2.2.1. Phương pháp đo độ đục định lượng tế bào nấm men
Dựa trên nguyên tắc tế bào nấm men có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sóng 550nm. Dựa vào thang chuẩn Mc Farland để định lƣợng tế bào nấm men.
Bảng 2.1 : Độ chuẩn Mc Farland ở bước sóng 550nm [ 22]
Độ chuẩn Mc Farland Tƣơng ứng Nồng độ tế bào (tế bào/ml) Bƣớc sóng OD 550nm 0,5 150 x 106 0,125 1 300 x 106 0,25 2 600 x 106 0,50 3 900 x 106 0,75 4 1200 x 106 1,00 5 1500 x 106 1,25 Các bƣớc tiến hành:
35
Chuẩn bị 2 cuvet sạch. Hút 1ml dịch nấm men trên vào 1 cuvet.
Một cuvet chứa 1ml nƣớc cất vô trùng dùng làm blank. Đƣa vào máy so màu OD.
Kết quả OD đƣợc so với thang chuẩn Mc Farland để tính lƣợng nấm men đƣợc nuôi môi trƣờng Hansen lỏng là bao nhiêu.
2.2.2. Phương pháp đếm khuẩn lạc nấm men
Chuẩn bị dịch pha loãng mẫu (nƣớc vô trùng). Chuẩn bị chuỗi pha loãng mẫu (hình 2.1). Nấm men sau khi hoạt hóa đƣợc pha loãng theo mũ 10. Cấy trải mẫu đã pha loãng lên đĩa peptri chứa môi trƣờng Hansen cứng (hình 2.2). Nuôi mẫu ở 30o
C trong 24 – 48h. Đếm số khuẩn lạc hình thành.
36
Hình 2.2: Cấy trải mẫu vào môi trƣờng Hansen cứng trên đĩa peptri.
2.2.3. Phương pháp tìm nồng độ diệt tối thiểu (MBC) của hỗn hợp NCS-TDN cho nấm men
Chuẩn bị chủng nấm men cho thử nghiệm:
Lấy nấm men đƣợc hoạt hóa qua đêm từ đĩa sang ống nghiệm chứa nƣớc cất vô trùng, vortex để đồng nhất dung dịch nấm men. Hút 1ml để đo độ đục, dựa vào độ đục chuẩn Mc Farland để xác định nồng độ nấm men.
Xác định hoạt tính đối kháng nấm men của nano chitosan-tinh dầu nghệ
Bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính đối kháng nấm men của nano chitosan và tinh dầu nghệ với các nồng độ khác nhau (Bảng 2.2).
37 Bảng 2.2: Sơ đồ thí nghiệm Lô thí nghiệm Nồng độ NCS-TDN (%) Đối chứng Không có NCS-TDN 2 0,1 3 0,08 4 0,06 5 0,04 6 0,02
Dịch nấm men đƣợc bổ sung vào mỗi ống nghiệm đã đƣợc xác định nồng độ bằng phƣơng pháp đo độ đục, sao cho nồng độ cuối cùng của nấm men đạt: 105 tế bào/ml.
Nuôi ở 300C trong 24h. Pha loãng dịch nuôi cấy nấm men, cấy trải 100µl từ một số độ pha loãng lên môi trƣờng Hansen rắn. Tiếp tục nuôi ở 30oC. Quan sát sự phát triển của nấm men sau 24h nuôi cấy. Nồng độ NCS-TDN thấp nhất mà sinh trƣởng của nấm men bị ức chế hoàn toàn gọi là nồng độ diệt tối thiểu (MBC).
2.2.4. Phương pháp kiểm tra khả năng đối kháng nấm mốc của chế phẩm nano chitosan kết hợp với tinh dầu nghệ.
Sử dụng phƣơng pháp “ Khuếch tán trên đĩa thạch”.
Chuẩn bị các đĩa thạch có chứa môi trƣờng Czapek-Dox. Lấy bào tử nấm mốc đã đƣợc hoạt hóa ở ống thạch nghiêng sang ống eppendorf chứa dung dịch muối sinh lý (0,9%), vortex. Hút dung dịch nấm mốc vào đĩa thạch đã chuẩn bị ở trên. Trang đều trên bề mặt đĩa đến khi khô mặt thạch. Đục các lỗ xung quanh đĩa thạch và 1 lỗ ở giữa làm lỗ đối chứng. Nhỏ dung dịch nanochitosan và tinh dầu nghệ (từ lỗ 1 đến hết).
