- 16 S– 1492R : 5’ – ACG GCT ACC TTG TTA CGA CT – 3’
Chương III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Phân lập chủng vi sinh vật từ mẫu tôm Hùm
Tiến hành phân lập trên môi trường TSB : từ 3 mẫu tôm giống phân lập được 46 chủng vi khuẩn .
Bảng 3.1: Chủng vi khuẩn phân lập được
STT Mẫu Ngày phân lập Số chủng phân lập
1 Tôm giống 1 22/02/2012 21 (N1 – N21)
2 Tôm giống 2 09/04/2012 12 (N22 – N33)
3 Tôm giống 3 16/04/2012 13 (N34 – N46)
Hình 3.1: Các chủng vi khuẩn ở nồng độ 10-3
Sau khi nuôi cấy vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng khác nhau trên môi trường TSA, kết quả cho thấy tổng mật độ vi khuẩn hiếu khí là 6,7 x 105 CFU/g, quan sát kết quả thấy xuất hiện 3 dạng khuẩn lạc chính :
- Màu vàng, trơn bóng.
- Màu trắng sữa, trơn bóng.
- Màu trắng sữa, bề mặt nhăn.
Lựa chọn khuẩn lạc riêng rẽ, tiến hành quá trình tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh bacteriocin.
3.2 Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng phân lập
ĐCN9 N4 N9 N4 N1 N200 N10 N16 N12 N13 N3 N18 N14
Để xác định được hoạt tính kháng khuẩn, việc thử nghiệm được tiến hành trên môi tường rắn có chủng chỉ thị Vibrio V1.1 và Bacillus B1.1. Tính đối kháng thể hiện ở việc chủng vi khuẩn khếch tán vào môi trường và gây ức chế sự phát triển của chủng chỉ thị. Vi khuẩn sinh bacteriocin có hoạt tính đối kháng với các chủng chỉ thị càng nhiều thì phổ kháng khuẩn càng rộng.
Hình 3.2: Kết quả của 11 chủng nổi bật đối kháng với chủng Bacillus B1.1 (ĐC : đối chứng là mẫu nước cất)
Kết quả kiểm tra tính kháng khuẩn bằng phương pháp khếch tán đĩa thạch cho thấy sau 24 giờ, vòng kháng xuất hiện xung quanh bề mặt giếng có chủng vi khuẩn thử nghiệm trên đĩa thạch, kích thước của chúng được thể hiện ở bảng 3.2.
Chú thích bảng 3.2 : (-) : Không có hoạt tính kháng khuẩn với chủng chỉ thị
Bảng 3.2 : Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn
STT Chủng vi khuẩn phân lập được Đường kính vùng kháng khuẩn (D, mm)
Vibrio V1.1 Bacillus B1.1 1 N1 - 18 2 N3 - 22 3 N4 19 - 4 N5 13 - 5 N6 9 12 6 N7 13 - 7 N8 10 10 8 N9 - 14 9 N10 19 18 10 N11 - 9 11 N12 20 18 12 N13 - 18 13 N14 - 20 14 N15 - 12 15 N16 12 12 16 N17 8 - 17 N18 14 14 18 N19 - 8 19 N20 - 22 20 N21 15 -
Từ 46 chủng vi khuẩn đã được kiểm tra tính kháng khuẩn, có 20 chủng thể hiện được hoạt tính kháng trong đó có 5 chủng đối kháng cả 2 chủng chỉ thị, có phổ
kháng khuẩn rộng (kháng được cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm) ; 6 chủng có vùng kháng khuẩn ≥18mm với chủng chỉ thị Bacillus B1.1 ; 3 chủng có vùng kháng khuẩn lớn ≥18 mm với chủng chỉ thị Vibrio V1.1.
Qua đó cho thấy rằng các chủng vi khuẩn đối kháng với các chủng chỉ thị nhờ vào các thành phần kháng khuẩn tồn tại trong dịch kháng khuẩn thô. Những thành phần kháng khuẩn mà khi chúng sinh trưởng, phát triển có thể sẽ tạo ra như acid, bacteriocin, CO2, H2O2. Do đó, đến đây chưa khẳng định được các chủng này sinh bacteriocin. Chọn ra 11 chủng nổi bật, ổn định (các chủng trong ô màu ở bảng 3.2) qua các lần thử để kiểm tra tiếp.
3.3 Xác định hoạt tính bacteriocin
Sau khi tuyển chọn được các chủng có hoạt tính kháng khuẩn, để kiểm tra dịch kháng khuẩn có phải là bacteriocin không, ta tiến hành xử lý proteinase K và tripsin. Bacteriocin vốn có bản chất là protein, cũng có thể là hỗn hợp của protein với các chất khác. Vì vậy để kiểm tra bản chất protein, ta sử dụng các enzyme đặc trưng như proteinase K. Ngoài ra thì độ bền enzyme cũng là một dấu hiệu để nhận biết bacteriocin. Mỗi loại bacteriocin có thành phần cấu trúc các aminoacid khác nhau nên sẽ chịu sự phân cắt đặc hiệu của các enzyme khác nhau, thích hợp với nó. Khi bị phân cắt bởi các enzyme này sẽ khiến bacteriocin mất đi hoạt tính kháng khuẩn.
Trước khi thực hiện quá trình thử nghiệm, tiến hành thử với enzyme catalase để loại bỏ khả năng sinh H2O2. Kết quả sau khi thử nghiệm, tuyển chọn được chủng N14 bị bất hoạt sau khi xử lý với các enzyme proteinase K và tripsin. Do các peptide kháng khuẩn trong dịch đã bị phân hủy bởi enzyme nên không thể kháng lại chủng chỉ thị được nữa, hay không thể tạo vòng kháng với B1.1.
B1.1 N14
Proteinase K
Trypsin (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ĐC
Hình 3.3 : Thử nghiệm với enzyme proteinase K và tripsin
Các chủng khác cho kết quả thử nghiệm là không có vòng kháng sau khi xử lý proteinase K nhưng lại có vòng kháng sau khi xử lý enzyme tripsin. Do đó, chưa thể xác định được dịch kháng khuẩn có phải là dịch bacteriocin thô hay không. 3.4 Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn
Nuôi cấy chủng được tuyển chọn trên môi trường thạch TSA quan sát hình thái khuẩn lạc của chủng tuyển chọn N14 để phục vụ cho việc định danh sau này. Kết quả thể hiện như sau :
- Hình thái khuẩn lạc : Khuẩn lạc tròn, màu trắng sữa, trơn, hơi lồi lên trên bề mặt thạch, bờ đều.
Hình 3.4 : Hình thái khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn N14