6.1 Nguyên tắc:
Acid benzoic trong thực phẩm được chiết và pha loãng bằng nước cất, trong trường hợp cần thiết mẫu sẽ được làm sạch với dung dịch Carrezz. Acid Benzoic sau đó được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV ở bước sóng 226 nm.
6.2 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất:Thiết bị: Thiết bị: - Máy HPCL Dụng cụ: - Bình định mức 25ml. 50ml, 100ml - Cốc thuỷ tinh 50ml, 100ml, 200ml
- Pipet bầu 1ml, 2ml, 5ml, 10ml
- Quả bóp cao su
- Bình tia
Hoá chất:
- Acetonitile: loại dùng cho HPLC.
- H3PO4 0.05%: loại dùng cho HPLC
- Methanol: loại dùng cho HPLC.
- Dung dịch Acid benzoic chuẩn 1000ppm.
- Nước cất 1 lần, 2 lần.
6.3 Cách tiến hành:
Chuẩn bị mẫu:
Do hạn chế về thời gian nên không thể chuẩn bĩ mẫu để thực hành phương pháp HPLC, giáo viên hướng dẫn đã cho thao tác bằng dung dịch chuẩn với mục đích làm quen và giới thiệu về nguyên lý hoạt động cũng như cấu tạo của máy HPLC.
Xây dựng đường chuẩn:
Từ dung dịch Acid benzoic chuẩn 1000ppm pha dãy chuẩn có nồng độ như sau: 0; 0.2; 0.5; 1; 2; 5ppm.
- Hút 0.5ml (1000ppm) => bình định mức 50ml => 10ppm - Hút 25ml (10ppm) => bình định mức 50ml => 5ppm Nồng độ 2ppm: - Hút 10ml (10ppm) => bình định mức 50ml => 2ppm Nồng độ 1ppm: - Hút 5ml (10ppm) => bình định mức 50ml => 1ppm Nồng độ 0.5ppm: - Hút 2.5ml (10ppm) => bình định mức 50ml => 0.5 ppm Nồng độ 0.2ppm: - Hút 1ml (10ppm) => bình định mức 50ml => 0.2ppm Nồng độ 0ppm:
- Không cần hút dung dịch chuẩn, định mức tới vạch bằng nước cất. Sau khi pha xong dãy chuẩn có nồng độ 0; 0.2; 0.5; 1; 2; 5ppm, tiêm mẫu vào các vial đã chuẩn bị sẵn chuẩn bị nước cất 2 lần và các hóa chất chuyên dùng cho HPCL mang đi phân tích ở λ = 226nm.
- Cột: C18 (150mm × 4,6mm × 5µm)
- Pha động: H3PO4 0.05% và Acetonitile (60:40)
- Detector (đầu dò PDA) λ = 226nm cho Acid benzoic
- Tốc độ dòng: 1ml/phút (tốc độ dòng cao thì dung dịch sẽ đi nhanh và có thể làm hư cột)
- Nhiệt độ cột: ~30oC
- Thể tích tiêm mẫu: 20µl.
- Thời gian chạy mẫu: 6 phút Bình định mức 50ml 0 1 2 3 4 5 Cbenzoic (ppm) 0 0.2 0.5 1 2 5 mAbs 0 5.069 5.016 4.976 4.924 4.862 Diện tích peak 0 178.73540 421.1557 6 790.1550 9 1709.0103 8 4067.1318 4 % diện tích peak 0 43.4170 62.3405 80.1054 87.7340 94.7879
Từ kết quả mAbs và diện tích peak đã chạy mẫu được, vẽ phương trình hồi qui tuyến tính thể hiện mối tương quan giữa nồng độ và diện tích peak.
6.4 Nguyên tắc hoạt động của HPCL:
Tiêm mẫu vào các vial sau đó đặt vào bộ phận lấy mẫu tự động (auto simple), cài đặt các thông số mà hệ thống yêu cầu như pha động (H3PO4
0.05% và Acetonitile tỉ lệ 60:40), Detector (λ = 226nm cho Acid benzoic), tốc độ dòng (1ml/phút), nhiệt độ cột (~30oC), thể tích tiêm mẫu (20µl), thời gian chạy mẫu (6 phút). Khi bắt đầu chạy mẫu, hệ thống tự tiêm mẫu sẽ gắp vial đến vị trí lấy mẫu, dùng kim tiêm hút lầy đúng lượng mẫu đã cài đặt và đưa sang pha động, ở pha động đã chuẩn bị sẵn H3PO4 0.05% và Acetonitile tỉ lệ 60:40 được lọc qua ray 0.25µm, sau đó qua bộ loại khí chân không và cuối cùng được bơm cùng với mẫu qua cột và bắt đầu quá trình rửa giãi. Kết thúc quá trình phân tích dùng nước cất và dung mỗi để rửa cột.
6.5 Nhận xét: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
RSDmẫu 4 = 100%