38
Lỗ đối chứng nhỏ dung dịch muối sinh lý. Để trong tủ lạnh 15 phút cho dung dịch khuếch tán vào trong thạch. Nuôi ở 30oC trong 72 giờ. Kiểm tra kết quả.
2.2.5. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính đối kháng vi sinh vật của NCS- TDN trên quả thanh long
Thanh long miền nam mua về đƣợc rửa bằng nƣớc sạch, để khô tự nhiên. Các bƣớc tiến hành thí nghiệm nhƣ sau:
Hoạt hóa các chủng vi sinh vật gây hỏng quả thanh long trên môi trƣờng đặc. Mỗi quả đƣợc gây xƣớc 5 điểm. Nhỏ 20 µl dung dịch nấm sợi mật độ 104 bào tử/ml vào từng vết khía. Để khô tự nhiên, sau đó nhỏ 20 µl NCS-TDN vào các vết khía. Để khô tự nhiên, giữ trong thùng giấy, đảm bảo độ ẩm 80-85% cho quả.
2.2.6. Bảo quản thanh long trong điều kiện phòng thí nghiệm bằng NCS- TDN.
Thanh long sau khi rửa nhẹ nhàng bằng nƣớc, để khô tại nhiệt độ phòng. Các quả thí nghiệm đƣợc phun dung dịch nano chitosan 0,2% kết hợp với tinh dầu nghệ 0,2%. Mẫu quả đối chứng: chỉ rửa bằng nƣớc sạch để khô tự nhiên, sau đó đƣợc bảo quản (Sơ đồ 2.1).
Đánh giá hiệu quả xử lý thanh long bằng nano chitosan-tinh dầu nghệ dựa trên các tiêu chí: Trạng thái (cứng, nhũn); Màu sắc; Mùi; Vị (nếu có).
39
Sơ đồ 2.1: Nghiên cứu khả năng bảo quản quả thanh long sau thu hoạch của chế phẩm NCS-TDN
Quả thanh long sau thu hoạch
Quả đối chứng Quả phun chế phẩm nano chitosan và tinh dầu nghệ
Bảo quản
Bảo quản lạnh 10 ± 2oC
Bảo quản nhiệt độ phòng
40
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đánh giá khả năng đối kháng nấm men của chế phẩm NCS-TDN in vitro
Chủng nấm men Rhodoturola sp. (TL1) đƣợc phòng Công nghệ sinh học – Viện Hóa sinh biển phân lập từ vỏ quả Thanh Long bị hỏng và đƣợc định danh dựa trên hình thái. Chủng nấm men đƣợc hoạt hóa trƣớc khi làm thí nghiệm trên đĩa thạch petri có môi trƣờng Hansen, nuôi ở 30o
C trong 48h. Tiến hành cấy chuyển nấm men từ đĩa petri sang ống nghiệm chứa môi trƣờng Hansen lỏng (2ml). Nuôi qua đêm ở 30oC. Pha loãng và đo OD.
Bảng 3.1: Kết quả đo OD ở bước sóng 550nm của mẫu TL1
Tên mẫu Kết quả OD Tế bào/ml
B(nƣớc cất vô trùng) 0,000 0
1(TL1) 1,188 1350 x 106
ODTL1= 1,188 nằm giữa độ chuẩn Mc Farland 4 và 5, tƣơng ứng với hằng số OD là 1,00 và 1,25. Vì vậy, nồng độ tế bào của TL1 là tỷ số trung bình của độ chuẩn 4 và 5. Theo bảng 2.1:
Nồng độ tế bào TL1= (1200 x 106 + 1500 x 106) / 2 = 1350 x 106 Tế bào/ml Nhƣ vậy nồng độ dịch nấm men TL1 pha loãng 10-1 là 1350 x 106 tế bào/ml nên nồng độ gốc là: 1350 x 107 tế bào/ml = 1,35 x 1010 tế bào/ml. Pha loãng dịch nấm men gốc ở độ pha loãng 10-4 sao cho đƣợc dịch nấm men với nồng độ là khoảng 106 tế bào/ml. Bổ sung 200μl dịch nấm men với nồng độ 106 tế bào/ml vào mỗi ống nghiệm (6 ống) đã có 1,8ml môi trƣờng Hansen cùng với nano chitosan - tinh dầu nghệ, đƣợc đánh dấu từ 1 đến 6, tƣơng ứng với nồng độ nano chitosan kết hợp với tinh dầu nghệ
41
đƣợc bổ sung vào mỗi lọ là 0%; 0,1%; 0,08%; 0,06%; 0,04%; 0,02%. Nuôi ở 30oC trong 24h. Cấy trải dịch nuôi lên môi trƣờng Hansen đặc. Kết quả trên bảng 3.2.
