20 10.26 4 25 9.08 3,8 0 1 2 3 4 5 6 7 0 5 10 15 20 25 Thời gian( giờ) pH 0 2 4 6 8 10 12 Lo g( C F U / ml ) pH Log số lượng ( CFU/ ml)
Hình 4.5: Đường cong sinh trưởng của L. acidophilus trong môi trường dịch sữa
Bảng 4.3: Kết quả tăng trưởng của vi khuẩn L. bulgaricus theo thời gian nuôi cấy trong môi trường dịch sữa
Thời gian (giờ) Mật độ vi khuẩn L. acidophilus Log (CFU/mL) pH 0 7,56 6,36 5 8,85 6,1 10 10 5,15 15 10,6 4,4 20 9,9 4,1 25 9,48 3,9 0 1 2 3 4 5 6 7 0 5 10 15 20 25 Thời gian( giờ) pH 0 2 4 6 8 10 12 Log( C F U /m l) pH Log số lượng ( CFU/ ml)
Hình 4.6: Đường cong sinh trưởng của L. bulgaricus trong môi trường dịch sữa
Nhận xét:
Từ đường cong sinh trưởng của L. acidophilus và L.bulgaricus chúng tôi nhận thấy: số lượng tế bào vi khuẩn ngay tại thời điểm cấy vào môi trường dịch sữa > 107 CFU/ml. Số lượng tế bào tăng nhanh trong 15 giờ tiếp theo kết hợp với sự giảm mạnh giá trị pH do acid lactic của vi khuẩn sinh ra trong quá trình trao đổi chất. Số lượng tế bào vi khuẩn đạt cực đại ở 15 giờ. Sau 15 giờ số lượng tế bào giảm do hàm lượng các
chất dinh dưỡng trong môi trường giảm và lượng acid lactic trong môi trường nhiều ức chế sự phát triển của vi khuẩn.
Kết luận:
Trong môi trường dịch sữa, vi khuẩn vẫn sinh trưởng và phát triển mạnh, số lượng tế bào vi khuẩn > 107 CFU/ml trong các khoảng thời gian khảo sát đảm bảo probiotic cung cấp cho cơ thể là đủ.
4.3. Khảo sát quá trình làm men cái.
Bảng 4.4. Kết quả pH men vi khuẩn L. acidophilus và L. bulgaricus qua thời gian
khảo sát Thời gian (giờ) pH men vi khuẩn L. acidophilus pH men vi khuẩn L. bulgaricus 0 6,33 6,34 2 6,23 6,2 4 6,09 6,13 6 5,98 5,9 8 5,67 5,64 10 5,14 5,15 0 1 2 3 4 5 6 7 0 2 4 6 8 10 Thời gian( giờ) pH pH men L. acidophilus pH men L. bulgarucus
Hình 4.7: pH men vi khuẩn L. acidophilus và L. bulgaricus qua
Bảng 4.5: Mô tả cảm quan men vi khuẩn qua thời gian khảo sát Thời gian ( giờ) Men vi khuẩn L. acidophilus Men vi khuẩn L. bulgaricus 0 Cấu trúc lỏng Màu trắng đục Mùi đậu và mùi béo
Cấu trúc lỏng Màu trắng đục Mùi đậu và mùi béo 2 Chưa đông, dạng lỏng Chưa đông, dạng lỏng
4
Cấu trúc sệt dưới đáy hủ, mùi đậu nhẹ, vị hơi chua và béo nhiều.
Chưa đông, có mùi chua thoảng và mùi chua nhẹ 6 Cấu trúc sản phẩm đặc lại, bề mặt mịn, có vị chua kết hợp với vị đậu. Cấu trúc sản phẩm sệt, không đặc, có mùi sữa chua mạnh, vị hơi chua kết hợp với vị đậu. 8 Sản phẩm bị tách một lớp nước
trên bề mặt.
Cấu trúc sản phẩm đặc lại, mùi chua và có mùi đậu nành bị hư. 10 Sản phẩm bị tách nước hoàn
toàn.
Sản phẩm bị tách nước hoàn toàn.
Bằng đánh giá cảm quan, chúng tôi nhận thấy đối với men L. acidophilus tại thời điểm 6 giờ ủ đạt về mặt giá trị cảm quan cấu trúc và mùi, nhưng về vị thì không chua lắm ( pH=5,98). Còn đối với men vi khuẩn L. bulgaricus, tại thời điểm 6 giờ ủ cảm quan về cấu trúc không đạt nhưng đạt về mùi, do vi khuẩn này có tác dụng sinh hương trong sản xuất sữa chua.