Bảng 3.2: Khả năng ức chế sinh trưởng nấm men của NCS-TDN.
Nồng độ NCS-TDN (%) CFU trung bình/100μl Đánh giá mức đối kháng nấm men (%) 0 1,1 x 108 0 0,1 0 100 0,08 0 100 0,06 364 90 - 99 0,04 Phát triển tốt 40 – 50 0,02 Phát triển rất tốt Dƣới 20
Ghi chú: CFU: Đơn vị tạo khuẩn lạc
42
Bảng 3.2 và hình 3.1 cho thấy, ở nồng độ 0,04%, NCS-TDN hầu nhƣ không ức chế sinh trƣởng của chủng nấm men nghiên cứu. Tăng nồng độ lên 0,06%, sinh trƣởng của chủng TL1 gần nhƣ bị ức chế hoàn toàn. Nồng độ NCS-TDN 0,08% ức chế 100% sinh trƣởng của chủng TL1 sau 24 giờ xử lý. Nhƣ vậy MBC của NCS-TDN đối với chủng TL1 là 0,08%.
Theo một số tác giả, các chủng nấm men có tính kháng khá tốt đối với tinh dầu nghệ. Nồng độ TDN 10% nhận đƣợc bằng phƣơng pháp lôi cuốn hơi nƣớc tạo vòng đối
Hình 3.1: Đánh giá hoạt tính đối kháng nấm men TL1 của NCS-TDN. a) Đĩa đối chứng; b) NCS-TDN 0,08%; c) NCS-TDN 0,06%; d) NCS-TDN 0,04% ; e) NCS-TDN 0,02%. a) b) d) c) e)
43
kháng chủng TL1 khoảng 1,2 cm (phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch) [1]. Có thể thấy, nanochitosan và TDN có khả năng hỗ trợ lẫn nhau, làm tăng hoạt tính đối kháng nấm men của chúng.
3.2. Đánh giá khả năng đối kháng nấm mốc của chế phẩm nano chitosan và tinh dầu nghệ in vitro
Chủng nấm mốc Cladosporium cladosporioides (Fres.) de Vries (MTL2),
Cladosporium tenuisimum Cooke (MTL4) đƣợc hoạt hóa trên đĩa thạch petri chứa môi trƣờng Czapex – Dox. Vortex dung dịch bào tử nấm trong dung dịch nƣớc muối sinh lý (0,9% NaCl) để đồng nhất. Cấy trải 200 μl huyền dịch lên môi trƣờng rắn. Đục các lỗ trên mỗi đĩa, nhỏ 100 μl dung dịch NCS-TDN nồng độ khác nhau vào mỗi lỗ. Nồng độ NCS trong tất cả các thí nghiệm là 0,2%; nồng độ TDN thay đổi từ 0,1-1,0%. Nuôi ở 30oC trong 72h. Kết quả trên bảng 3.3.
Bảng 3.3: Hoạt tính đối kháng nấm mốc của NCS-TD; (D-d) mm
Lô thí nghiệm Nồng độ NCS (%) Nồng độ TDN (%) C.cladosporioides (mm) C. tenuisimum (mm) ĐC 0 0 0 0 1 0,2 0,1 0,5 2,0 2 0,2 0,2 0,5 3,0 3 0,2 0,3 4,5 7 4 0,2 0,4 4,5 7 5 0,2 0,5 6 9 6 0,2 1,0 12 18
44
Hình 3.2: Hoạt tính đối kháng của NCS-TDN đối với MTL2.
Bảng 3.3 cho thấy chủng C. tenuisimum mẫn cảm hơn so với chủng C. cladosporioides. Ở cùng nồng độ tinh dầu nghệ nghiên cứu, chủng C. tenuisimum có vòng ức chế sinh trƣởng lớn hơn chủng C. cladosporioides từ 1,5 đến 4 lần, nhất là ở nồng độ TDN thấp (0,1-0,2%).
Chitosan đƣợc chứng minh có hoạt tính đối kháng nấm nhƣ Aspergillus niger, Alternaria alternata, Rhizopus oryzae, Phomopsis asparagi, và Rhizopus stolonifer và hoạt tính này là do bản chất polycatonic của chitosan. Các nghiên cứu chỉ ra rằng, hiệu quả ức chế nấm của chitosan phụ thuộc không những vào công thức chitosan, mà cả vào loại nấm. Ngƣời ta đã chứng minh rằng chitosan làm giảm hoạt tính H+
-ATPase trên màng nguyên sinh chất của R. stolonifer, gây ra sự tích lũy proton trong tế bào, kết quả ức chế sự vận chuyển chemiosotic mà sự vận chuyển này cho phép trao đổi ion H+/K+. Bằng quá trình phụ thuộc năng lƣợng, chitosan nhanh chóng thâm nhập vào conidia của F.oxysporum (ít hơn 15 phút), và làm thay đổi cấu trúc tế bào nhƣ phá hoại tế bào chất, co rút màng plasma và làm mất các hợp chất trong tế bào. Các nghiên cứu
45
khác với các loại nấm gây bệnh cho thực vật khẳng định chitosan thâm nhập qua màng tế bào và gắn với axit nucleic [25].
Hoạt tính đối kháng nấm của nano chitosan đƣợc một số nhà khoa học báo cáo. Nano chitosan polycationic có điện tích bề mặt lớn tƣơng tác hiệu quả với nấm và có ái lực cao gắn với tế bào vi nấm [31]. Nano chitosan có nồng độ ức chế tối thiểu (diệt 90% nấm) đối với C. albicans và A. niger là 0,002 mg/ml và cho F. solani là 0,02 mg/ml [28]. Khi các thành phần của tinh dầu (eugenol và carvacrol) đƣợc gắn vào nano chitosan, hoạt tính kháng khuẩn của phức hợp bằng hoặc lớn hơn của nano chitosan. Ngoài ra, các hạt nano chitosan mang tinh dầu ít độc hơn cho tế bào động vật so với tinh dầu [12].
Các kết quả nhận đƣợc cho thấy NCS-TDN ở nồng độ nghiên cứu có khả năng ức chế và tiêu diệt nấm men/nấm mốc hiệu quả. Đặc điểm này của phức hợp làm cho chúng có tiềm năng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm cũng nhƣ trong nông nghiệp (pesticides sinh học để kiểm soát nguồn bệnh thực vật).
46
3.3 Đánh giá khả năng đối kháng nấm của nano chitosan-tinh dầu nghệ in vivo
trên thanh long
Bằng phƣơng pháp mô tả, thanh long đƣợc nhiễm hai chủng nấm,Cladosporium cladosporioides và Rhodoturola sp. Bảo quản ở nhiệt độ phòng. Sau các khoảng thời gian nhất định, kiểm tra các vết nhiễm nấm đƣợc xử lý NCS-TDN 0,2% và không đƣợc xử lý. Kết quả đƣợc trình bày trên bảng 3.4.
Bảng 3.4: Khả năng ức chế nấm của NCS-TDN trên thanh long
Lô thí nghiệm
Sau 5 ngày Sau 8 ngày Sau 12 ngày
Mô tả Mức hỏng Mô tả Mức hỏng Mô tả Mức hỏng Đối chứng (Để không) 100% số quả da và tai héo. 67% số quả bị mốc đầu và cuống. + Quả còn lại mốc đầu, cuống. Da quả có đốm vàng ++ Quả còn lại bị nhũn. Da và tai vàng +++ Nhiễm MTL2 Cladosporium cladosporioides 100% số vết khía có mốc. 50% số quả bị thối do mốc ++ 100% quả bị thối +++ Cladosporium cladosporioides NCS-TDN 0,2% Các quả tai vàng và có đốm trên da. Các vết xử lý chƣa có hiện tƣợng nấm ± 40% vết khía bắt đầu có sự phát triển của mốc + 60% số vết có sự phát triển của mốc ++
47 Nhiễm TL1 Rhodoturola sp. Tai héo vàng, nấm lan rộng ra ngoài. 50% quả bị thối ++ 100% bị thối +++ Rhodoturola sp. + NCS-TDN 0,2% 100% quả da và tai vàng. Vết xử lý chƣa có nấm mọc + 50% số vết khía đã bị thối ++ 80% số vết khía bị hỏng +++
Ghi chú: ± : bắt đầu có hiện tượng hỏng. + : hỏng một phần trên quả. ++: hỏng khoảng 50%. +++: Đã hỏng hết
Kết quả nhận đƣợc cho thấy NCS-TDN có khả năng ngăn cản sự phát triển của nấm men và nấm mốc trên quả thanh long.