Kết luận:
Kết hợp cảm quan và pH sản phẩm, đường cong sinh trưởng của vi khuẩn trong môi trường dịch sữa ( 4.2), chúng tôi chọn men cái cho ứng dụng vào sản xuất sữa chua là men vi khuẩn tại 6 giờ ủ.
4.4. Khảo sát quá trình lên men
Quá trình lên men sữa chua sẽ bị tác động bởi nhiều yếu tố. Trong đề tài này chúng tôi tiến hành khảo sát các yếu tố sau: thời gian lên men, tỉ lệ phối chế giữa sữa
đậu nành và sữa tươi, tỉ lệ giống cấy ( tỉ lệ giữa L. acidophilus và L. bulgaricus), hàm lượng đường saccharose bổ sung.
4.4.1. Khảo sát thời gian lên men
Bảng 4.6: Kết quả pH của dịch sữa theo thời gian lên men
Thời gian ( giờ) 0 1 2 3 4 5 6
PH 6.45 6.3 5.92 5.36 5.02 4.73 4.63 0 1 2 3 4 5 6 7 0 2 4 6 8 Thời gian( giờ) pH
Hình 4.8: Kết quả pH của dịch sữa theo thời gian lên men
Bảng 4.6: Mô tả cảm quan dịch sữa theo thời gian lên men
Thời gian( giờ) Đặc điểm sản phẩm
0 Chưa đông, dạng lỏng
2 Cấu trúc bắt đầu sệt dưới đáy hủ, màu xanh nhạt của tảo, mùi chua nhẹ, vị đậu và ngọt nhiều.
3 Cấu trúc sản phẩm đặc lại, bề mặt láng, màu xanh nhạt, mùi chua mạnh, vị chua nhẹ,vị đậu và béo nhiều. 4 Sản phẩm bị tách một lớp nước bề mặt, màu xanh
nhạt, mùi chua mạnh, vị chua nhẹ, vị đậu và béo nhiều 5 Sản phẩm bị tách nước trên bề mặt và dưới đáy hủ,
chua và vị đậu mạnh, vị béo giảm.
6 Sản phẩm bị tách nước hoàn toàn, mùi ôi chua của đậu nành.
Bằng đánh giá cảm quan chúng tôi nhận thấy sản phẩm sau 3 và 4 giờ lên men có cảm quan về mùi và vị giống nhau nhưng khác nhau về cấu trúc sản phẩm. Kết hợp 3 yếu tố: pH, cảm quan và đường cong sinh trưởng của vi khuẩn trong môi trường dịch sữa chúng tôi chọn thời gian lên men sản phẩm là 3 giờ.
Theo Gloria và cộng sự (2004), khi bổ sung thêm sinh khối tảo S. platensis vào sữa sẽ thúc đẩy quá trình lên men lactic. Do đó hời gian lên men của sữa chua đậu nành tảo spirulina ( 3 giờ) ngắn hơn so với thời gian lên men của các sản phẩm sữa chua khác ( 4 - 6 giờ).
Mặt khác, pH của sản phẩm sữa chua đậu nành tảo spirulina ( 5,36) là cao hơn nhiều so với các sản phẩm sữa chua thông thường ( 4,0 - 4,6), chúng tôi chấp nhận giá trị pH này vì nếu pH của sản phẩm trong quá trình khảo sát này nếu < 5 thì sản phẩm sẽ không đạt về mặt cấu trúc. Lý do làm xảy ra hiện tượng này có thể được giải thích như sau: pH đẳng điện của protein đậu nành nằm trong khoảng 4,2 - 4,6, khả năng hút nước của protein là thấp nhất tại pH đẳng điện của chúng, nên pH của sản phẩm càng tiến về giá trị pH đẳng điện này thì sản phẩm càng bị tách nước.
4.4.2. Khảo sát tỷ lệ phối chế giữa sữa đậu nành và sữa tươi tiệt trùng không đường đường
Nhằm làm giảm bớt mùi đậu nành, chúng tôi tiến hành khảo sát tỉ lệ phối chế giữa sữa đậu nành và sữa tươi tiệt trùng với các tỉ lệ như sau
D: tỷ lệ 4 phần sữa đậu nành và 6 phần sữa tươi E: tỷ lệ 6 phần sữa đậu nành và 4 phần sữa tươi F: tỷ lệ 8 phần sữa đậu nành và 2 phần sữa tươi
Từ kết quả đánh giá cảm quan ở phụ lục 2.1, và kết quả phân tích thống kê phụ lục 3.1 chúng tôi rút ra được Bảng 4.7