Hình 3.4: Thanh long bị hỏng do nhiễm nấm a) Thanh long nhiễm nấm men; b) Thanh long nhiễm nấm mốc
48
3.4. Đánh giá khả năng bảo quản thanh long bằng chế phẩm nano chitosan và tinh dầu nghệ
Hoa quả sau thu hoạch thƣờng bị hỏng do nhiều nguyên nhân: hƣ hại trong quá trình thu hoạch và vận chuyển, mất nƣớc, do nhiễm các nguồn bệnh thực vật trên đồng ruộng và trong quá trình bảo quản. Vì vậy, để hạn chế quả bị hỏng trong quá trình bảo quản bởi vi sinh vật, cần áp dụng các biện pháp bảo quản nhƣ phun thuốc diệt nấm, xông lƣu huỳnh hoặc bọc quả trong các loại màng sinh học. Nhằm khai thác hoạt tính đối kháng nấm của phức hợp nano chitosan – tinh dầu nghệ, phức hợp này đã đƣợc thử nghiệm bảo quản thanh long trong điều kiện phòng thí nghiệm.
3.4.1. Bảo quản thanh long ở nhiệt độ phòng
Thí nghiệm đƣợc tiến hành nhƣ mô tả ở phần phƣơng pháp. Thanh long sau khi rửa sạch nhẹ nhàng, để khô ở nhiệt độ phòng, sau đó đƣợc phun nano chitosan-tinh dầu nghệ 0,2%. Để khô và xếp vào thùng cacton.
49
Bảng 3.5: Kết quả thanh long bảo quản ở nhiệt độ phòng
Lô TN 7 ngày 15 ngày 20 ngày
ĐC 100% tai quả héo, úa
vàng. Vỏ quả có hiện tƣợng thâm nám.
100% mốc đầu và cuống. 60% quả thối hỏng.
100% quả thối hỏng
NCS-TDN 90% tai quả ngả vàng. Vỏ quả đỏ tƣơi.
50% héo cuống. 20% quả thối hỏng. Còn lại vỏ quả tƣơi đỏ.
50% quả thối hỏng. Còn lại tai quả héo, vỏ quả đỏ tƣơi.
Ghi chú: ĐC: đối chứng TN: thí nghiệm
Hình 3.6: Thanh long bảo quản ở nhiệt độ phòng sau 7 ngày; a) Mẫu thanh long đƣợc phun chế phẩm nano chitosan và tinh dầu nghệ 0,2%; b) Mẫu đối chứng
50
Hình 3.7: Thanh long bảo quản ở nhiệt độ phòng sau 15 ngày; a) thanh long đƣợc phun nano chitosan và tinh dầu nghệ 0,2%; b)Thanh long đối chứng.
Kết quả thí nghiệm cho thấy mẫu quả thanh long đƣợc phun chế phẩm nano chitosan và tinh dầu nghệ 0,2% giữ đƣợc vẻ tƣơi và lâu hỏng hơn so với mẫu đối chứng.
3.4.2. Bảo quản thanh long ở nhiệt độ lạnh (10± 2oC)
Mẫu quả thanh long đƣợc đem rửa bằng nƣớc sạch, để ráo nƣớc tự nhiên. Các mẫu quả đƣợc sử dụng làm đối chứng và mẫu quả đƣợc phun chế phẩm nano chitosan 0,2% và tinh dầu nghệ 0,2% đƣợc bảo quản trong ngăn lạnh có nhiệt độ 10 ± 2o
C.
Hình 3.8: Bảo quản thanh long ở nhiệt độ lạnh 10 ± 2oC
51
Bảng 3.6: Kết quả thanh long bảo quản nhiệt độ lạnh 10 ± 2oC
Lô TN 10 ngày 20 ngày 30 ngày
ĐC 100% tƣơi đỏ 50% tai quả héo, ngả vàng.
Còn lại tai quả ngả vàng. Vỏ quả màu thâm nám.
100% tai quả vàng,
héo.Còn lại vỏ quả sạm màu, không còn độ bóng. NCS-TDN 100% tƣơi đỏ 100% tai quả ngả vàng. Vỏ
quả màu đỏ sẫm.
100% tai ngả vàng. Vỏ quả đỏ sẫm, căng. Không có hiện tƣợng hƣ hỏng
Ghi chú: ĐC: đối chứng TN: thí nghiệm
Hình 3.9: Thanh long bảo quản lạnh sau 15 ngày. a) Mẫu đối chứng. b) Mẫu